KR101615433B1 - 녹각형 영지버섯 판별용 snp 마커, 및 이를 이용한 녹각형 영지버섯의 판별방법 - Google Patents

녹각형 영지버섯 판별용 snp 마커, 및 이를 이용한 녹각형 영지버섯의 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 영지버섯 (Ganoderma lucidum)의 유전체에 존재하는 특정 분자 마커, 마커에 특이적인 프라이머 및 이를 이용하여 녹각형 및 편각형 영지버섯을 특이적으로 판별하는 방법에 관한 것으로, 따라서 본 발명에 의해 개발된 SNP 마커를 이용함으로써 분자생물학적인 분석방법에 의해 녹각형 및 편각형 영지버섯 (Ganoderma lucidum)을 정확히 판별할 수 있으며, 이를 통한 우수한 효능을 가지는 영지 버섯의 품질관리 또한 가능하다.

Description

녹각형 영지버섯 판별용 SNP 마커, 및 이를 이용한 녹각형 영지버섯의 판별방법{SNP marker for identifying the antlered form Ganoderma lucidum, and identifying method using the same}
본 발명은 녹각형 영지버섯(Ganoderma lucidum)의 특이적 판별에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 영지버섯의 유전체에 존재하는 특정 SNP 마커, 및 이를 이용하여 녹각형 영지버섯을 특이적으로 판별하는 방법에 관한 것이다.
영지버섯은 불로초속에 속하는 1년생 버섯으로 모양은 계통에 따라 다양하게 변화한다. 육질은 코르크 질 같고 표면은 니스를 칠한 것 같은 광택이 있으며 주로 활엽수 고사목과 그루터기에 자생하며 북반구 온대 이북에 광범위하게 분포하고 있다. 영지버섯은 우리나라는 물론 중국, 일본 등지에서 귀한 약제로 이용되어 왔으며 영지, 불로초, 만년버섯 등의 여러 이름으로 불려왔다. 영지버섯에는 polysaccharide이외에 tritepene, nucleoside, steroid, fatty acid, alkaloid, 단백질, 아미노산, 무기염류 등 다양한 물질들이 함유되어 있고 이 중 고분자 물질 (polysaccharide 등)과 저분자물질(triterpene등)이 다양하다. 저분자물질은 항염증, 항산화, 간세포보호, 항알레르기, 항고혈압, 콜레스테롤 저하 및 혈소판 응집 저해 등의 활성이 있다. 고분자물질에 포함된 혈압강하, 정혈, 고지혈증 개선, 혈당강하, 면역, 그리고 항종양 등의 효과가 있는 것으로 밝혀져 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며 주요한 농가 소득원으로 재배되고 있다.
현재 영지버섯은 그 형태나 형질이 다른 여러 가지 품종이 있으나 농가에 보급되고 있는 품종들은 적지(赤芝)로 전형적인 영지버섯의 형태인 편각형과 녹각형 품종이 있다. 녹각형은 수량성은 높으나 시장성이 좋지 않은 단점이 있어 영지버섯 재배 초기인 1980년대 초에 많이 재배하였으나 그 후 재배하지 않다가 최근에 가공품으로 공급할 목적으로 일부 농가에서 재배하기도 한다. 그러나 최근 녹각형 영지버섯이 편각형 영지버섯보다 더 많은 양의 베타-D-glucans 및 triterpenoids (ganoderic acids, ganolucidic acids, ganolactone, lucidenic acids, methyl lucidenate, hydroxylucidenic acid)가 함유되어있어 편각형 영지버섯보다 더 강한 생리 활성이 있다고 제안되었으며, 실제로 녹각형영지버섯의 추출물을 이용한 항종양활성 연구에서 종양억제의 탁월한 효과가 있다는 것이 보고 되었다. 또한 녹각형 영지버섯으로부터 추출된 triterpene이 강력한 면역조절작용을 한다고 보고되었다.
영지버섯의 인공재배에서 자실체 원기 발생 및 생육시에는 50～450 lux정도의 광이 필요하나 직사광선보다는 산광이 필요하다. 광량이 많으면 버섯대가 짧아지고 갓의 형성이 빠른 반면 광량이 부족하면 대가 길어지고 갓의 형성과 버섯생육이 지연된다. 이로 인하여 편각형 영지버섯의 재배시 자실체 원기가 형성된 영지버섯을 암상태에 계속 배양하면 착색이 불량해지고 갓이 전개되지 않는 녹각형 자실체의 인위적 유도가 가능하다. 이와는 반대로 CO2의 농도가 0.1%이하일 때에는 편각형 영지버섯도 녹각형 영지버섯의 자실체를 형성한다고 보고되었다.
