CN114875174A - 一种快速鉴别毒红菇的lamp引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种快速鉴别毒红菇的lamp引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。本发明提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LB。本发明引物组特异性强，灵敏度高，可检测出浓度为1pg/μL的毒红菇DNA，并成功用于煮沸后的蘑菇混合物(毒红菇含量低至1％)的检测，具有快速、灵敏、特异和可视化的特点，可用于毒红菇中毒快速鉴别与溯源等。

Description

一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
毒红菇(Russula emetica)，又名呕吐红菇。菌盖直径5～9厘米，浅粉红至珊瑚红色。夏秋季在林中地上散生或群生，广泛分布于我国西南地区。毒红菇味道辛辣，食后主要引起急性胃肠炎型中毒症状。误食后1～2小时即可引起恶心、呕吐、腹泻、腹痛，肌肉抽搐，脉搏加速，严重的可因心脏衰弱或血液循环衰竭而引起死亡。毒红菇的毒性在加热烹煮的过程中能得到一定程度的消减，但仍存在较高的毒性。
野生红菇，又称为正红菇、真红菇、红椎菌，是一种珍稀野生食用菌。因其营养丰富且味道鲜美，广受消费者喜爱。野生红菇和毒红菇形态及其相似，仅凭外观形态难以鉴别，每年均有因错误分辨两种蘑菇而导致的中毒事件发生。建立快速准确的鉴定方法对毒红菇中毒的毒源鉴定与溯源具有重要意义。目前已有多种技术用于毒蘑菇的鉴定，如化学显色法、酶联免疫吸附测定、免疫层析法、液相色谱-质谱(LC-MS)联用等。不过以上方法存在或是特异性不高，或是依赖大型仪器、操作繁琐等不足之处。随着分子生物学的发展，核酸扩增技术已被应用于毒蘑菇的检测鉴定，如聚合酶链式反应(PCR)。该技术反应过程依赖温度循环仪器(PCR仪)，反应时间约2小时，只能在实验室内完成，难以满足现场速测的需求。因此，实现毒红菇的快速检测仍是本行业亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，快速准确地鉴定毒红菇，并且灵敏度高，稳定性好。
本发明提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LB；
所述正向外引物F3包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向外引物B3包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述正向内引物FIP包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述反向内引物BIP包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述环引物LB包括如SEQID No.5所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组在制备试剂盒和/或鉴别毒红菇中的应用。
本发明还提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组、LAMP缓冲液、酶反应液、具有染色作用的试剂、阳性对照和阴性对照；所述具有染色作用的试剂包括荧光染料或显色剂。
优选的，所述LAMP缓冲液包括dNTPs和MgSO4溶液；
所述酶反应液包括Bst DNA聚合酶；
所述荧光染料包括SYBR Green；
所述显色剂包括HNB或酚红。
本发明还提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP检测方法，包括如下步骤：
提取待测样品核酸，利用上述技术方案所述LAMP引物组对总DNA进行扩增反应，并进行结果判定。
优选的，所述扩增反应的反应体系以10μL计，包括：2μL核酸、5μL 2×LAMP 变色预混液、1.09μL引物混合物和余量的水。
优选的，所述核酸的浓度为0.1～10ng/μL；所述引物混合物包括：12.6～13.0μM正向内引物FIP、12.6～13.0μM反向内引物BIP、1.0～1.4μM正向外引物F3、 1.0～1.4μM反向外引物B3、6.2～6.6μM环引物LB；所述2×LAMP变色预混液包括50mM氯化钾，10mM硫酸铵，3mM七水硫酸镁，0.1％Tween-20，100μM酚红染料，0.8μL 10mM的dNTPs，0.lμL 8U/μL的Bst2.0 DNA聚合酶和余量的水。
优选的，所述扩增反应的温度为61～64℃，时间为20～45min。
优选的，所述待测样品包括蘑菇子实体、煮熟蘑菇或呕吐物；所述核酸包括基因组DNA。
优选的，所述结果判定的方法包括使用荧光PCR仪或显色剂直接判定：
当使用荧光PCR仪时，如在反应时间内出现S型扩增曲线为阳性，无S型扩增曲线则为阴性；当使用HNB显色剂时，如颜色由紫罗兰变为天蓝色为阳性，颜色保持不变为阴性；当使用酚红显色剂时，如颜色由酒红色变为黄色为阳性，颜色保持不变为阴性。
