CN116334281A - 对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字pcr鉴定的试剂盒和方法 - Google Patents

对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字pcr鉴定的试剂盒和方法 Download PDF

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CN116334281A CN202310212519.5A CN202310212519A CN116334281A CN 116334281 A CN116334281 A CN 116334281A CN 202310212519 A CN202310212519 A CN 202310212519A CN 116334281 A CN116334281 A CN 116334281A
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Abstract

本发明公开了一种对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字PCR鉴定的试剂盒和方法，试剂盒包括用于对有毒蘑菇进行PCR鉴定的引物组，有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种，试剂盒用于对不同种类的有毒蘑菇进行种类鉴定。本发明选取常见的有毒蘑菇及其近缘种和形态近似种，通过序列比对，找到有毒蘑菇与其近似物种的差异位点，设计特异性引物，能准确地将有毒蘑菇与其它近似种和易混淆种区分开来；通过灵敏度检测，保证所建立的检测方法可满足中毒事件中早期、准确诊断，从而尽快对症使用解毒剂。

Description

对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字PCR鉴定的试剂盒 和方法
技术领域
本发明涉及蘑菇种质鉴定技术领域，具体涉及对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字PCR鉴定的试剂盒和方法。
背景技术
一些有毒菌类与可食菌类外形相似、且生长季节和生长环境相同，混杂生长在一起，容易被人当成可食菌类采用。而误食野生毒蘑菇可能会造成急性肝损害、急性肾衰竭、肠胃炎等严重后果。
常见野生毒蘑菇中，鹅膏科(Amanitaceae)鹅膏属(Amanita)部分真菌因含有鹅膏肽类毒素而具有致毒性，如致命鹅膏(Amanita exitialis)，俗名“白毒伞”，该种被科学界认为是“剧毒杀手”，可以造成急性肝损害。
在误食有毒蘑菇急救中存在事发突然、形态学鉴定难等棘手难题，且目前我国对有毒生物危害整体关注与研究较少，没有形成成熟的检测鉴定技术方法、试剂和标准，无法及时诊断出中毒原因，给人民生命安全和健康带来了重大隐患。所以，开展有毒蘑菇快速定性检测技术研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种对有毒蘑菇种类进行常规/实时荧光/数字PCR鉴定的试剂盒，具体技术方案如下：
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种对有毒蘑菇进行PCR鉴定的试剂盒，包括用于对有毒蘑菇进行PCR分子鉴定的特异性引物，
所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；
所述有毒蘑菇对应的特异性引物如下表所列：
Figure SMS_1
上述的试剂盒还包括用于实时荧光PCR的特异性TaqMan探针，每种有毒蘑菇对应的TaqMan探针如下表所示：
种类 探针名称 探针序列(5’→3’)
假褐云斑鹅膏 A pse P ATTCGATGGACCTGCAAACTCCCAG
锥鳞白鹅膏 A vir P AGCGCAAGATGCGTTCAAGC
新苦粉孢牛肝菌 T neo P ACCATCCCAACCAACGTATGTC
。
上述的试剂盒还包括PCR扩增反应所需的试剂；优选所述PCR为常规PCR或者实时荧光PCR或者数字PCR；优选所述PCR扩增反应所需的试剂为DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
上述的试剂盒还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照。
本发明还提供了一种对有毒蘑菇种类进行常规PCR鉴定的方法，所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；
包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用权利要求1所述的试剂盒中的特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有对应目的扩增片段的样品鉴定为相应种类的有毒蘑菇；
假褐云斑鹅膏对应的扩增片段大小为380bp，
锥鳞白鹅膏对应的扩增片段大小为190bp，
新苦粉孢牛肝菌对应的扩增片段大小为240bp。
上述的常规PCR方法技术方案中，
PCR反应体系为：总体积25μL，含有：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，浓度均为10μM的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为ddH2O；
假褐云斑鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35循环；72℃10min；
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；
优选所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带；
优选地，可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
本发明还提供了一种对有毒蘑菇种类进行实时荧光PCR鉴定的方法，所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；
