KR101378161B1 - 영지버섯의 분자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 영지버섯의 특이적 판별방법 - Google Patents

영지버섯의 분자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 영지버섯의 특이적 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 특이적 판별에 관한 것으로 더욱 상세하게는 영지버섯의 유전체에 존재하는 특정 분자 마커, 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 영지버섯을 특이적으로 판별하는 방법에 관한 것이다.

Description

영지버섯의 분자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 영지버섯의 특이적 판별방법{DNA markers for Ganoderma lucidum, primers for the markers, and method for discriminating Ganoderma lucidum}
본 발명은 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 특이적 판별에 관한 것으로 더욱 상세하게는 영지버섯의 유전체에 존재하는 특정 분자 마커, 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 영지버섯을 특이적으로 판별하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 영지버섯은 불로초속에 속하는 1년생 버섯으로 모양은 계통에 따라 다양하게 변화한다. 육질은 코르크 질 같고 표면은 니스를 칠한 것 같은 광택이 있으며 주로 활엽수 고사목과 그루터기에 자생하며 북반구 온대 이북에 광범위하게 분포하고 있다. 영지버섯은 우리나라는 물론 중국, 일본 등지에서 귀한 약제로 이용되어 왔으며 영지, 불로초, 만년 버섯 등의 여러 이름으로 불려왔다.
현재 불로초속 균류들이 여러 분류학자들에 다수 보고되어 왔으나 형태분류학자들간에 의견이 일치하지 않아 다소 혼란이 있다. 특히 형태학적 분류에 대한 문제점들이 지적되고 있으며 이러한 문제점을 해결 및 보완하고자 생화학적 및 분자생물학적 방법을 이용하여 분류에 새로운 해석 방법을 모색하고 있다.
현재, 우리나라에서는 수입되는 영지버섯은 대부분 건조 형태로 중국, 북한, 일본 등에서 수입되고 있으며 특히, 중국에서 영지버섯이 가장 많이 수입되고 있다. 수입되고 있는 영지버섯은 형태학적으로 품종판별에 한계가 있으며 분말형태일 경우 더욱이 품종판별에 어려움이 있다. 우리나라에서는 영지 1호, 영지 2호, 건영 1호, 장생녹각이 영지버섯품종으로 등록되어 공식적으로 인정되고 있으며, 이들과 유사한 계통의 영지버섯을 선별하여 수입할 뿐만 아니라 우수한 영지버섯품종을 보존 · 육종하고 개발하는 것이 필요하다.
관련 특허로 대한민국 특허공개번호 제1020110086265호는 '느타리버섯 원형 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도'에 관한 것으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 느타리 품종 중 원형 계통을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 느타리 품종 중 원형 계통을 판별하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 느타리 품종 중 원형 계통을 판별하는 방법에 관한 것이 기재되어 있으며,
다른 관련 특허로 대한민국 특허공개번호 제1020110086264는 '느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도 '에 관한 것으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 서열 번호 1의 염기서열을 포함하는 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 분자 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1의 염기 서열에 대하여 특이적인 한 쌍의 프라이머를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1의 서열에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머를 이용한 PCR분석에 의해 영지버섯(Ganoderma lucidum)을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열 번호 1의 염기서열을 포함하는 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 분자 마커용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 한 쌍의 프라이머 세트를 제공한다.
또 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 한 쌍의 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 영지버섯(Ganoderma lucidum) 판별용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 영지버섯 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 버섯에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 영지버섯을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 산물은 559-bp의 크기를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 증폭은 94℃ 15초, 56℃ 15초, 72℃ 30초로 25회 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 선별된 영지버섯품종의 유전자원 확보 및 보존, 우수 영지품종에 대한 육종개발, 영지버섯의 종 판별을 위해, 다양한 생물 종내 및 종간의 유전적 다양성 분석에 광범위하게 이용된 URP1(Universal Rice Primer) Primer(5'ATCCAAGGTCCGAGACAACC-3'를 이용한 RAPD(random amplification of polymorphic DNA)분석을 수행하고 Ganoderma lucidum 에 특이적인 증폭산물을 클로닝 및 염기서열분석을 수행한 후 특이적 프라이머를 제작하였다. 이러한 연구를 바탕으로 최종 1종의 분자 마커를 선발하고 이에 대한 특이적 프라이머를 개발하여 이를 이용한 PCR분석을 통한 영지버섯의 판별방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 각각 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 분자 마커를 제공한다.