本发明提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LB；所述正向外引物F3包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向外引物B3包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述正向内引物FIP包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述反向内引物BIP包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述环引物LB包括如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明以毒红菇ITS保守序列为靶基因设计内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB，特异性强，灵敏度高，可检测出浓度为1pg/μL的毒红菇DNA，并成功用于煮沸后的蘑菇混合物(毒红菇含量低至1％)的检测，具有快速、灵敏、特异和可视化的特点，可用于毒红菇中毒快速鉴别与溯源等。
本发明通过限定引物浓度、模板量、反应温度、反应时间及其他荧光或显色试剂可以进一步提高LAMP扩增效率和反应灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1不同的引物组对毒红菇及其它红菇属物种的扩增结果，其中(a)为引物组1扩增结果，(b)为引物组2扩增结果，(c)为引物组3扩增结果；
图2为毒红菇LAMP酚红可视化法引物组特异性的检测结果，其中1：ddH2O； 2：稀褶黑红菇(Russula nigricans)；3：密褶红菇(Russula densifolia)；4：亚稀褶红菇(Russulasubnigricans)；5：日本红菇(Russula japonica)；6：铜绿红菇(Russula aeruginea)；7：菱红菇(Russula resca)；8：锥麟白鹅膏(Amanita virgineoides)；9：杵柄鹅膏(Amanitasinocitrina)；10：小豹斑鹅膏(Amanita parvipantherna)；11：灰褶鹅膏(Amanitagriseofolia)；12：球基鹅膏(Amanita subglobosa)；13：爪哇鹅膏(Amanita javanica)；14：云南白茎无环鹅膏(Amanita albidostipes)；15：淡红鹅膏(Amanita pallidorosea)；16：黄盖鹅膏(Amanita subjunquillea)；17：紫皮小红伞(Marasmius pulcherripes)；18：白假根杯伞 (Rhizocybe alba voucher)；19：大青褶伞(Chlorophyllum molybdites)；20：香菇(Lentinus edodes)；21：橙褐白环菇(Leucoagaricus tangerinus)；22：裸脚伞属(Gymnopus subnudus)；23：花脸香菇(Lepista sordida)；24：毒红菇(Russula emetica)；
图3为毒红菇LAMP实时荧光法引物组特异性的验证结果，红色曲线为毒红菇DNA模板；绿色曲线为其他22种蘑菇DNA模板；
图4为LAMP酚红可视法和实时荧光法检测毒红菇灵敏度结果，图中A：LAMP显色法的灵敏度；B：LAMP实时荧光法的灵敏度；A中从左至右1～6分别为10ng/μL的DNA按10倍梯度稀释样，即1～6DNA浓度分别为10 ng/μL-0.1pg/μL；7：ddH2O；
图5为LAMP显色法和实时荧光法在模拟样品中适用性测试结果，图中A： LAMP显色法的适用性；图中B：LAMP实时荧光法的适用性；1：毒红菇；2： 50％毒红菇+50％香菇；3：25％毒红菇+75％香菇；4：10％毒红菇+90％香菇；5： 1％毒红菇+99％香菇；6：0.1％毒红菇+99.9％香菇；7：ddH2O；
图6为LAMP HNB显色法在模拟结果样品中的适用性测试，图中1-6依次为：ddH2O、香菇、密褶红菇、25％毒红菇+75％香菇、10％毒红菇+90％香菇、 1％毒红菇+99％香菇。
具体实施方式
本发明提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LB；
所述正向外引物F3包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向外引物B3包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述正向内引物FIP包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述反向内引物BIP包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述环引物LB包括如SEQID No.5所示的核苷酸序列。
本发明SEQ ID No.1～5所示的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID No.1：5’-CTCGCGTTTTCACACAAA-3’；
SEQ ID No.2：5’-GGTGCGTTCAAAGATTCG-3’；