包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用权利要求2所述的试剂盒对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否为对应种类的有毒蘑菇，如果Ct≤30则判断为对应种类的有毒蘑菇阳性。
上述的实时荧光PCR鉴定的方法的技术方案中，
所述实时荧光PCR的反应体系为：总体系20μL，含有2×Premix Ex Taq 10μl，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μl，浓度为10μmol/L的探针0.5μl，ddH2O 6.5μl，DNA模板1μl；
qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环；
优选地，可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
本发明还提供了一种对有毒蘑菇种类进行数字PCR鉴定的方法，所述有毒蘑菇包括选自锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或两种；
包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用权利要求2所述的试剂盒对提取的基因组DNA进行数字PCR扩增，扩增反应完成后，通过微滴读取仪进行微滴荧光的读取和数据采集，通过数据分析获得待测样品的绝对含量；
优选地，扩增反应完成后，将反应板取出置于微滴读取仪中进行微滴荧光的读取和数据采集，随后通过分析散点图确定判定荧光阈值以确定阳性微滴和阴性微滴，通过直接读取阳性微滴拷贝数即可获得待测样品的绝对含量。
上述的数字PCR鉴定的方法的技术方案中，
数字PCR反应体系为：总体系20μL，含有2×ddPCR Supermix for Probes 10μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各为1μL，浓度为10μmol/L的探针0.5μL，DNA模板1μL，余量为ddH2O；
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环；
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环；
优选地，所述待测样品的基因组DNA的浓度可低至1pg/μL。
本发明的有益效果是：
本发明选取常见的有毒蘑菇及其近缘种和形态近似种，通过序列比对，找到有毒蘑菇与其近似物种的差异位点，并设计特异性引物，能够准确地将有毒蘑菇与其它近似种和易混淆种区分开来；通过灵敏度检测，保证所建立的检测方法可满足中毒事件中早期、准确诊断，从而尽快对症使用解毒剂，提高中毒事件中的抢救成功率和治愈率。
附图说明
图1是环鳞鹅膏常规PCR特异性检测结果；
图2是致命鹅膏常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图3是灰褶鹅膏常规PCR特异性检测结果；
图4是爪哇鹅膏菌常规PCR特异性检测结果；
图5是异味鹅膏常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图6是小豹斑鹅膏常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图7是假褐云斑鹅膏常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图8是锥鳞白鹅膏常规PCR特异性检测结果；
图9是大青褶伞常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图10是栎裸柄伞常规PCR特异性检测结果；
图11是肉褐鳞环柄菇常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图12是新苦粉孢牛肝菌常规PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；图13是环鳞鹅膏数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图14是致命鹅膏数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图15是异味鹅膏数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图16是锥鳞白鹅膏数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图17是大青褶伞数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图18是栎裸柄伞数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图19是肉褐鳞环柄菇数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图20是新苦粉孢牛肝菌数字PCR检测结果：(A)特异性检测结果；(B)灵敏度检测结果；
图21是实时荧光PCR检测结果：(A)环鳞鹅膏，(B)致命鹅膏，(C)爪哇鹅膏菌，(D)异味鹅膏，(E)小豹斑鹅膏，(F)假褐云斑鹅膏，(G)锥鳞白鹅膏，(H)大青褶伞，(I)栎裸柄伞，(J)肉褐鳞环柄菇，(K)新苦粉孢牛肝菌；
图1、图6A、图7A、图8、图9A、图10、图12A中，样品顺序从左到右分别为D2000Marker、水、大青褶伞(Chlorophyllum molybdites)、近短柄乳菇(Lactariussubbrevipes)、环鳞鹅膏(Amanita concentrica)、蓝肉齿菇(Hydnellum caeruleum)、新苦粉孢牛肝菌(Tylopilus neofelleus)、红黄鹅膏(Amanita hemibapha)、橙黄蜡蘑(Laccaria aurantia)、丽江牛肝菌(Boletus kauffmanii)、栎裸柄伞(Gymnopusdryophilus)、玫瑰红菇(Russula rosacea)、长柄大环柄菇(Macrolepiota dolichaula)、点柄臭红菇(Russula senecis)、灰褶鹅膏(Amanita griseofolia)、细裂皮红菇(Russulavelenovskyi)、小豹斑鹅膏(Amanita parvipantherina)、爪哇鹅膏菌(Amanitajavanica)、锥鳞白鹅膏(Amanita virgineoides)、假褐云斑鹅膏(Amanitapseudoporphyria)、蓝黄红菇多变变种(Russula variata)、异味鹅膏(Amanitakotohiraensis)；