이 분자 마커는 URP1 primer를 이용한 RAPD(random amplification of polymorphic DNA) 분석으로 영지버섯에 대하여 특이적으로 증폭되는 산물에 대한 클로닝 및 염기서열분석을 통한 연구결과를 바탕으로 선발된 것이다 (서열 번호 1).
다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1의 염기 서열에 대하여 특이적인 한 쌍의 프라이머를 제공한다.
서열 번호 1의 염기 서열에 대해 특이적인 프라이머는 하기와 같다.
KGSMF : 5'CCCTAAACCTCTCAAAGTCA-3'(서열 번호 2)
KGSMR : 5'TATCGTACAGGTTCTCGTG -3'(서열 번호 3)
서열 번호 2와 3의 프라이머쌍은 서열 번호 1의 염기 서열을 주형으로 PCR분석에 의해 559-bp의 증폭산물이 얻어지도록 한다.
상기 프라이머들은 당업계에 공지된 합성 기술에 의해 얻을 수 있다.
다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1의 서열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해 영지버섯(Ganoderma lucidum)을 특이적으로 판별하는 방법을 제공한다.
본 방법은 i) 영지버섯 균사체 시료를 준비하고 genomic DNA를 추출하는 단계, ii) 서열 번호 2와 3로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 이용하여 시료에서 PCR을 진행하는 단계, 및 iii) 전기영동에 의해 PCR 생성물을 확인하는 단계를 포함한다.
PCR은 당업계에 공지된 PCR 기법에 의해 수행될 수 있다.
본 방법에 따라 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 생성물을 확인하여, 이용된 프라이머쌍에 의해 증폭된 559bp의 PCR 산물이 확인될 경우, 영지버섯 (Ganoderma lucidum)의 판별이 가능하다.
영지버섯 (Ganoderma lucidum)은 흔히 불로초라 불리며, 민주름버섯목 (Aphyllophorales) 불로초과 (Ganodermataceae) 불로초속 (Ganoderma)에 속하는 버섯이다. 영지버섯은 항암활성 이외의 많은 약리작용을 가지고 있다고 알려지고 있기 때문에, 이들에 대한 약리효과 성분의 과학적인 연구가 활발히 이루어지고 있다. 영지버섯은 자실체의 형태, 색택 및 포자문의 색 등 의 차이에 의해 적지(赤芝),　흑지(黑芝),　황지(黃芝),　자지(紫芝),　청지(菁芝), 백지(白芝)의　6종으로 분류하고 있으나 근래에 와서는 분류학적으로 60여종이 있다고 알려져 있다. 또한 Ganoderma 속(genus)에 속하는 잔나비 불로초 (Ganoderma applanatum), 자흑색불로초 (Ganoderma neo -japonicum), 쓰가불로초 (Ganoderma tsugae) 등도 알려져 있다. 현재까지 약리효과에 관한 연구에 이용되었던 대부분의 영지버섯은 정확한 분류를 거치지 않고 연구가 이루어져 왔다. 이것은 형태적인 차이를 근거로 하여 계통을 분류하는 종래의 방법으로는 정확한 분류가 이루어 지기 어려운 실정이기 때문이다. 영지버섯의 분류에는 채집시기, 장소, 자실체 형태 등의 형태적인 차이뿐 아니라 이에 대한 유전적인 차이도 고려 되야 한다. 결과적으로 영지버섯에 대한 포괄적인 약리효과를 언급하는 것은 가능하나, Ganoderma 속(genus)에 포함되는 Ganoderma 종 (species) 들에 대한 특성이나 약효를 동일시 하기는 어렵다.
현재 국내에 수입되고 있는 영지버섯은 주로 건조 형태로 연간 약 10억 원정도 이며 주로 중국에서 수입되고 있다. 국내에서는 영지 1호(Ganoderma lucidum), 영지 2호 (Ganoderma lucidum), 건영 1호 (Ganoderma species), 장생녹각 (Ganoderma species)이 공식적인 영지버섯품종으로 등록되어 있으며 효능 또한 검정되어 있다.