SEQ ID No.3：5’-GATCCGTTGTTGAAAGTTGTATTGACTTGAAGTAGTG TAGAATGTCC-3’；
SEQ ID No.4：5’-TCTTGGCTCTCGCATCGATGTGATTCACTGAATTCTG CAAT-3’；
SEQ ID No.5：5’-GCGAAATGCGATACGTAATGTG-3’。
本发明以毒红菇及其近缘种内转录间隔区(ITS)序列作为靶基因，登录号为：KM373253.1、LC008522.1、KX239489.1、KX579782.1、KX579786.1，经过毒红菇及其近缘种ITS序列同源性比对，确定种内保守、种间特异的序列片段，设计得到的上述引物组具有灵敏度高、特异性强的特点，能够用于快速检测毒红菇。
本发明还提供了上述引物组在制备试剂盒和/或鉴别毒红菇中的应用。
本发明还提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组、LAMP缓冲液、酶反应液、具有染色作用的试剂、阳性对照和阴性对照；所述具有染色作用的试剂包括荧光染料或显色剂。
在本发明中，所述LAMP缓冲液优选包括dNTPs和MgSO4溶液；所述酶反应液优选包括Bst DNA聚合酶；所述荧光染料优选包括SYBR Green；所述显色剂优选包括HNB或酚红。本发明所述荧光染料或显色剂，用于扩增反应结果的判断。
在本发明所述试剂盒中，正向内引物FIP的浓度优选为12.6～13.0μM；反向内引物BIP的浓度优选为12.6～13.0μM；正向外引物F3的浓度优选为1.0～1.4μM；反向外引物B3的浓度优选为1.0～1.4μM；环引物LB的浓度优选为6.2～6.6μM。本发明所述环引物LB能够提高DNA扩增效率，缩短扩增反应时间。
本发明所述试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点，能够通过颜色变化进行现场可视化判定，适用于毒红菇的快速鉴别。
本发明还提供一种快速鉴别毒红菇的LAMP检测方法，包括如下步骤：
提取待测样品核酸，利用上述技术方案所述LAMP引物组对总DNA进行扩增反应，并进行结果判定。
本发明提取待测样品核酸；所述待测样品优选包括蘑菇子实体、煮熟蘑菇或呕吐物。本发明所述煮熟蘑菇优选为100℃蒸煮15min后的蘑菇；所述呕吐物优选为采用人工模拟胃液进行消化后的蘑菇；所述核酸优选为基因组DNA。本发明对所述核酸的提取方式没有严格要求，常规操作即可，例如可以采用常规试剂盒提取法、CTAB法或热提法等。
本发明利用上述技术方案所述LAMP引物组对总DNA进行扩增反应，并进行结果判定。本发明所述扩增反应的反应体系以10μL计，优选包括：2μL的核酸、5μL的2×LAMP变色预混液、1.09μL引物混合物和余量的水。
在本发明中，所述核酸的浓度优选为0.1～10ng/μL，进一步优选为0.5～5ng/μL，更优选为1～4ng/μL，最优选为2～3ng/μL；所述引物混合物优选包括：12.6～13.0μM 正向内引物FIP、12.6～13.0μM反向内引物BIP、1.0～1.4μM正向外引物F3、 1.0～1.4μM反向外引物B3、6.2～6.6μM环引物LB；所述2×LAMP变色预混液优选包括50mM氯化钾，10mM硫酸铵，3mM七水硫酸镁，0.1％Tween-20，100μM 酚红染料，0.8μL 10mM的dNTPs，0.lμL 8U/μL的Bst2.0 DNA聚合酶和余量的水。
在本发明中，所述扩增反应的温度优选为61～64℃，进一步优选为62～63℃；所述扩增反应的时间优选为20～45min，进一步优选为25～40min，更优选为 30～35min。
在本发明中，所述结果判定的方法优选包括使用荧光PCR仪或根据颜色变化直接判定：当使用荧光PCR仪时，如在反应时间内出现S型扩增曲线为阳性，无S型扩增曲线则为阴性；当使用HNB显色剂，颜色由紫罗兰变为天蓝色为阳性，颜色保持不变为阴性；当使用酚红显色剂，颜色由酒红色变为黄色为阳性，颜色保持不变为阴性。
本发明检测方法具有快速准确、灵敏度高、稳定性好等特点，在具体检测过程中，通过合适的引物浓度、模板量、反应温度、反应时间及其他荧光或显色试剂可以提高LAMP扩增效率和反应灵敏度。实施例结果表明本发明所述检测方法最低可检测出1pg毒红菇基因组DNA，可用于煮熟蘑菇及呕吐物样品等，检出水平为1％，检测时间为30～45min。检测结果可通过荧光PCR仪或颜色变化直接判定。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、试剂盒及检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据NCBI GeneBank中收录的毒红菇ITS序列，包括中间含5.8S rDNA的 ITS序列，从上述数据库中下载10个所述毒红菇ITS序列，并下载与毒红菇均属红菇属的亚稀褶红菇(R.subnigricans)、日本红菇(R.japonica)、密褶红菇 (R.densifolia)、短柄红菇(R.brevipes)、稀褶黑菇(R.nigricans)、铜绿红菇(R.aeruginea)和臭黄菇(R.foetens)的ITS序列，以上7个物种中包括了与毒红菇形态上和序列上相似的种，经过序列同源性比对，确定种内保守、种间特异的序列片段，以此保证毒红菇引物的特异性，根据所确定的序列片段设计LAMP扩增引物。考虑到环引物的存在可以提高扩增反应的速率，本发明设计了3个引物组，每个引物组包括一对内引物(FIP/BIP)、一对外引物(F3/B3) 和环引物(LF/LB)，序列见表1。