图2A、图3、图4、图5A、图11A中，样品顺序从左到右分别为D2000 Marker、水、大青褶伞(Chlorophyllum molybdites)、近短柄乳菇(Lactarius subbrevipes)、环鳞鹅膏(Amanita concentrica)、蓝肉齿菇(Hydnellum caeruleum)、新苦粉孢牛肝菌(Tylopilusneofelleus)、红黄鹅膏(Amanita hemibapha)、橙黄蜡蘑(Laccaria aurantia)、丽江牛肝菌(Boletus kauffmanii)、栎裸柄伞(Gymnopus dryophilus)、玫瑰红菇(Russularosacea)、长柄大环柄菇(Macrolepiota dolichaula)、点柄臭红菇(Russula senecis)、灰褶鹅膏(Amanita griseofolia)、细裂皮红菇(Russula velenovskyi)、小豹斑鹅膏(Amanita parvipantherina)、爪哇鹅膏菌(Amanita javanica)、锥鳞白鹅膏(Amanitavirgineoides)、假褐云斑鹅膏(Amanita pseudoporphyria)、蓝黄红菇多变变种(Russulavariata)、异味鹅膏(Amanita kotohiraensis)、密褶黑菇(Russula densifolia(Secr.)Gill.)、致命鹅膏(Amanita exitialis)、肉褐鳞环柄菇(Lepiota brunneoincarnata)；
图2B、5B、6B、7B、9B、11B、12B中样品顺序从左到右分别为DNA分子量标准、不同浓度的PCR扩增产物稀释液分别为10ng/μl、1ng/μl、10-1ng/μl、10-2ng/μl、10-3ng/μl、10-4ng/μl、10-5ng/μl、10-6ng/μl，和TE缓冲液对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；各实施例中所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为常规试剂，均可通过商购获得。
实施例1、基于常规PCR技术的有毒蘑菇检测技术研究
(1)样品采集
本研究的供试蘑菇样品共计23种，样品详见表1。蘑菇样品来源于中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、吉林农业大学和中国疾病预防控制中心，经过形态学鉴定确认样品种类。
表1供试蘑菇样品种类
Figure SMS_2
Figure SMS_3
(2)基因组DNA提取
将1g食用菌剪碎置于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入2mL离心管中，利用“植物基因组DNA提取试剂盒”(购自北京索莱宝科技有限公司)对本研究中的蘑菇样品进行基因组DNA提取，用于引物的特异性验证，具体操作流程参照DNA提取试剂盒说明书。
(3)特异性引物设计
本研究基于蘑菇ITS序列设计种特异性引物，在设计引物前，先对供试蘑菇样品进行ITS序列扩增。引物序列ITS4(SEQ ID NO.1)：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5(SEQID NO.2)：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’。PCR反应体系为25μL，包含PCR master mix12.5μL，DNA模板1μL，正反向引物各1μL，ddH2O 9.5μL。ITS序列的PCR扩增程序为95℃预变性3min；95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s 35个循环，72℃延伸5min。PCR产物用1-1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，委托北京擎科生物科技有限公司进行双向测序，测得各蘑菇种类的ITS序列(如表1中序列编号所示)。
采用Codon CodeAligner V3.0对ITS测序峰图进行校正，去除低质量序列及引物区，对所获得的序列用DNAMAN软件(美国LynnonBiosoft公司开发的高度集成化的分子生物学综合应用软件)进行多序列比对，寻找能够将目标物种与其他蘑菇特异性区分的位点，在该蘑菇种类与其它蘑菇存在特异性的基因区间寻找适合用于设计上下游特异性引物的位点，人工设计种特异性引物。为保证引物特异性，尽可能使特异性位点位于引物3’端；利用O1igo7.0软件对引物进行评估，引物评估的主要内容及标准如下：①3’△G绝对值不超过9或3’端避免有3个连续的G/C；②形成的引物二聚体不稳定，其△G绝对值不超过10；③发夹结构的△G不超过4.5kcal/mol；④上下游引物的GC含量控制在30％-70％之间，且上下游引物的退火温度不要相差太大，一般不超过5℃；⑤错误引发效率一般不超过100；⑥引物长度在18bp-30bp之间；再结合软件中给出的每对引物的最适退火温度和最高退火温度设定实验条件。所设计的引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
利用设计的引物对蘑菇样品基因组DNA进行PCR扩增，检测引物的特异性。PCR反应体系：总体积25μL，含有：2×Taq PCR Master mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号KT201)12.5μL，上下游引物(浓度均为10μM)各1μL，DNA模板1μL，余量为ddH2O。扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测，经电泳验证设计的特异性引物能够对该种类的蘑菇进行特异性鉴定。最终确定出表2中的12种有毒蘑菇的特异性引物。
