CN116640876B

CN116640876B - 用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman-MGB探针与引物及其应用

Info

Publication number: CN116640876B
Application number: CN202310730129.7A
Authority: CN
Inventors: 田恩静; 段仁和; 黄家惠; 张东含
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2023-06-20
Filing date: 2023-06-20
Publication date: 2023-12-08
Anticipated expiration: 2043-06-20
Also published as: CN116640876A

Abstract

本发明公开了一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman‑MGB探针与引物及其应用，属于分子生物学领域。所述Taqman‑MGB探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物的序列如SEQ ID NO.2‑3所示。利用该Taqman‑MGB探针和引物能够实现对鹅膏属檐托鹅膏组(Amanitasect.Phalloidea)致死类鹅膏的鉴定，经试验验证，本发明最少对水煮60min且人工胃液模拟消化120min的样品仍有良好的检测能力，最低检测限是10pg/μL。说明本发明方法能够准确的对复杂条件下样品的目标物种实现检测，为鹅膏属檐托鹅膏组中致死物种导致的中毒事件提供检测证据，辅助医疗单位制定针对性的医疗策略。

Description

用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman-MGB探针与引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman-MGB探针与引物及其应用。

背景技术

蘑菇因其美味，高营养和具有保健能力被人们广泛食用(Zhao et al.,2020；Venturella et al.,2021；Yadav andNegi,2021)。而由于普通人不具备鉴别有毒蘑菇的能力，导致误食有毒蘑菇中毒事件经常发生(Li et al.,2023)。而误食鹅膏属内有毒物种导致的死亡占到90％以上(Bresinsky,1990)。在一项对1994-2012年中国南方地区102例毒蘑菇中毒事件的调查中，鹅膏属占死亡病例的70.49％(Chen et al.,2014)，其中相当一部分属于Amanita sect.Phalloidea物种(Gausterer et al.,2014)。

鹅膏属檐托鹅膏组Amanita sect.Phalloidea隶属于Fungi、Basidiomycota、Basidiomycetes、Agaricales、Amanitaceae、Amanita Pers(Cui et al.,2018)。在中国共报道了隶属该组的物种15个(Zhang et al.,2010；Cui et al.,2018)，这其中的剧毒蘑菇具有鹅膏毒肽类(amatoxins)、鬼笔毒肽类(phallotoxins)、毒伞毒肽类(virotoxins)等毒素(Fu et al.,2017)。AMA1和PHA1被认为是合成致死毒素的基因，仅存在于檐托鹅膏组的有毒物种中，其他部分的无毒物种不含有此类基因(Hallen et al.,2007)。误食檐托鹅膏组内有毒蘑菇，常伴随恶心呕吐、腹痛以及腹泻等典型症状，所以常常被误认为胃肠炎型有毒蘑菇中毒，这样的错误判断导致延误治疗，从而可能会在摄入后的几天内发生肝和肾功能衰竭导致死亡(Broussard et al.,2001)。一项研究推测，口服0.2mg/kgα鹅膏毒素(alpha amanitin)即可致死(Yilmaz et al.,2015)。

误食有毒蘑菇最主要是由于人们偏爱野生食品但缺乏鉴别能力。没有经过系统学习的普通人难以找出识别要点来区分蘑菇是否有毒，同时在野外采集往往会出现未被报道的有毒物种(Broussard et al.,2001)。在不幸发生蘑菇中毒的情况下，最重要的是准确且尽快的介入治疗，通常最有效的方法是对标本进行鉴定来确认所食的物种(Yilmaz etal.,2015)。所以有必要开发出一个准确且快速的鉴定方法来帮助识别致死Amanitasect.Phalloideae蘑菇。这样可以帮助医疗机构和疾控中心快速有效的对蘑菇中毒进行诊断以及确定后续治疗方案，大大提高救治效果。