表1毒红菇LAMP引物序列
Figure BDA0003717253740000061
Figure BDA0003717253740000071
实施例2-1
以实施例1中引物组1为扩增引物，将外引物(F3/B3)、内引物(FIP/BIP)、环引物(LB)每个都稀释到10μM，接着按照F3、B3、FIP、BIP和LB的体积比为1.5:1.5:16:16:16的体积比混合，得到引物混合液。以LAMP反应总体积为 10μL计，包括5μL的LAMP预混液(由DNA聚合酶、碱基和MgSO4缓冲液组成)；1.09μL引物混合物；2μL毒红菇(Russula emetica)基因组DNA模板(热解法获得，浓度为10ng/μL)；1μL的SYB Green荧光染料；加ddH2O补足至 10μL，所有试剂置于0.2mL离心管，将混合好的体系充分涡旋混匀。LAMP反应在荧光定量PCR仪中进行，条件设置为62℃，每45s收集一次荧光信号，共反应50个循环。反应结果通过扩增S型曲线判断是否发生扩增反应。
实施例2-2
同实施例2-1，区别在于将毒红菇(Russula emetica)替换为稀褶黑红菇(Russula nigricans)。
实施例2-3
同实施例2-1，区别在于将毒红菇(Russula emetica)替换为密褶红菇(Russuladensifolia)。
实施例2-4
同实施例2-1，区别在于将毒红菇(Russula emetica)替换为日本红菇(Russulajaponica)。
实施例2-5
同实施例2-1，区别在于将毒红菇(Russula emetica)替换为铜绿红菇(Russulaaeruginea)。
实施例2-6
同实施例2-1，区别在于将毒红菇(Russula emetica)替换为菱红菇(Russularesca)。
对比例1-1
同实施例2-1，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组2。
对比例1-2
同实施例2-2，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组2。
对比例1-3
同实施例2-3，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组2。
对比例1-4
同实施例2-4，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组2。
对比例1-5
同实施例2-5，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组2。
对比例1-6
同实施例2-6，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组2。
对比例2-1
同实施例2-1，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组3。
对比例2-2
同实施例2-2，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组3。
对比例2-3
同实施例2-3，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组3。
对比例2-4
同实施例2-4，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组3。
对比例2-5
同实施例2-5，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组3。
对比例2-6
同实施例2-6，区别在于将引物组1替换为实施例1中的引物组3。
测试例1
实施例2-1～2-6、对比例1-1～1-6与对比例2-1～2-6中S型曲线扩增结果如图1所示。图1中(a)为利用引物组1进行扩增的结果；(b)为利用引物组2 进行扩增的结果；(c)为利用利用引物组3进行扩增的结果。
根据图1可以看出，利用引物组1进行扩增时，仅出现一条扩增曲线，且对应的检测样品为毒红菇DNA，引物组1能够特异性的扩增毒红菇(Russula emetica)，且未扩增其他红菇属的蘑菇；引物组2出现多条扩增曲线，包括毒红菇、稀褶黑红菇、密褶红菇、日本红菇以及铜绿红菇等，引物组2对毒红菇的特异性不强；引物组3不能扩增任何红菇属。因此，本发明引物组1为毒红菇的特异引物组。
实施例3