通常，需要事先设计多对特异引物以筛选出能实现特异性扩增的引物对，仅仅设计一对特异引物往往不能实现特异性扩增，主要原因有：(1)对于特异性引物本身来说，在设计引物时要兼顾特异性和引物自身的合理性(如：不要形成二聚体、发夹结构、引物自身引发的非特异性扩增、上下游引物的退火温度不能相差超过10℃等等)，因此本研究无法应用引物设计软件得到满意的结果。因为引物设计软件只考虑引物本身的合理性，给出合理的引物，但得到的引物常常无法满足特异性的要求，特别是对于本研究中同属的近缘种，由于种间相似度较高，对特异引物设计的难度便加大。(2)对于人工设计的引物在理论上保证特异性的前提下，在实验过程中，也需要不断调整反应条件和反应体系，在引物、反应条件和反应体系的三重保证下，才能得出特异性的检测结果。
本发明中，对每个有毒蘑菇种类设计了三对特异引物用来进行特异性验证，对于出现非特异性扩增的结果，通过调整反应条件(如：退火温度和循环数)和反应体系(如：引物和DNA模板浓度)开展进一步的特异性验证以及特异性扩增反应条件和体系的建立。在筛选出特异性引物后，在该引物范围内进行种特异性探针的设计，并通过实时荧光PCR进行探针有效性的验证，同样通过调整反应条件(如：退火温度和循环数)和反应体系(如：引物、探针和DNA模板浓度)进行特异性验证以及基于实时荧光PCR技术和数字PCR技术的特异性扩增反应条件和体系的建立。
表2.有毒蘑菇的种特异性引物序列
Figure SMS_4
(4)引物特异性和灵敏度检测
筛选原则为特异引物在一定的PCR反应体系和条件下，通过琼脂糖凝胶电泳检测，目标物种产生阳性条带，而其他种类均无扩增条带出现，即该引物对能特异性地鉴定该物种。选择能扩增出目标物种、2％琼脂糖凝胶电泳检测为清晰明亮的单一条带，而其他近似物种不出现任何扩增条带的引物对，为目标物种的特异引物对。此外，将阳性扩增产物交由北京擎科生物科技有限公司进行纯化和双向测序，对测序结果进行拼接、BLAST比对，以确认特异引物所扩增的目的片段属于所设计的目标物种。
利用表2中的引物对对蘑菇样品DNA进行PCR扩增，检测引物的特异性。PCR反应体系：总体积25μL，含有：2×Taq PCR Master mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号KT201)12.5μL，上下游引物(浓度均为10μM)各1μL，DNA模板1μL，余量为ddH2O。
灵敏度检测：使用“DNA凝胶回收试剂盒”(购自北京擎科生物科技有限公司)回收纯化PCR产物。用TE缓冲液进行系列稀释，得到不同稀释液，浓度分别为：10ng/μl、1ng/μl、10-1ng/μl、10-2ng/μl、10-3ng/μl、10-4ng/μl、10-5ng/μl、10-6ng/μl。分别以每种稀释液为模板(TE缓冲液为阴性对照)，用各物种各自引物组对不同浓度的模板进行PCR扩增。PCR反应体系和扩增条件同已建立的各物种特异性PCR反应体系和扩增条件。扩增反应结束后，取5μl PCR特异的扩增产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。
环鳞鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品环鳞鹅膏中扩增出约350bp的特异性目的条带，大小与预期(341bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图1)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高。
致命鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品致命鹅膏中扩增出约180bp的特异性目的条带，大小与预期(186bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图2A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图2B)。
灰褶鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品灰褶鹅膏中扩增出约380bp的特异性目的条带，大小与预期(385bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图3)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高。
爪哇鹅膏菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品爪哇鹅膏菌中扩增出约410bp的特异性目的条带，大小与预期(413bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图4)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高。
异味鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品异味鹅膏中扩增出约290bp的特异性目的条带，大小与预期(291bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图5A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图5B)。
小豹斑鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品小豹斑鹅膏中扩增出约280bp的特异性目的条带，大小与预期(284bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图6A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图6B)。
假褐云斑鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品假褐云斑鹅膏中扩增出约380bp的特异性目的条带，大小与预期(382bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图7A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图7B)。