DNA条形码技术最早由Arnot受到商品条码启发而提出(Arnot et al.,1993)，目的是通过一段标准的且相对较短的DNA基因片段(DNAbarcode)来对物种进行快速地鉴定(Hebert etal.,2003)。在真菌的DNA条形码研究上通用引物ITS1和ITS4的出现标志着ITS(ITS1、5.8S和ITS2)序列成为了具有良好通用性的DNA条形码(White et al.,1990)。但是这并不能代表ITS序列能够应用在所有的真菌鉴定中。在实际应用之中，我们常常会遇见较为低质量的DNA模板，这导致我们无法顺利扩增出目的片段(Bauer et al.,2003)。所以2008年Meusnier等人为了克服由于DNA降解引起的鉴定障碍提出mini-barcode技术。在DNA降解的动物材料中分别超过95％和90％的扩增成功率(Meusnier et al.,2008)。

在有毒蘑菇方面，高崇华在2022年开发出Cortinarius tubarius Ammirati&A.H.Sm.、Galerina calyptrata P.D.Orton分子身份证(Gao,2022)；谢晓梅也在同年开发出赭鹿花菌Gyromitra infula(Schaeff.)Quél.和泡质盘菌Pezizavesiculosa Bolton分子身份证(Xie,2022；Xie et al.,2022)。而该项技术在致死Amanita sect.Phalloideae蘑菇的鉴定方面鲜有报道。在误食Amanita sect.Phalloideae的致死类鹅膏，发生中毒后，往往对中毒者的呕吐物进行检测，由于呕吐物中的检测物经过胃液消化，其DNA发生了不同程度的降解，现有的对Amanita sect.Phalloideae中致死类鹅膏的检测方法很难准确将其检出。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的Taqman-MGB探针与引物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的Taqman-MGB探针与引物能够准确对复杂条件下样品中的致死鹅膏进行检测，为檐托鹅膏组中致死物种导致的中毒事件提供检测证据，辅助医疗单位制定针对性的医疗策略。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的引物组合，包括如SEQ IDNO.2-3所示的引物对和如SEQ ID NO.4所示的探针。

本发明还提供所述的引物组合在制备检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的试剂中的应用。

本发明还提供一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的试剂，包括所述的引物组合。

本发明还提供一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的试剂盒，包括所述的引物组合或所述的试剂。

本发明还提供所述的引物组合、所述的试剂或所述的试剂盒在检测檐托鹅膏组致死类鹅膏中的应用。

本发明还提供一种检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的方法，包括以下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.以所述待测样品DNA为模板，采用所述的引物组合进行实时荧光PCR扩增；

S3.若出现荧光信号和明显的扩增曲线，则所述待测样品中含有所述檐托鹅膏组致死类鹅膏；若未出现荧光信号或无明显扩增曲线，则所述待测样品中不含所述檐托鹅膏组致死类鹅膏。

进一步地，在步骤S2.中，所述实时荧光PCR扩增的反应体系为qPCR Probe Mix 10μL，10μmol/L上下游引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，template DNA 1μL，ddH₂O 6.5μL。

进一步地，在步骤S2.中，所述实时荧光PCR扩增的反应条件为95℃180s，95℃10s，54℃15s，72℃20s，40个循环。

本发明公开了以下技术效果：

本发明在檐托鹅膏组的ITS2区间内靠近28S rDNA区间的位置筛选出一个17bp的短序列，通过特异性与通用性验证了其能够作为檐托鹅膏组的分子身份证序列。根据5.8S区间的单个碱基变异位点设计出特异性MGB探针。以17bp的分子身份证作为一段引物，结合MGB探针实现了对檐托鹅膏组致死类鹅膏的鉴定检测，结果表明该方法仅对檐托鹅膏组内致死支群有极好的特异性，可以最少对水煮60min且人工胃液模拟消化120min的样品仍有良好的检测能力，验证出该方法的最低检测限是10pg/μL。说明该方法的提出能够准确的对复杂条件下样品的目标物种实现检测，为檐托鹅膏组中致死物种导致的中毒事件提供检测证据，辅助医疗单位制定针对性的医疗策略。