1、样品：毒红菇(Russula emetica)、稀褶黑红菇(Russula nigricans)、密褶红菇(Russula densifolia)、亚稀褶红菇(Russula subnigricans)、日本红菇(Russulajaponica)、铜绿红菇(Russula aeruginea)、菱红菇(Russula resca)、锥麟白鹅膏(Amanita virgineoides)、杵柄鹅膏(Amanita sinocitrina)、小豹斑鹅膏(Amanitaparvipantherna)、灰褶鹅膏(Amanita griseofolia)、球基鹅膏 (Amanita subglobosa)、爪哇鹅膏(Amanita javanica)、云南白茎无环鹅膏 (Amanita albidostipes)、淡红鹅膏(Amanita pallidorosea)、黄盖鹅膏(Amanita subjunquillea)、紫皮小红伞(Marasmiuspulcherripes)、白假根杯伞(Rhizocybe alba voucher)、大青褶伞(Chlorophyllummolybdites)、香菇(Lentinus edodes)、橙褐白环菇(Leucoagaricus tangerinus)、裸脚伞属(Gymnopus subnudus)和花脸香菇(Lepista sordida)23种蘑菇样本采集烘干后，通过ITS测序进行物种鉴定后保存-20℃。
2、提取待测样品DNA
采用热提法(100℃水中煮沸15min)分别提取步骤1中样品总DNA。
3、LAMP方法的优化与建立
为实时监测不同反应条件下LAMP的进展情况，反应条件的优化借助荧光PCR仪进行，主要对反应的引物浓度、反应时间等进行优化。
4、LAMP试剂盒的组装
(1)试剂盒包括：实施例1毒红菇LAMP引物组1、LAMP缓冲液(由dNTPs、MgSO4溶液、氯化钾、硫酸铵、Tween-20组成)、酶反应液(Bst2.0 DNA聚合酶)、酚红染料、阳性对照和阴性对照等。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。规格及数量96T/盒。
(2)试剂盒包括：实施例1毒红菇LAMP引物组1、LAMP缓冲液(由dNTPs、 MgSO4溶液、氯化钾、硫酸铵、Tween-20组成)、酶反应液(Bst2.0 DNA聚合酶)、HNB染料、阳性对照和阴性对照等。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。规格及数量96T/盒。
(3)试剂盒包括：实施例1毒红菇LAMP引物组1、LAMP缓冲液(由dNTPs、 MgSO4溶液、氯化钾、硫酸铵、Tween-20组成)、酶反应液(Bst2.0 DNA聚合酶)、SYB Green荧光染料、阳性对照和阴性对照等。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。规格及数量96T/盒
实施例4
特异性测试
1、基于可视化染料的LAMP引物特异性测试
具体方法：将实施例1中引物组1中的每个引物都稀释到10μM，接着按照 3：32：16的体积比混合，得到引物混合液。LAMP反应总体积为10μL计，由如下组分组成：5μL的2×LAMP变色预混液(由氯化钾50mM，硫酸铵10mM，七水硫酸镁3mM，0.1％Tween-20，100μM酚红染料，0.8μL dNTPs(10mM)， 0.lμL Bst2.0 DNA聚合酶(8U/μL))；1.09μL引物混合物；2μL基因组DNA 模板(通过热解法(100℃煮沸15min)获得)；加ddH2O补足至10μL。所有试剂添加于0.2mL离心管，将混合好的体系充分涡旋混匀，放入62℃的水浴锅中，反应45min。反应结束后取出透明离心管，至于白色或浅色纯色背景下观察颜色变化，由于体系中含有酚红染料，因此随着反应的进行，体系颜色因pH的改变而发生变化。当存在毒红菇基因组DNA时，对于酚红反应体系由酒红色变为黄色，反之则保持酒红色不变；
本实施例按照上述具体方法设置了以毒红菇DNA为模板的阳性对照；以 ddH2O为模板的空白对照；以稀褶黑红菇(Russula nigricans)、密褶红菇(Russula densifolia)、亚稀褶红菇(Russula subnigricans)、日本红菇(Russula japonica)、铜绿红菇(Russulaaeruginea)、菱红菇(Russula resca)、锥麟白鹅膏(Amanita virgineoides)、杵柄鹅膏(Amanita sinocitrina)、小豹斑鹅膏(Amanita parvipantherna)、灰褶鹅膏(Amanitagriseofolia)、球基鹅膏(Amanita subglobosa)、爪哇鹅膏(Amanita javanica)、云南白茎无环鹅膏(Amanita albidostipes)、淡红鹅膏(Amanita pallidorosea)、黄盖鹅膏(Amanita subjunquillea)、紫皮小红伞(Marasmius pulcherripes)、白假根杯伞(Rhizocybe alba voucher)、大青褶伞(Chlorophyllum molybdites)、香菇(Lentinusedodes)、橙褐白环菇 (Leucoagaricus tangerinus)、裸脚伞属(Gymnopus subnudus)和花脸香菇(Lepista sordida)22个物种DNA为模板的阴性对照，其中包括形态上与毒红菇相似的红菇属蘑菇、其他毒蘑菇和可食蘑菇等，DNA提取方式按照实施例3进行，染色结果如图2所示。
根据图2可以看出，在酚红显色法中，仅有毒红菇的检测结果出现了颜色变化，其他蘑菇物种的检测结果没有发生颜色变化，本发明引物组1特异性好。
2、基于实时荧光的LAMP引物特异性测试