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品锥鳞白鹅膏中扩增出约190bp的特异性目的条带，大小与预期(188bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图8)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高。
大青褶伞PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品大青褶伞中扩增出约320bp的特异性目的条带，大小与预期(321bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图9A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图9B)。
栎裸柄伞PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品栎裸柄伞中扩增出约280bp的特异性目的条带，大小与预期(283bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图10)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高。
肉褐鳞环柄菇PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品肉褐鳞环柄菇中扩增出约280bp的特异性目的条带，大小与预期(285bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图11A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图11B)。
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min。根据反应体系和程序，电泳结果表明仅有样品新苦粉孢牛肝菌中扩增出约240bp的特异性目的条带，大小与预期(238bp)一致，PCR扩增效率很高，无其他非特异性条带(图12A)；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，检测灵敏度高(图12B)。
本研究建立了12种有毒蘑菇物种的常规PCR特异性检测方法并研发了相应的快速检测试剂盒，整个检测流程只需1.5h左右即可完成(不含样品前处理时间)，可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl，灵敏度非常高。该技术具有快速、经济、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。同时，基于常规PCR的分子检测方法对实验仪器要求不高，一般的分子生物学实验室都能开展相关实验，因此，该技术更易于在实际工作中推广应用。
实施例2、基于实时荧光PCR技术的有毒蘑菇检测技术研究
一、研究方法
(1)样品采集
样品实施例1中所用蘑菇样品。
(2)TaqMan探针设计
在实施例1中已筛选出的特异性引物基础上，进行特异性TaqMan探针设计。根据序列比对结果，在特异性引物范围内，通过PrimerQuest Tool(https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index)软件在上下游引物间区域设计种属特异性的荧光探针，探针设计原则如下：(1)5’端第一个碱基不能为G；(2)3’端的前四个碱基避免有3个或以上G；(3)探针与引物的距离越近越好；(4)GC％在30％-70％之间，且退火温度在65℃-67℃之间；(5)探针长度在13bp-25bp之间；(6)避免出现重复喊基，尤其避免4个以上的G重复出现，避免6个A连续出现；(7)选择C比G多的序列作为探针。探针由上海生工生物工程有限公司合成。所设计的探针由上海生工生物工程有限公司合成。
(3)探针特异性和灵敏度检测
通过实时荧光PCR扩增对设计的所有种特异性TaqMan探针进行筛选，筛选原则为探针和引物组合在一定的实时荧光PCR反应体系和条件下，只有目标物种在一定数量的循环反应以内有近S型的扩增曲线出现，而其他种类均无荧光增长信号，即该探针和引物组合能特异性地鉴定出目标物种。为避免假阳性扩增，通过提高退火温度、减少引物和探针的量来对实时荧光PCR的反应条件进行优化；同时，为缩短反应时间、提高检测效率，对循环次数和扩增时间在保证扩增反应充分进行的前提下进行适当缩减。
利用实施例1中设计的引物和本研究中设计的探针(表3)组合进行实时荧光PCR，检测引物和探针组合的特异性和灵敏度。PCR反应总体系20μL，含有2×Premix Ex Taq(Takara)10μl，上下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl，ddH2O 6.5μl，DNA模板1μl。反应结束后，通过直接观察扩增曲线即可判断结果，设定CT≤30.0为阳性扩增。
灵敏度检测所用的扩增模板为实施例1中灵敏度检测所用的已梯度稀释的样品。按照最终建立的实时荧光PCR技术方法扩增检测，用筛选出的特异性探针和引物组合对梯度稀释的样品进行扩增，ddH2O为阴性对照；每次实验同一浓度的模板设三个重复，经三次重复实验最终确定特异性探针和引物组合检测的灵敏度。
二、研究结果
(1)TaqMan特异性探针
在实施例1中已筛选出的特异性引物基础上，进行种特异性TaqMan探针设计。根据序列比对结果，在特异性引物范围内，通过PrimerQuest Tool(https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index)软件在上下游引物间区域设计种属特异性的荧光探针，探针委托上海生物工程技术服务有限公司合成，表3所示。
表3.有毒蘑菇的种特异性探针序列
Figure SMS_5
(2)实时荧光PCR特异性扩增及灵敏度检测
环鳞鹅膏PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品环鳞鹅膏中有特异性扩增，Ct为20.52，即从第21个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出环鳞鹅膏；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