本发明利用分子身份证作为一端引物的设计方法可以保证后续的扩增反应对于檐托鹅膏组组内的特异性。组内特异性的保证大大减少了组内致死鹅膏分支特异性探针设计的难度。双重特异性的扩增能够使检测的准确性提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于ITS序列构建的檐托鹅膏组的邻接树系统发育图；

图2为檐托鹅膏组分子身份证在序列中的区间位置；

图3为檐托鹅膏组内五个致死类物种的测序峰图；

图4为檐托鹅膏组子身份证特异性示意图；

图5为引物和探针设计位置示意图；

图6为实时荧光PCR的检测曲线；其中，A为特异性检测结果；B为灵敏度检测结果；C为适用性检测结果；

图7为实时荧光PCR的标准曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明实验材料源于野外采集和标本馆借阅，共使用鹅膏属内物种16个。其中檐托鹅膏组内样品6个种，致死类支群鹅膏5个种。其他属有毒蘑菇7个种。样品均保藏在吉林农业大学菌物标本馆(HMJAU)，详见表1。

表1实验材料信息

本发明通过自测檐托鹅膏组内6个种38份标本的序列和GenBank数据库中下载檐托鹅膏组内14个种228条经过验证的序列筛选出檐托鹅膏组的17bp的分子身份证(5’-AACTCCATTGGTGTGAT-3’,SEQ ID NO.1)，并验证了其通用性和特异性。在对檐托鹅膏组这一类群进行多样性研究时，发现在檐托鹅膏组中主要存在两大分支(见图1)，即致死类鹅膏支群和非致死类鹅膏支群。通过大量的序列分析，在这两个支群之中我们发现了一处位于5.8S区间的单个碱基变异位点，并据此设计出特异性MGB探针，实现了对Amanitasect.Phalloidea致死类鹅膏的鉴定检测并且验证了该方法的特异性、适用性和灵敏度。

为了进一步说明上述实验原理，将以实施例的方式进一步进行具体的说明。

实施例

1.基因组DNA提取

将形态学鉴定准确的标本使用改良碱裂解法(The alkaline lysis buffer wasmade ofsodium hydroxide,1％PVP and 1％TritonX-100.)进行总基因组DNA的提取：取样品(菌褶)5mg，加入The alkaline lysis buffer 20μL，使用漩涡振荡器振荡15s混匀；60℃加热2min；加入1×TE Buffer(ph＝8)(Sangon Biotech)180μL，轻微漩涡混匀；取上清用于PCR反应。对于试剂盒提取效果不佳的标本采用改良的CTAB法(Doyle andDoyle,1987)。DNA的浓度和纯度采用NanoDrop 2000超微分光光度计进行测量，测量后将DNA的浓度稀释到10ng/μL，置于-20℃的冰箱中保存。

2.引物设计、PCR扩增和测序

基于NCBI下载的檐托鹅膏组内物种ITS序列，将经过特异验证查找出的檐托鹅膏组分子身份证作为下游引物(表2中SEQ ID NO.3，与SEQ ID NO.1所示序列反向互补)；再利用檐托鹅膏组内非致死鹅膏与致死鹅膏单个差异碱基位点为探针中部位置，筛选出致死鹅膏的13bp共有序列作为探针(表2中SEQ ID NO.4)，因为13bp作为传统探针过短，效果不好，在探针3’端修饰MGB基团，由于TaqMan MGB探针在3’端包含一个MGB部分，可以增加探针的熔解温度(Tm)，因此TaqMan MGB探针可以比传统探针短很多，提供更好的序列鉴别能力和灵活性，可适应更多靶标。再利用所确定的下游引物和探针，按照探针设计推荐，使用Primer Primer5_V5.5.0利用物种5.8s区域保守的特征，设计出檐托鹅膏组内通用的上游引物。