具体方法：根据步骤1中所述方法，采用相同的LAMP引物混合比例，LAMP 反应总体积为10μL，包括：5μL的LAMP预混液；1.09μL引物混合物；2μL基因组DNA模板；1μL的SYBGreen荧光染料；加ddH2O补足至10μL，所有试剂置于0.2mL离心管，将混合好的体系充分涡旋混匀。LAMP反应在荧光定量 PCR仪中进行，条件设置为62℃，每45s收集一次荧光信号，共反应50个循环 (反应时间37.5min)。反应结果通过扩增S型曲线判断是否发生扩增反应，通过Ct值选择最佳扩增时间。
本实施例按照上述具体方法设置了以毒红菇DNA为模板的阳性对照；以 ddH2O为模板的空白对照；以实施例3中其他23个物种DNA为模板的阴性对照，其中包括形态上与毒红菇相似的红菇属蘑菇、其他毒蘑菇和可食蘑菇等，染色结果如图3所示。
根据图3可以看出，在实时荧光PCR法中，仅有毒红菇的检测结果出现了扩增曲线，其他蘑菇物种的检测结果没有出现扩增曲线，本发明引物组1特异性好。
实施例5
灵敏性测试
1、基于可视化染料的LAMP体系灵敏度测试
具体方法：将毒红菇基因组DNA按10倍梯度稀释，具体为10ng/μL、1ng/μL、 100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL和0.1pg/μL，依次标记为1～6号；最后设以ddH2O 为模板的空白对照(记为7号)。按照实施例4中步骤1中所述的引物混合比例和LAMP反应体系进行等温扩增，观察反应结果，结果如图4中A所示。根据图4中A可以看出，1～5的反应管中颜色均发生了改变，由粉红色转变为黄色，在酚红显色法中毒红菇DNA检出限为1pg。
2.基于实时荧光的LAMP体系灵敏度测试
具体方法：参考实施例5步骤1中所述毒红菇基因组DNA系列浓度，按照实施例4步骤2中所述的引物混合比例和LAMP反应体系进行实时荧光等温扩增，观察反应结果，结果如图4中B所示。根据图4中B可以看出，1～5的反应管中出现了扩增曲线，在实时荧光检测方法中毒红菇DNA检出限为1pg。
实施例6
模拟样品的检测
(1)为验证本发明毒红菇LAMP试剂盒的适用性，本实施例模拟了常见的蘑菇的加工过程。参考实施例4中的两种LAMP检测体系及方法，对水煮后的毒红菇与香菇的混合物进行检测，具体的：将毒红菇和香菇按照1：0、1：1、1： 3、1：9、1：99和0.1：99.9的质量比混合，制成毒红菇与香菇混合物(依次记为1～6号样品)，ddH2O作为空白对照(记为7号样品)。将上述毒红菇混合物置于100℃水中煮沸15min，煮沸后的混合液离心，取上清稀释10倍，采用实施例3步骤4中(1)涉及的LAMP显色试剂盒进行扩增检测，扩增体系和方法如实施例4步骤1，颜色变化结果如图5中A所示。根据图5中A可以看出， 1～5样品反应体系颜色由酒红色变为黄色，6号样品未变色，表明LAMP显色法检出限为1％毒红菇的混合物。
(2)同步骤(1)，区别在于采用实施例3步骤4中(3)涉及的试剂盒进行扩增检测，结果如图5中B所示。根据图5中B可以看出，1～5号反应管中出现了扩增曲线，6号未扩增曲线，表明本发明实时荧光检测方法检出限为1％毒红菇的混合物。
(3)同步骤(1)，区别在于将毒红菇和香菇按照质量比1：3、1：9和1： 99混合，制成毒红菇与香菇混合物(依次记为4～6号样品)，ddH2O作为空白对照(记为1号样品)，香菇为阴性样品1(记为2号样品)，密褶红菇为阴性样品2(记为3号样品)，采用实施例3步骤4中(2)涉及的LAMP显色试剂盒进行扩增检测，颜色变化结果如图6所示。根据图6可以看出，4～6样品反应体系颜色由紫罗兰变为天蓝色，结合上述结论表明LAMP显色法检出限为1％毒红菇的混合物。
根据上述实施例可以看出，本发明针对毒红菇的特异性LAMP引物，建立了可视化LAMP检测方法及试剂盒产品，可以在45min内准确的检测出毒红菇，检测结果可直接通过肉眼观察，适用于现场快速检测。所述引物特异性强，灵敏度高，可检测出浓度为1pg/μL的毒红菇DNA，并成功用于煮沸后的蘑菇混合物(毒红菇含量低至1％)的检测，具有快速、灵敏、特异和可视化的特点，可用于毒红菇中毒快速鉴别与溯源等。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgcgtttt cacacaaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgcgttca aagattcg 18
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatccgttgt tgaaagttgt attgacttga agtagtgtag aatgtcc 47
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttggctct cgcatcgatg tgattcactg aattctgcaa t 41
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgaaatgcg atacgtaatg tg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaccttgaa gcgagctcc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcacccgat ttgaggtcaa 20