현재, 우리나라에서는 수입되는 영지버섯은 대부분 건조 형태로 중국, 북한, 일본 등에서 수입되고 있으며 특히, 중국에서 영지버섯이 가장 많이 수입되고 있다. 수입되고 있는 영지버섯은 형태학적으로 품종판별에 한계가 있으며 분말형태일 경우 더욱이 품종판별에 어려움이 있다. 우리나라에서는 영지 1호, 영지 2호, 건영 1호, 장생녹각이 영지버섯품종으로 등록되어 공식적으로 인정되고 있으며, 이 중 장생녹각이 녹각형 영지버섯으로 공시되어있으며, 또한 재배시험결과 이외에 본 발명에서 공시된 4종의 영지버섯이 녹각형 영지버섯으로 확인되었다.
[선행 특허 문헌]
대한민국특허 공개번호 10-2013-0093387
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 녹각형 영지버섯의 특이적 판별을 위한 SNP 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 녹각형 영지버섯에 대해 특이적인 SNP마커를 이용한 녹각형 영지버섯의 특이적 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 하는 녹각형 영지버섯 판별용 마커 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 제 2항의 조성물을 유효성분으로 하는 녹각형 영지버섯 판별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 제한 효소를 유효성분으로 하는 녹각형 영지버섯 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제한효소는 MlyI, PleI 또는 HinfI 제한효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 a) 영지버섯 균사체 시료를 준비하고 지노믹 DNA를 추출하는 단계, b) 제2항의 조성물을 이용하여 상기 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 진행하는 단계, c) 상기 PCR 생성물을 확인하는 단계, 및 d) 제한효소를 상기 PCR 생성물에 처리한 후 제한 단편을 확인하는 단계를 포함하는 녹각형 영지버섯 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 PCR 생성물 확인은 전기 영동에 의한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 제한효소는 MlyI, PleI 또는 HinfI 제한효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 c) 단계의 상기 PCR 생성물은 499-bp 크기를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 d) 단계의 제한효소를 PCR 생성물에 처리한 후 제한 단편의 크기는 HinfI 제한효소의 처리의 경우에 각각 369-bp 및 130-bp의 제한 단편이 관찰되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 우수 영지품종에 대한 유전자원 확보 보존 및 녹각형 영지버섯의 특이적 판별을 통하여 재배생산 시 발생될 수 있는 문제를 극복하기 위해, 본 발명에 사용된 공시균주들에 대한 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭산물을 클로닝하여 염기서열을 비교분석을 수행하고 녹각형 영지버섯에 특이적인 SNP 마커를 개발하여 이를 이용한 녹각형 영지버섯의 특이적 판별방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.
일 태양에 따라, 본 발명은 각각 녹각형 영지버섯의 특이적 SNP 마커를 포함하는 서열 번호 1의 염기서열을 제공한다.
녹각형 영지버섯의 특이적 SNP 마커를 포함하는 영지버섯의 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭산물을 클로닝하여 염기서열을 비교분석을 수행한 연구결과를 바탕으로 선발된 것이다 (서열 번호 1).
다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1의 염기 서열에 대하여 특이적인 한 쌍의 프라이머를 제공한다.
서열 번호 1의 염기 서열에 대해 특이적인 프라이머는 하기와 같다.
GLAFF : 5'AACTATAAAATTTCCTACCTGA -3'(서열 번호 2)
GLAFR : 5'AAAGCAATGAGTTACTATGAAAA -3'(서열 번호 3)
서열 번호 2와 3의 프라이머쌍은 서열 번호 1의 염기 서열을 주형으로 PCR분석에 의해 499-bp의 증폭산물이 얻어지도록 한다.
상기 프라이머들은 당업계에 공지된 합성 기술에 의해 얻을 수 있다.
다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1의 서열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 수행하고 제한효소를 이용한 제한 단편의 차이에 따라 녹각형 및 편각형 영지버섯을 특이적으로 판별하는 방법을 제공한다.
본 방법은 i) 영지버섯 균사체 시료를 준비하고 genomic DNA를 추출하는 단계, ii) 서열 번호 2와 3로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 이용하여 시료에서 PCR을 진행하는 단계, iii) 전기영동에 의해 PCR 생성물을 확인하는 단계, vi) 제한효소를 이용하여 처리한 후 전기영동에 의해 제한 단편을 확인하는 단계를 포함한다.
PCR은 당업계에 공지된 PCR 기법에 의해 수행될 수 있다.
본 방법에 따라 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 생성물을 확인하여, 이용된 프라이머쌍에 의해 증폭된 499bp의 PCR 산물을 제한효소로 처리하여 그 결과에 따라 녹각형 및 편각형 영지버섯 (Ganoderma lucidum)의 판별이 가능하다.
