CN102719544A - 鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法。该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该核酸分子探针为ZMF：5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`和ZMR：5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`。其方法为是采用上述核酸分子探针ZMF和ZMR作为PCR引物，利用PCR方法鉴定致命鹅膏，具体步骤按常规PCR方法进行。本发明以ZMF和ZMR作为引物，以致命鹅膏的基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行PCR，扩增到特异性片段。经实验发现，仅致命鹅膏能够扩增到特异性片段，而其他鹅膏样品，如灰花纹鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、土红粉盖鹅膏、欧式鹅膏和大白菇Russula delica都没有扩增到任何片段，这表明本发明的核酸分子探针ZMF和ZMR具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别致命鹅膏。
Description
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法检测一种常见毒蘑菇的技术领域，具体涉及一种用于鉴别致命鹅膏（Amanita exitialis）的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法
背景技术：
鹅膏属（Amanita）是世界性分布的大属，隶属于真菌界、担子菌门、担子菌纲、蘑菇目、鹅膏科。据《真菌学词典》第十版(2008)记载，全世界鹅膏属种类已达500种，中国已知种类近100种（杨祝良，2005），它们的一些种类如产于东亚的致命鹅膏（A.exitialis）、灰花纹鹅膏（A.fuliginea）等都属于剧毒蘑菇种类。成年人若误食致命鹅膏或灰花纹鹅膏的一个子实体，不及时抢救，就足以致命(陈作红等,2003)。目前，误食毒蘑菇致死是我国食物中毒致死的主要原因，蘑菇中毒的死亡率高达43.80%，是目前死亡率最高的严重突发公共卫生事件(2007)。因此，快速、准确的鉴别致命鹅膏的方法对于抢救误食致命鹅膏的患者具有重要的意义。
随着分子生物学技术的快速发展以及计算机辅助分析技术的诞生，真菌的快速检测已成为可能。目前常用的检测方法主要有RAPD、RFLP、ap-PCR、rDNA序列分析和特异性引物的PCR检测等。真菌的ITS序列是核糖体DNA上的一个非编码区域，受外界环境因素的影响较小，进化速度快，因而可以提供较为丰富的信息位点。利用真菌rDNA-ITS序列在属、种水平上的差异，设计特异性引物，进行真菌物种的鉴定、检测，已经成为国际上广泛使用的分子生物学方法。目前，已有用于鉴别部分真菌的核苷酸特征序列获得专利，但尚未发现专一性鉴别致命鹅膏的核苷酸序列专利。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供了一种利用分子生物学手段，获得鉴别致命鹅膏（A.exitialis）的特征性核苷酸序列。
本发明用于鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列来源于致命鹅膏的核糖体rDNA内转录间隔区ITS1、ITS2和它们之间的5.8S rDNA基因，具体序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种基于致命鹅膏的特征性核苷酸序列（SEQ ID NO.1）设计的用于鉴别致命鹅膏的核酸分子探针，该核酸分子探针序列如下：
ZMF：5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`；
ZMR：5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`。
上述核酸分子探针序列ZMF和ZMR，它们的退火温度相近，均不能形成引物二聚体，具有极高的专一性，仅与致命鹅膏发生反应，而不与其他鹅膏反应。利用该探针通过PCR扩增可以快速的对致命鹅膏（菌丝体、子实体）进行鉴别。
本发明的第三个目的是提供一种致命鹅膏快速鉴定试剂盒，包括上述核酸分子探针ZMF和ZMR，以及常规的DNA提取试剂和常规的PCR反应试剂。
所述的致命鹅膏快速鉴定试剂盒优选还包括真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`。该通用引物可以作为鉴定致命鹅膏的阳性对照。
本发明的第四个目的是提供一种鉴别致命鹅膏的方法。本方法是采用上述核酸分子探针ZMF和ZMR作为特异性扩增引物，以致命鹅膏基因组DNA为模板，经PCR扩增，电泳检测，获得清晰的致命鹅膏特异性条带，实现对致命鹅膏的鉴别。
优选，利用ITS1和ITS4作为PCR引物，以致命鹅膏的基因组DNA作为模板进行常规的PCR，以作为阳性对照。
本发明基于鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列（SEQ ID NO.1）设计了特异性的核酸分子探针ZMF和ZMR，并以该核酸分子探针为引物，以致命鹅膏的基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行扩增，获得的DNA片段，经测序其具体序列如SEQ ID NO.1的第124~524位碱基所示，长度为401bp。利用本发明的核酸分子探针ZMF和ZMR进行PCR扩增，仅致命鹅膏能够扩增获得该特异性片段，而其他样品没有扩增到任何片段（如图3），这表明本发明的核酸分子探针ZMF和ZMR具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别致命鹅膏（子实体和菌丝体）。
本发明采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅20mg就足够，方法简单，特异性好，用时短，半日即可完成。
附图说明：