본 발명에 의해 개발된 분자 마커를 이용함으로써 분자생물학적인 분석방법에 의해 국내 등록품종인 영지1호, 영지2호, 건영1호, 장생녹각을 포함한 Ganoderma lucidum 종을 정확히 판별할 수 있으며, 이를 통한 수입산 영지 버섯의 품질관리 또한 가능할 것으로 사료된다. 또한, 본 발명에 의해 개발된 분자마커를 이용함으로써 우리나라 고유의 우수한 영지버섯품종 육종, 개발 및 유전자원 보존이 가능할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 영지버섯의 URP1 primer를 이용한 RAPD(random amplification of polymorphic DNA)분석을 수행한 사진임. M, marker; 1kb,1kilo base, 631-bp, 영지버섯 특이증폭 밴드, Ganoderma lucidum , 영지버섯 ; Ganoderma species , 불로초속이지만 종이 밝혀 지지 않음.
도 2는 RAPD분석에 의해 분리된 영지버섯의 특이증폭 산물의 염기서열임.
도 3은 영지버섯의 RAPD 분석에 의해 분리된 특이 DNA단편 부위에서 제작된 프라이머임.
도 4는 불로초속 18종 59 균주와 대조균주 (laetiporus 속 1종 1균주)를 제작된 판별 특이 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행한 사진임. M, marker; 1kb,1kilo base, 559-bp, 영지버섯 특이증폭 밴드, Ganoderma lucidum , 영지버섯 ; Ganoderma species , 불로초속이지만 종이 밝혀 지지 않음.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기의 실시 예에서 특별히 언급되지 아니한 분자생물학적 실험기법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989)을 참조하였다.
실시예 1. 영지버섯 균사체의 배양
수집된 영지버섯 균사체를 Potato Dextrose Broth (Difco, Becton Dickinson; 0.8% Potato starch, 4% Dextrose) 액체 배지에 접종하여 30℃ 인큐베이터에서 3주일간 정치 배양하였다. PCR 분석에 사용된 균주는 표 1에 정리하였다.
NO . Species Collection sites Collection ID Origin
1 Ganoderma annulare Korean Collection for Type Culture KCTC16803 Brazil
2 Ganoderma applanatum The American Type Culture Collection ATCC44053 Japan
3 Ganoderma applanatum incheon University IUM-3985 Netherlands
4 Ganoderma carnosum The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 516.96 Netherlands
5 Ganoderma curtisii The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 100132 Netherlands
6 Ganoderma lobatum The American Type Culture Collection ATCC 42985 Canada
7 Ganoderma lobatum Mushroom Division at RDA ASI-7061 U.S.A
8 Ganoderma lucidum (영지 1호) Mushroom Division at RDA ASI-7004 Korea
9 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7013 Korea
10 Ganoderma lucidum (영지 2호) Mushroom Division at RDA ASI-7071 Korea
11 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7074 Korea
12 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7091 Korea
13 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7094 Korea
14 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7135 Korea
15 Ganoderma lucidum incheon University IUM-0047 Korea
16 Ganoderma lucidum incheon University IUM-0757 Korea
17 Ganoderma lucidum incheon University IUM-0938 Korea
18 Ganoderma lucidum incheon University IUM-3986 Korea
19 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4002 Korea
20 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4100 Korea
21 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7117 unknown
22 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4303 Bangladesh
23 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4304 Bangladesh
24 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4310 Bangladesh
25 Ganoderma lucidum The American Type Culture Collection ATCC46755 Canada
26 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4242 China
27 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7037 Papuanewguinea
28 Ganoderma lucidum The American Type Culture Collection ATCC 64251 Taiwan