본 발명에 의해 개발된 SNP 마커를 이용함으로써 분자생물학적인 분석방법에 의해 녹각형 및 편각형 영지버섯 (Ganoderma lucidum)을 정확히 판별할 수 있으며, 이를 통한 우수한 효능을 가지는 영지 버섯의 품질관리 또한 가능할 것으로 사료된다. 또한, 본 발명에 의해 개발된 SNP 마커를 이용함으로써 우리나라 고유의 우수한 영지버섯품종 육종, 개발 및 유전자원 보존이 가능할 수 있을 것이며, 재배생산 및 유통 시 발생될 수 있는 문제를 극복할 수 있다고 사료된다.
도 1은 녹각형 영지버섯의 특이적 SNP 마커를 포함하는 영지버섯의 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭산물 전기영동한 사진임.
도면 기호에 대한 설명
M: size marker (1kb ladder)
499-bp: 영지버섯 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭산물.
녹각: 녹각형 영지버섯, 편각: 편각형 영지버섯 [표 1]
도 2는 녹각 및 편각형 영지버섯 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭산물의 염기서열 비교분석결과임.
도면 기호에 대한 설명
화살표: 녹각형 및 편각형 영지버섯의 SNP marker (371-bp)
1~24: 본 발명에 공시된 영지버섯 [표 1]
도 3은 녹각 및 편각형 영지버섯 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭산물의 HinfI제한효소처리 후 전기영동 수행한 사진임.
도면 기호에 대한 설명
M: size marker (1kb ladder)
369-bp, 130-bp: 녹각형 영지버섯의 특이적 제한 단편
녹각: 녹각형 영지버섯, 편각: 편각형 영지버섯 [표 1]
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기의 실시 예에서 특별히 언급되지 아니한 분자생물학적 실험기법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989)을 참조하였다.
실시예 1. 영지버섯 균사체의 배양
수집된 영지버섯 균사체를 Potato Dextrose Broth (Difco, Becton Dickinson; 0.8% Potato starch, 4% Dextrose) 액체 배지에 접종하여 30℃ 인큐베이터에서 3주일간 정치 배양하였다. 본 발명에 사용된 공시균주는 표 1에 정리하였다.
NO . Species Collection sites Collection ID Origin
1 Ganoderma lucidum (녹각형) Mushroom Division at RDA ASI-7013 Korea
2 Ganoderma lucidum (녹각형) Mushroom Division at RDA ASI-7074 Korea
3 Ganoderma lucidum (녹각형) Mushroom Division at RDA ASI-7094 Korea
4 Ganoderma lucidum (녹각형) Mushroom Division at RDA ASI-7135 Korea
5 Ganoderma Species (장생녹각) Mushroom Division at RDA ASI-7146 unknown
6 Ganoderma lucidum (영지 1호) Mushroom Division at RDA ASI-7004 Korea
7 Ganoderma lucidum (영지 2호) Mushroom Division at RDA ASI-7071 Korea
8 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7091 Korea
9 Ganoderma lucidum incheon University IUM-0047 Korea
10 Ganoderma lucidum incheon University IUM-0757 Korea
11 Ganoderma lucidum incheon University IUM-0938 Korea
12 Ganoderma lucidum incheon University IUM-3986 Korea
13 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4002 Korea
14 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4100 Korea
15 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7117 unknown
16 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4304 Bangladesh
17 Ganoderma lucidum incheon University IUM-4310 Bangladesh
18 Ganoderma lucidum Korean Collection for Type Culture KACC4223.2 Japan
19 Ganoderma lucidum Korean Collection for Type Culture KACC51689 Japan
20 Ganoderma lucidum Korean Collection for Type Culture KACC51690 Japan
21 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7037 Papuanewguinea
22 Ganoderma lucidum Korean Collection for Type Culture KCTC 16802 Thailand
23 Ganoderma lucidum Mushroom Division at RDA ASI-7068 U.S.A
24 Ganoderma Species (건영) Mushroom Division at RDA ASI-7152 unknown
실시예 2. 영지버섯 균사체로부터 Genomic DNA 추출
영지버섯 균사체에 액체질소를 넣고 마쇄한 다음 적당량 취하여 500μl의 extraction buffer (200mM Tris-HCl(PH8.0), 200mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS)와 Proteinase K(20mg/ml) 10μl넣고 50℃에서 1시간 반응하였다. 250μl의 2X CTAB(2% CTAB, 100mM Tris-HCl(PH8.0), 5% SDS)을 첨가한 후 500μl의 Phenol : Chloroform : isoamylalcohol (25:24:1)을 첨가하여 12,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 그 상등액만 550μl 취하여 새로운 1.5ml 튜브에 옮긴 후 상등액 0.6 volume의 이소프로판올 (Isopropanol) 과 1/30 volume의 3M Sodium acetate (PH 5.2)를 첨가한 후 실온에서 충분히 반응시키고 12,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 침전된 DNA 팰릿을 70%에탄올로 세척하고 60μl TE buffer(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM; PH 8.0)에 녹인 후 6μl RNase (25mg/ml)를 첨가하여 37℃에 30분 반응하였다. Genomic DNA는 100ng/μl로 농도를 보정하여 PCR을 수행하였다.