此种利用分子身份证作为一端引物的设计方法可以保证后续的扩增反应对于檐托鹅膏组组内的特异性。组内特异性的保证大大减少了组内致死鹅膏分支特异性探针设计的难度。双重特异性的扩增能够使检测的准确性提高。

表2REAL-TIME PCR实验所需的引物和探针信息

3.特异性验证

为检测该檐托鹅膏组内致死类支群实时荧光法的特异性，对表1中供试的5份檐托鹅膏组内致死材料(表1中No.1-5)；1份檐托鹅膏组内非致死类材料(表1中No.6)；10份非檐托鹅膏组的鹅膏属内物种材料(表1中No.7-16)；7份其他属的有毒蘑菇材料(表1中No.17-23)和一份添加ddH₂O的无模板空白对照(表1中No.NTC)，在相同条件(95℃180s，95℃10s，54℃15s，72℃20s(采集荧光信号)，40个循环)下进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR反应系统中所用试剂的浓度和剂量如表3所示。

表3实时荧光PCR反应系统中所用试剂的浓度和剂量

以循环数为横坐标，扩增曲线的荧光信号增加值(△Rn)为纵坐标建立该反应的扩增曲线图。出现明显的扩增曲线说明献策结果阳性，检测出目标物种；无扩增曲线说明检测结果为阴性，没有检验出目标物种。

4.模拟胃液的消化处理

采用模拟胃液消化的方式处理样品(表4的A组)，以模拟中毒事件发生时，患者呕吐物中提取样品检测的情况。选择表1中No.3(A.pallidorosea)为检测对象。取2.0g氯化钠和3.0g胃蛋白酶加7.0mL盐酸和水，溶解至1000mL，即得模拟胃液(Simulated GastricFluid，SGF)。将每份30mg样品置于沸水中水煮10min、30min和60min。再将水煮处理的样品放入模拟胃液中置于37℃的条件下模拟消化处理30min、60min和120min。将处理好的九组样品同“1.基因组DNA提取”提取DNA。

5.灵敏度验证

为检测该方法的灵敏度，选择表1中No.3(A.pallidorosea)为检测对象，用DNA稀释液(用于荧光定量，Sangon Biotech)将初始浓度为100ng/μL的A.pallidorosea DNA模板进行10倍梯度稀释，如表4中B所示的6个梯度，每个梯度重复三次实验。同时根据结果建立标准曲线。

表4

6.结果

6.1分子身份证建立

通过大量的筛选挖掘，发现檐托鹅膏组在5.8S rDNA到28S rDNA之间的ITS2区间，种间特异性不足，但是组间特异性强，具有发掘组一分类等级分子身份证的潜力。在ITS2区间截取一段23bp长度的保守区域，但由于长度过长，特异性过强的23bp序列只能覆盖檐托鹅膏组部分物种。进一步对23bp序列进行缩减筛选，最终在ITS2区间内靠近28S rDNA区间的位置筛选出一个17bp的短序列(5’-AACTCCATTGGTGTGAT-3’，SEQ ID NO.1)可以覆盖所有的檐托鹅膏组物种。因此，这个17bp的短序列有极大的潜力成为檐托鹅膏组的分子身份证序列(分子身份证在序列中位置见图2的A)。

为了验证筛选出的檐托鹅膏组17bp短序列的通用性，将其与实验所得的38条Amanita sect.Phalloideae序列与从GenBank下载的228条序列，用Aliview软件进行序列比对，结果发现所有的檐托鹅膏组序列中都包含此条短序列(图2的C)，并且位置都位于ITS2区间靠近28S rDNA区间的位置(图2的A)。且通过Sequencher 5.4.5软件查看峰图(图2的B)，发现此区间峰图单一且有序，说明此区间存在SNP位点的可能性较小，具有强适用性且变异风险较小。

将筛选出的檐托鹅膏组分子身份证序列置于NCBI网站进行BLAST比对，在相似率与覆盖率均为100％的805个结果中，除少数非菌物、菌物未定种外，并未出现非檐托鹅膏组物种。结果表明，17bp的檐托鹅膏组分子身份证序列在GenBank数据库中在区分檐托鹅膏组和其他大型真菌方面具有极强的特异性。