29 Ganoderma lucidum Korean Collection for Type Culture KCTC 16802 Thailand
30 Ganoderma meredithae The American Type Culture Collection ATCC 64492 U.S.A
31 Ganoderma meredithae Mushroom Division at RDA ASI-7140 unknown
32 Ganoderma mirabile The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 218.36 Philippines
33 Ganoderma neo - japonicum Mushroom Division at RDA ASI-7032 unknown
34 Ganoderma oregonense Mushroom Division at RDA ASI-7049 U.S.A
35 Ganoderma oregonense Mushroom Division at RDA ASI-7062 U.S.A
36 Ganoderma oregonense Mushroom Division at RDA ASI-7063 U.S.A
37 Ganoderma oregonense Mushroom Division at RDA ASI-7067 U.S.A
38 Ganoderma pfeifferi The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 747.84 Netherlands
39 Ganoderma resinaceum The American Type Culture Collection ATCC 52416 Argentina
40 Ganoderma resinaceum The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 152.27 UK
41 Ganoderma resinaceum The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 220.36 U.S.A
42 Ganoderma resinaceum Mushroom Division at RDA ASI-7142 unknown
43 Ganoderma resinaceum Mushroom Division at RDA ASI-7143 unknown
44 Ganoderma resinaceum incheon Univercity IUM-3651 Czech
45 Ganoderma subamboinense var . laecisporum The American Type Culture Collection ATCC52420 Argentina
46 Ganoderma Species Konkuk University KU-4033 Korea
47 Ganoderma Species Konkuk University KU-4035 Korea
48 Ganoderma Species Mushroom Division at RDA ASI-7033 Papuanewguinea
49 Ganoderma Species Mushroom Division at RDA ASI-7034 Papuanewguinea
50 Ganoderma Species Mushroom Division at RDA ASI-7038 Papuanewguinea
51 Ganoderma Species (장생녹각) Mushroom Division at RDA ASI-7146 unknown
52 Ganoderma Species Mushroom Division at RDA ASI-7150 unknown
53 Ganoderma Species Mushroom Division at RDA ASI-7151 unknown
54 Ganoderma Species (건영) Mushroom Division at RDA ASI-7152 unknown
55 Ganoderma tsugae The American Type Culture Collection ATCC 64795 Canada
56 Ganoderma tsugae Mushroom Division at RDA ASI-7064 U.S.A
57 Ganoderma tornatum The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 109679 Netherlands
58 Ganoderma valesiacum The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 428.84 U.S.A
59 Ganoderma webeianum The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 219.36 Philippines
60 laetiporus persicinus The Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS 274.92 Netherlands
실시예 2. 영지버섯 균사체로부터 Genomic DNA 추출
영지버섯 균사체에 액체질소를 넣고 마쇄한 다음 적당량 취하여 500μl의 extraction buffer (200mM Tris-HCl(PH8.0), 200mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS)와 Proteinase K(20mg/ml) 10μl넣고 50℃에서 1시간 반응하였다. 250μl의 2X CTAB(2% CTAB, 100mM Tris-HCl(PH8.0), 5% SDS)을 첨가한 후 500μl의 Phenol : Chloroform : isoamylalcohol (25:24:1)을 첨가하여 12,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 그 상등액만 550μl 취하여 새로운 1.5ml 튜브에 옮긴 후 상등액 0.6 volume의 이소프로판올 (Isopropanol) 과 1/30 volume의 3M Sodium acetate (PH 5.2)를 첨가한 후 실온에서 충분히 반응시키고 12,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 침전된 DNA 팰릿을 70%에탄올로 세척하고 60μl TE buffer(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM; PH 8.0)에 녹인 후 6μl RNase (25mg/ml)를 첨가하여 37℃에 30분 반응하였다. Genomic DNA는 100ng/μl로 농도를 보정하여 PCR을 수행하였다.