실시예 3. 영지버섯의 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭
녹각형 영지버섯의 특이적 SNP 마커를 포함하는 영지버섯의 mitochondria small subunit rDNA 부위의 증폭을 위해 GLAFF: 5 AACTATAAAATTTCCTACCTGA -3(서열 번호 2), GLAFR: 5 AAAGCAATGAGTTACTATGAAAA -3(서열 번호 3)의 프라이머를 사용하여 PCR분석을 수행 하였다 (도 1). PCR증폭반응은 다카라 써멀싸이클러(TaKaRa thermalcycler) (TaKaRa, Japan)를 사용하여 실시하였으며, 반응은 프로-핫 스타트(Pro-Hot Start) PCR 마스터 믹스(Master Mix) (TNT research, Korea)에 각 0.5μl primer (10pmol)와 각각의 genomic DNA 1μl (100ng)를 첨가하고 총량이 20μl가 되게 하여 수행하였다. PCR 반응은 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분으로 30회 반응하였다. 반응 후 PCR 증폭산물은 1.2% 농도의 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티듐 브로마이드에 착색시켜 UV상에서 확인하였다. 그 결과 본 발명에 사용된 모든 영지버섯 (표1) 에서 동일한 증폭산물 (499-bp)을 확인하였다. 또한, 도 1 의 결과를 바탕으로 증폭단편 (499-bp)을 클로닝하고 염기서열분석하여 영지버섯의 mitochondria small subunit rDNA 부위의 염기서열을 확보하였다 (도 2). 이를 바탕으로 녹각형 영지버섯의 SNP 마커를 확인하였다 (도 2).
실시예 4. 녹각형 영지버섯 판별을 위한 제한효소 처리
실시예 3에서 증폭된 증폭산물 5μl를 HinfI 제한효소 1μl, 10 X reaction buffer(Takara)를 첨가하여 총량이 10μl가 되게 하여 37℃에서 1시간 반응한 후 1.2% 농도의 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티듐 브로마이드에 착색시켜 UV상에서 확인하였다. 본 발명에 사용된 공시균주 (표 1)에 대한 분석을 수행한 결과, 녹각형 영지버섯만이 HinfI제한효소에 의해 절단되어 369-bp및 130-bp의 제한 단편이 관찰되는 것을 확인하였다 (도 3). 이와 다르게 편각형 영지버섯은 HinfI제한효소로 절단되지 않아 실시예 3에서 증폭된 499-bp의 증폭산물이 유지되는 것을 확인 하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> SNP marker for identifying the antlered form Ganoderma lucidum, and identifying method using the same <130> HY140460 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 499 <212> DNA <213> Ganoderma lucidum <400> 1 aactataaaa tttcctacct gaaaaggtaa agaaaatatt aggagtgttt aaaatttaaa 60 tacttaagta caggtgttgc atggctgtct tcagttcgtg ttgttaaaca ttaggttaat 120 tccactaacg aacgaaatcc ctgttattaa tttatactta ataactaata aatctgatag 180 agatttagcg ggggctaaga caagtcgtta tggccctcat gttctgggct atagacgtgc 240 cacaaaaact tttacaaagt gatgcgatac ttcccaatag aagtggagct aatcattaaa 300 aaaagttatt tctattaaaa ataagccgga ttgtctcctg taattcggag gcatgaagaa 360 ggaattccga gtcatcgttg ataagtagcg caacggtgaa gctagtttcg tgatgaacta 420 actgtctgtc gctgggaaga agcttttagt ggaggaaact ggagtaagat tatgtttttt 480 catagtaact cattgcttt 499 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 aactataaaa tttcctacct ga 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aaagcaatga gttactatga aaa 23

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하는 녹각형 영지버섯 판별용 마커 조성물.
  2. 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는 녹각형 영지버섯 판별용 조성물.
  3. 삭제
  4. 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 HinfI 제한효소를 유효성분으로 포함하는 녹각형 영지버섯 판별용 키트.
  5. 삭제
  6. a) 영지버섯 균사체로부터 지노믹 DNA를 추출하는 단계;
    b) 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 조성물을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
    c) 상기 PCR 생성물을 확인하는 단계; 및
    d) 상기 PCR 생성물에 HinfI 제한효소를 처리한 후, 제한 단편을 확인하는 단계를 포함하는 녹각형 영지버섯 판별 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 c) 단계의 PCR 생성물 확인은 전기 영동에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 6항에 있어서, 상기 c) 단계의 상기 PCR 생성물은 499-bp 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 d) 단계에서 확인되는 제한 단편은 369-bp 크기를 가지는 제1 제한 단편 및 130-bp 크기를 가지는 제2 제한 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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