6.2特异性验证

对表1的24组样品进行实时荧光PCR检测，扩增曲线如图3的A所示。檐托鹅膏组内致死支群(No.1-5)有荧光信号且出现明显的扩增曲线，说明该方法可以将檐托鹅膏组内致死支群检测出来。而檐托鹅膏组内非致死支群(No.6)、非檐托鹅膏组的鹅膏属内物种材料(No.7-16)、其他属的有毒蘑菇材料(No.17-23)以及NTC均未产生明显荧光信号，无明显扩增曲线，说明该方法仅对檐托鹅膏组内致死支群有极强的特异性。

6.3适用性验证

对表4中A处理的10组样品进行Real-time PCR检测，如图3的B所示，No.1-9条件下均出现荧光信号且扩增曲线明显，NTC中无荧光信号且扩增曲线不明显。说明该方法最少对水煮60min且人工胃液模拟消化120min的样品仍有良好的检测能力。证明该方法对水煮消化的样品仍然可以进行检测具有良好的适用性。

6.4灵敏度验证

使用设计的特异性引物和探针对处理好的DNA样品进行实时荧光PCR以检测该方法对体系DNA含量的灵敏度，扩增曲线如图3的C所示。可见当反应中DNA模板浓度为1pg/μL时，三次重复的扩增曲线Ct值出现较大变化且均大于30，且无较强荧光信号。而DNA模板浓度为100ng/μL～10pg/μL时出现荧光信号且有明显的扩增曲线。可以认为本发明所建立的实时荧光PCR方法的最低检测限是10pg/μL。

同时发现对已知浓度的DNA模板进行梯度浓度稀释后的实时荧光PCR中，在一定范围内，DNA模板浓度越高，Ct值越小。说明DNA模板浓度与Ct值呈负相关。构建标准曲线如图4所示，标准曲线方程为y＝-2.23992x+23.82107(R²＝0.9963)。

组(sention)这一级别的通用分子身份证的开发大大拓宽了传统分子鉴定体系中仅对单一物种鉴定的局限性。组内致死鹅膏分支的特异性单个碱基变化也极大保证了接下来分子鉴定的特异性，两者结合使用能够脱离传统分类单元，将物种分类鉴定和表现型结合，达到预想结果。

通过分子身份证以及两个支群单个碱基差异位点，可以使用实时荧光PCR技术对檐托鹅膏组内致死支群进行检测，在染料法和探针法之间选择特异性更加强的MGB探针。通过对设计的特异性引物和探针进行特异性、适用性和灵敏度验证，证明了该方法良好的鉴定能力，可以高效、快速、准确地鉴定檐托鹅膏组内致死类鹅膏，对该类型毒蘑菇引起的中毒后的诊断和针对性治疗具有重要意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合由如SEQ ID NO.2-3所示的引物对和如SEQ ID NO.4所示的探针组成。

2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的试剂中的应用。

3.一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。

4.一种用于检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合或权利要求3所述的试剂。

5.如权利要求1所述的引物探针组合、权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测檐托鹅膏组致死类鹅膏中的应用。

6.一种检测檐托鹅膏组致死类鹅膏的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.以所述待测样品DNA为模板，采用权利要求1所述的引物探针组合进行实时荧光PCR扩增；

S3.若出现荧光信号和明显的扩增曲线，则所述待测样品中含有所述檐托鹅膏组致死

类鹅膏；若未出现荧光信号或无明显扩增曲线，则所述待测样品中不含所述檐托鹅膏组致死类鹅膏。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S2.中，所述实时荧光PCR扩增的反应体系为qPCRProbeMix 10μL，10μmol/L上下游引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，templateDNA 1μL，ddH₂O 6.5μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S2.中，所述实时荧光PCR扩增的反应条件为95℃180s；95℃10s，54℃15s，72℃20s，40个循环。