실시예 3. 영지버섯 검출 및 판별을 위한 특이적 프라이머 제작
영지버섯의 판별을 위한 PCR 분석용 특이 프라이머 제작을 위해 URP1 primer를 이용한 RAPD(random amplification of polymorphic DNA)분석을 수행하였다 (도 1). PCR증폭반응은 다카라 써멀싸이클러(TaKaRa thermalcycler) (TaKaRa, Japan)를 사용하여 실시하였으며, 반응은 프로-핫 스타트(Pro-Hot Start) PCR 마스터 믹스(Master Mix)(TNT research, Korea)에 0.5μl URP1 프라이머(500ng/μl)와 각각의 genomic DNA 1μl (100ng)를 첨가하고 총량이 20μl가 되게 하여 수행하였다. PCR 반응은 94℃ 1분, 55℃ 1분,72℃ 2분으로 30회 반응하였다.반응 후 PCR 증폭산물은 1.2% 농도의 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티듐 브로마이드에 착색시켜 UV상에서 확인하였다. 그 결과 본 발명에 사용된 Ganoderma lucidum중 (표 1) 한국, 방글라데시, 파푸아뉴기니, 그리고 태국 유래 G. lucidum은 증폭양상이 동일하거나 유사함을 보였다. 또한 Ganodrma 속 (genus)이지만 그 종 (species)이 규정되지 않은 2종의 Ganoderma species (47, 50번; 표 1)와 우리나라에서 영지버섯품종으로 현재 등록되어 있지만 종 (species)이 확실히 규정되지 않은 장생녹각과 건영 (51, 54 번; 표 1)이 영지버섯의 증폭양상과 동일하거나 유사하였다. 그러나, Ganoderma lucidum중 캐나다, 중국, 그리고 대만 유래 Ganoderma lucidum은 (25, 26, 28번; 표 1)은 전술된 Ganoderma lucidum과는 전혀 다른 증폭양상을 나타내어 그 분류가 잘못되었을 것으로 사료된다. 또한, 도 1의 결과를 바탕으로 G. lucidum에 특이적인 증폭단편 (631-bp) 을 클로닝하여 염기서열분석에 의해 G. lucidum 특이 단편의 염기서열을 확보하고 (도 2), 이를 바탕으로 G. lucidum 에 대한 특이적 판별을 위한 PCR분석용 프라이머 1쌍을 제작하였다 (도 3).
실시예 4. 영지버섯 판별용 특이적 프라이머를 이용한 PCR
실시예 1에서 배양된 Ganoderma속 18종 59 균주와 대조균주(laetiporus속 1종 1균주)를 실시예 3에서 제작된 특이 프라이머를 사용하여 PCR을 수행 하였다. PCR증폭반응은 다카라 써멀싸이클러(TaKaRa thermalcycler) (TaKaRa, Japan)를 사용하여 실시하였으며, 반응은 각각의 genomic DNA 2μl(200ng)와 10pmole의 KGSM1-F, KGSM1-R프라이머 각 0.5 μl, 2.5dNTP 0.5μl, 25mM MgCl2 2μl, 5x Buffer (10mM Tris-Cl(PH8.3), 50mM KCl, 0.25mM MgCl2) 5μl, Taq polymerase(Promega, USA) 0.25μl을 첨가한 후 멸균증류수(DDW)를 이용하여 전체 양을 25μl로 보정하여 PCR반응을 수행하였다. PCR 반응은 94℃ 15초, 56℃ 15초, 72℃ 30초로 25회 반응하였다. 반응 후 PCR 증폭산물은 1.2% 농도의 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티듐 브로마이드에 착색시켜 UV상에서 확인하였다. 본 발명에 의해 개발된 Ganoderma lucidum 특이 DNA 마커 유래 프라이머를 이용하여 Ganoderma 속 18종 59 균주와 대조균주 (laetiporus속 1종 1균주)에 대한 PCR 분석을 수행한 결과, 우리나라에서 영지버섯품종으로 등록되어 있는 영지 1호, 영지 2호, 건영 1호, 그리고 장생녹각 (8, 10, 54, 51번; 표 1)을 포함하여 Ganoderma lucidum 종에서만 559-bp의 증폭산물을 확인할 수 있었다. 그러나, 실시예 3에 전술된 바와 같이 캐나다, 중국, 그리고 대만 유래 Ganoderma lucidum 에서는 559-bp의 증폭 산물을 확인할 수 없었다 (도 4).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열 번호 1의 염기서열을 유효성분으로 포함하는 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 분자 마커용 조성물.
  2. 삭제
  3. 서열번호 2 및 서열번호 3의 한 쌍의 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 영지버섯(Ganoderma lucidum) 판별용 조성물.
  4. 서열번호 2 및 서열번호 3의 한 쌍의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 영지버섯 판별용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  6. 버섯에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 서열번호 3의 한 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 영지버섯을 판별하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물은 559-bp의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 증폭은 94℃ 15초, 56℃ 15초, 72℃ 30초로 25회 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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