致命鹅膏PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品致命鹅膏中有特异性扩增，Ct为18.54，即从第19个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出致命鹅膏；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
爪哇鹅膏菌PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品爪哇鹅膏菌中有特异性扩增，Ct为15.78，即从第16个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出爪哇鹅膏菌；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
异味鹅膏PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品异味鹅膏中有特异性扩增，Ct为21.81，即从第22个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出异味鹅膏；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
小豹斑鹅膏PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品小豹斑鹅膏中有特异性扩增，Ct为16.98，即从第17个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出小豹斑鹅膏；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
假褐云斑鹅膏PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品假褐云斑鹅膏中有特异性扩增，Ct为15.64，即从第16个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出假褐云斑鹅膏；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品锥鳞白鹅膏中有特异性扩增，Ct为15.46，即从第16个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出锥鳞白鹅膏；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
大青褶伞PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，65℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品大青褶伞中有特异性扩增，Ct为18.92，即从第19个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出大青褶伞；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
栎裸柄伞PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品栎裸柄伞中有特异性扩增，Ct为21.84，即从第22个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出栎裸柄伞；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
肉褐鳞环柄菇PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，65℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品肉褐鳞环柄菇中有特异性扩增，Ct为17.28，即从第17个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出肉褐鳞环柄菇；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40循环。根据反应体系和程序，实时荧光扩增曲线结果表明，仅在样品新苦粉孢牛肝菌中有特异性扩增，Ct为18.14，即从第18个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他22种食用菌样品及阴性对照在35个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该引物和探针组合能特异性检测出新苦粉孢牛肝菌；可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
各个蘑菇种类的实时荧光PCR特异性检测结果如图21所示。
本研究建立了11种有毒蘑菇的实时荧光PCR鉴定技术方法，并研发了相应的快速检测试剂盒，整个检测流程只需1h左右即可完成(不含样品前处理时间)。实时荧光PCR技术同常规PCR技术相比，反应结束后无需电泳检测的后续步骤，进一步提高了鉴定效率，又有效避免了琼脂糖凝胶电泳过程中对人体和环境的危害。同时，由于实时荧光PCR技术在常规PCR原有的一对种特异性引物之间，增加了一条种特异性探针，只有当引物和探针都与模板DNA结合并扩增时，才能产生荧光信号，这一反应机制决定了实时荧光PCR比常规PCR反应特异性强。实时荧光PCR技术具有快速简便、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。虽然合成TaqMan探针成本相对较高，但随着检测技术发展的完善，该技术在有毒蘑菇鉴定上有广阔的应用前景。
实施例3、基于数字PCR技术的有毒蘑菇检测技术研究
数字PCR(Digital PCR)技术是一种不需要标准曲线就可以进行核酸分子绝对定量的技术，相对于实时荧光定量PCR，数字PCR具有更高的精确度和准确度，尤其是对于痕量目标的检测更为准确。本研究基于实施例1和2设计筛选出的有毒蘑菇种特异性引物和探针，对数字PCR条件进行优化，考察方法特异性和灵敏度，最终建立有毒蘑菇数字PCR检测技术。
一、研究方法
(1)样品采集
样品同实施例1中所用蘑菇样品。