图1是本发明所述的致命鹅膏的特征性核苷酸序列及对致命鹅膏专一性核酸分子探针ZMF和ZMR的位置图，左侧为5`端，右侧为3`端，其中黑色部分为专一性核酸分子探针ZMF和ZMR扩增的片断大小及位置；
图2是利用ITS1和ITS4作为引物按照常规的PCR方法对不同鹅膏样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、灰花纹鹅膏，2、致命鹅膏，3、黄盖鹅膏白色变种，4、土红粉盖鹅膏，5、欧式鹅膏，6、大白菇Russula delica（外型与致命鹅膏近似，可食用），M为2Kb的DNA分子量标准。
图3是利用本发明的核酸分子探针ZMF和ZMR作为引物按照常规的PCR方法对不同鹅膏样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、灰花纹鹅膏，2、致命鹅膏，3、黄盖鹅膏白色变种，4、土红粉盖鹅膏，5、欧式鹅膏，6、大白菇Russula delica（外型与致命鹅膏近似，可食用），M为2Kb的DNA分子量标准。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
致命鹅膏基因组DNA的提取和ITS rDNA基因的获得
取20mg致命鹅膏样品置于无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，加入2%(w/v)CTAB抽提缓冲液600μl，其中含有2%的SDS，继续研磨几秒后倒入1.5ml微量离心管中，65℃水浴保温1h。冷却至室温后，向1.5ml含有样品的微量离心管中加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀2min，12000rpm离心15min，用200μ1移液器将上清液转入新的离心管中，弃沉淀。上清液中加入与之等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀2min，12000rpm离心15min，用200μl的微量移液器将含有DNA的上层(水相)小心地移入一只新管中，如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽提有机相1-2次，合并水相。将最终的上清液用200μ1的微量移液器小心转入一只新离心管中。往上清液(DNA溶液)中加入1/10体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠，用手指轻弹离心管壁几次使之混匀。加入与DNA溶液(含盐溶液)等体积的异丙醇（-4℃预冷）轻轻混匀，于-4℃静置2h。12000rpm离心15min，弃上清液，用体积分数75%乙醇水溶液洗涤沉淀物两次。室温下自然晾干。自然干燥后加入20μl无菌的超纯水重悬，选用DNA纯化试剂盒（东盛生物科技有限公司的基因组纯化试剂盒，其货号为：N1091）纯化重悬的DNA，而获得致命鹅膏的基因组DNA。灰花纹鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、土红粉盖鹅膏、欧式鹅膏和大白菇Russula delica的基因组DNA参照上述方法提取。
取真菌ITS rDNA通用引物ITS1和ITS4，ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系为25μL总体积，ddH2O12.8μL，10倍缓冲液（Mg2+）8μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，ITS1（10μmol/L）0.5μL，ITS4（10μmol/L）0.5μL，HotStart Taq（5u/μL）0.2μL，模板DNA（灰花纹鹅膏、致命鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、土红粉盖鹅膏、欧式鹅膏或大白菇Russula delica的基因组DNA）1μL。反应程序为94℃5min预变性；94℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃8min。致命鹅膏的PCR产物送北京华大基因测序，获得ITS rDNA基因序列，致命鹅膏的ITS rDNA序列如SEQ ID NO.1和图1所示，电泳图如图2所示。由图2可以看出，利用通用引物ITS1和ITS4可以从灰花纹鹅膏、致命鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、土红粉盖鹅膏、欧式鹅膏和大白菇Russula delica的基因组DNA中扩增出序列。
实施例2：致命鹅膏特异性引物的PCR扩增
根据致命鹅膏ITS rDNA基因序列设计特异性引物ZMF和ZMR，ZMF：5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`和ZMR：5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以基因组DNA为模板，反应体系为25μL总体积：ddH2O12.8μL，10倍缓冲液（Mg2+）8μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，ZMF（10μmol/L）0.5μL，ZMR（10μmol/L）0.5μL，HotStart Taq（5u/μL）0.2μL，模板DNA（灰花纹鹅膏、致命鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、土红粉盖鹅膏、欧式鹅膏或大白菇Russula delica的基因组DNA）1μL。反应程序为94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃8min。电泳检测PCR结果，电泳图如图3所示，从图3可以看出，仅致命鹅膏能够扩增出特异性片段，而灰花纹鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、土红粉盖鹅膏、欧式鹅膏和大白菇Russula delica没有扩增出任何片段，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的专一性，特异性好，因此可以用于快速的鉴别致命鹅膏。将致命鹅膏的特异性片段送去测序，其序列如SEQ ID NO.1的第124~524位碱基所示，其长度为401bp。