(2)引物和探针设计
方法同实施例1和2中方法，并利用实施例1和2中筛选出的有毒蘑菇种特异性引物和探针开展数字PCR检测体系的建立。
(3)数字PCR检测体系的建立
数字PCR体系配制：20μL数字PCR反应体系：ddPCR Supermix for Probes(2×)(Bio-rad)10μL，上下游引物(10μmol/L)各为1μL，探针(10μmol/L)0.5μL，DNA模板1μL，补水至20μL。模板DNA为实施例1中特异性检测的阳性样品的DNA，灵敏度检测是将阳性样品的DNA用ddH2O分别稀释为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl的稀释样品。
数字PCR平台(Bio-rad)操作步骤：(1)将配置好的PCR反应体系转移至DG8cartridge微滴生成卡(Bio-rad)的sample孔位里，并在微滴生成卡的oil孔位内分别加入70μl的微滴生成油，注意在加样时尽量避免产生气泡。(2)将微滴生成卡盖上胶垫gasket后放入微滴生成仪中进行微滴生成。(3)结束后，用移液器将DG8 cartridge最上面一排孔内的全部微滴体系转移至96孔板内，随后用预热好的PX1热封仪对其进行封膜以防止挥发。(4)将封好膜的96孔板放置于普通PCR仪上进行扩增，反应条件为用实时荧光PCR的反应条件进行测试，再根据数字PCR扩增结果进行调整。(5)扩增反应完成后，将96孔板取出放入plate holder中，置于微滴读取仪中进行微滴荧光的读取和数据采集，随后通过分析散点图确定判定荧光阈值以确定阳性微滴和阴性微滴。(6)结果判定：如目标物种产生高于判定阈值的反应微滴，非目标物种和阴性对照产生低于判定阈值的反应微滴，则该反应体系可特异性检测目标物种，并可通过直接读取阳性微滴拷贝数可知待测样品的绝对含量。
二、研究结果
(1)数字PCR特异性扩增及灵敏度检测
环鳞鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品环鳞鹅膏中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出环鳞鹅膏(图13A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图13B)。
致命鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品致命鹅膏中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出致命鹅膏(图14A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图14B)。
异味鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品异味鹅膏中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出异味鹅膏(图15A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图15B)。
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品锥鳞白鹅膏中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出锥鳞白鹅膏(图16A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图16B)。
大青褶伞PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品大青褶伞中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出大青褶伞(图17A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图17B)。
栎裸柄伞PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品栎裸柄伞中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出栎裸柄伞(图18A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图18B)。
肉褐鳞环柄菇PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品肉褐鳞环柄菇中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出肉褐鳞环柄菇(图19A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图19B)。
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环。根据反应体系和程序，数字PCR扩增结果表明，仅有样品新苦粉孢牛肝菌中出现阳性微滴，其余样品均中均无阳性微滴，说明该引物和探针组合能特异性检测出新苦粉孢牛肝菌(图20A)；检测灵敏度可达1pg/μl(图20B)。
本研究建立了8种有毒蘑菇数字PCR检测方法，特异性强，检出下限可达1pg/μL，可实现目标物种的绝对定量检测。但数字方法目前存在设备试剂昂贵、对技术人员要求更高，推广难度较大等缺点，但本研究建立的有毒蘑菇数字PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度和准确性，能够实现含低浓度靶基因的样本中有毒蘑菇物种的精准定量检测，为有毒蘑菇精准定性定量检测提供了可行的检测技术。
实施例4应用实例
应用例1：应用实施例1、2中开发的特异性引物和探针，对采集于四川凉山民族地区的假褐云斑鹅膏和中国疾病预防控制中心的致命鹅膏样品进行常规PCR和实时荧光PCR检测，结果表明只有假褐云斑鹅膏的引物和探针对假褐云斑鹅膏样品产生特异性反应条带或扩增曲线，其他物种均无阳性反应；只有致命鹅膏的引物和探针对致命鹅膏样品产生特异性反应条带或扩增曲线，其他物种均无阳性反应；说明本发明的分子鉴定方法准确可靠。