Claims (6)
1.一种用于鉴别致命鹅膏（Amanita exitialis）的特征性核苷酸序列，其特征在于，该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于鉴别致命鹅膏的核酸分子探针，其特征在于，该核酸分子探针为：
ZMF：5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`；
ZMR：5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`。
3.一种致命鹅膏快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸分子探针序列ZMF和ZMR，以及常规的DNA提取试剂和常规的PCR反应试剂。
4.根据权利要求3所述的致命鹅膏快速鉴定试剂盒，其特征在于，还包括真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`。
5.一种鉴别致命鹅膏的方法，其特征在于，是采用权利要求2所述的核酸分子探针ZMF和ZMR作为PCR引物，利用PCR方法鉴定致命鹅膏，具体步骤按常规PCR方法进行。
6.根据权利要求5所述的鉴别致命鹅膏的方法，其特征在于，还利用ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`作为PCR引物，以致命鹅膏的基因组DNA作为模板进行常规的PCR，以作为阳性对照。
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| 《微生物学报》 20031004 胡劲松等 我国鹅膏菌新发现种__致命鹅膏(Amanita exitialis)的肽类毒素分析 第642-646页 1-6 第43卷, 第05期 * |
| ZHANG,P. ET AL.: "AY855212.1", 《GENBANK》 * |
| 戴沩田等: "中国几种剧毒鹅膏菌的ITS序列分析 ", 《生命科学研究》 * |
| 戴沩田等: "中国几种剧毒鹅膏菌的ITS序列分析", 《生命科学研究》, vol. 10, no. 3, 25 October 2006 (2006-10-25), pages 110 - 113 * |
| 胡劲松等: "我国鹅膏菌新发现种――致命鹅膏(Amanita exitialis)的肽类毒素分析 ", 《微生物学报》 * |
| 胡劲松等: "我国鹅膏菌新发现种――致命鹅膏(Amanita exitialis)的肽类毒素分析", 《微生物学报》, vol. 43, no. 05, 4 October 2003 (2003-10-04), pages 642 - 646 * |
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|---|---|---|---|---|
| CN109576391A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-05 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法 |
| CN109576391B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-02-25 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法 |
| CN111575397A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-08-25 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种基于dna微条形码技术的有毒鹅膏菌物种鉴定方法及应用 |
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| CN116042892A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-05-02 | 上海市农业科学院 | 一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法 |
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| CN116287395A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-06-23 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于对有毒蘑菇进行分子鉴定的试剂盒和方法 |
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| CN116287395B (zh) * | 2023-02-07 | 2023-11-10 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于对有毒蘑菇进行分子鉴定的试剂盒和方法 |
| CN116640876A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-08-25 | 吉林农业大学 | 用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman-MGB探针与引物及其应用 |
| CN116640876B (zh) * | 2023-06-20 | 2023-12-08 | 吉林农业大学 | 用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman-MGB探针与引物及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102719544B (zh) | 2013-07-31 |
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