应用例2：针对12个目标物种(环鳞鹅膏、致命鹅膏、灰褶鹅膏、爪哇鹅膏菌、异味鹅膏、小豹斑鹅膏、假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、大青褶伞、栎裸柄伞、肉褐鳞环柄菇、新苦粉孢牛肝菌)，我们准备了对应的蘑菇种类样品，每个蘑菇种类包括生鲜样品2份、水煮样品2份以及胃液模拟消化样品2份，分别用其种特异性的引物和探针进行常规PCR和实时荧光PCR(灰褶鹅膏不进行实时荧光PCR检测，其余11种有毒蘑菇进行)检测，结果均能产生特异扩增条带或扩增曲线，说明本发明的分子鉴定方法具有广泛的适用性。

Claims (10)

1.一种对有毒蘑菇进行PCR鉴定的试剂盒，其特征在于：包括用于对有毒蘑菇进行PCR分子鉴定的特异性引物，
所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；
所述有毒蘑菇对应的特异性引物如下表所列：
Figure FDA0004113458450000011
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括用于实时荧光PCR的特异性TaqMan探针，每种有毒蘑菇对应的TaqMan探针如下表所示：
种类 探针名称 探针序列(5’→3’) 假褐云斑鹅膏 A pse P ATTCGATGGACCTGCAAACTCCCAG 锥鳞白鹅膏 A vir P AGCGCAAGATGCGTTCAAGC 新苦粉孢牛肝菌 T neo P ACCATCCCAACCAACGTATGTC
。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR扩增反应所需的试剂；优选所述PCR为常规PCR或者实时荧光PCR或者数字PCR；优选所述PCR扩增反应所需的试剂为DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照。
5.一种对有毒蘑菇种类进行常规PCR鉴定的方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；
包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用权利要求1所述的试剂盒中的特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有对应目的扩增片段的样品鉴定为相应种类的有毒蘑菇；
假褐云斑鹅膏对应的扩增片段大小为380bp，
锥鳞白鹅膏对应的扩增片段大小为190bp，
新苦粉孢牛肝菌对应的扩增片段大小为240bp。
6.根据权利要求5所述的常规PCR鉴定的方法，其特征在于：
PCR反应体系为：总体积25μL，含有：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，浓度均为10μM的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为ddH2O；
假褐云斑鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35循环；72℃10min；
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；
优选所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带；
优选地，可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
7.一种对有毒蘑菇种类进行实时荧光PCR鉴定的方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自假褐云斑鹅膏、锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或多种；
包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用权利要求2所述的试剂盒对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否为对应种类的有毒蘑菇，如果Ct≤30则判断为对应种类的有毒蘑菇阳性。
8.根据权利要求7所述的实时荧光PCR鉴定的方法，其特征在于：
所述实时荧光PCR的反应体系为：总体系20μL，含有2×Premix Ex Taq 10μl，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μl，浓度为10μmol/L的探针0.5μl，ddH2O 6.5μl，DNA模板1μl；
qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环；
优选地，可检测的模板浓度可低至10-5ng/μl。
9.一种对有毒蘑菇种类进行数字PCR鉴定的方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自锥鳞白鹅膏、新苦粉孢牛肝菌中的一种或两种；
包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用权利要求2所述的试剂盒对提取的基因组DNA进行数字PCR扩增，扩增反应完成后，通过微滴读取仪进行微滴荧光的读取和数据采集，通过数据分析获得待测样品的绝对含量；
优选地，扩增反应完成后，将反应板取出置于微滴读取仪中进行微滴荧光的读取和数据采集，随后通过分析散点图确定判定荧光阈值以确定阳性微滴和阴性微滴，通过直接读取阳性微滴拷贝数即可获得待测样品的绝对含量。
10.根据权利要求9所述的数字PCR鉴定的方法，其特征在于：
数字PCR反应体系为：总体系20μL，含有2×ddPCR Supermix for Probes 10μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各为1μL，浓度为10μmol/L的探针0.5μL，DNA模板1μL，余量为ddH2O；
锥鳞白鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环；
新苦粉孢牛肝菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40循环；
优选地，所述待测样品的基因组DNA的浓度可低至1pg/μL。
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