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcgccaaa aatccaagac gtttagtggg gtctgcattg tc 42
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgacaacga tggtgttccg gtggtttgtt tcgtgggtca ag 42
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgccgatttt tcggtgggag g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaatctggt ggcctttggt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttcaccaccc attttgagct 20
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctcaccctc tatgacgctc cagagaagtg tcttccgcgc 40
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atcccgtctt tggcacggat cgcattccca aacaactcga c 41
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggagacttg tgcacggtcc a 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggtgcttct gtgatgcgct 20

Claims (10)

1.一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组，其特征在于，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LB；
所述正向外引物F3包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向外引物B3包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述正向内引物FIP包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述反向内引物BIP包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述环引物LB包括如SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的引物组在制备试剂盒和/或鉴别毒红菇中的应用。
3.一种快速鉴别毒红菇的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组、LAMP缓冲液、酶反应液、具有染色作用的试剂、阳性对照和阴性对照；所述具有染色作用的试剂包括荧光染料或显色剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP缓冲液包括dNTPs和MgSO4溶液；
所述酶反应液包括Bst DNA聚合酶；
所述荧光染料包括SYBR Green；
所述显色剂包括HNB或酚红。
5.一种快速鉴别毒红菇的LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样品核酸，利用权利要求1所述LAMP引物组对总DNA进行扩增反应，并进行结果判定。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述扩增反应的反应体系以10μL计，包括：2μL核酸、5μL 2×LAMP变色预混液、1.09μL引物混合物和余量的水。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述核酸的浓度为0.1～10ng/μL；所述引物混合物包括：12.6～13.0μM正向内引物FIP、12.6～13.0μM反向内引物BIP、1.0～1.4μM正向外引物F3、1.0～1.4μM反向外引物B3、6.2～6.6μM环引物LB；所述2×LAMP变色预混液包括50mM氯化钾，10mM硫酸铵，3mM七水硫酸镁，0.1％Tween-20，100μM酚红染料，0.8μL10mM的dNTPs，0.lμL 8U/μL的Bst2.0 DNA聚合酶和余量的水。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述扩增反应的温度为61～64℃，时间为20～45min。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品包括蘑菇子实体、煮熟蘑菇或呕吐物；所述核酸包括基因组DNA。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述结果判定的方法包括使用荧光PCR仪或显色剂直接判定：
当使用荧光PCR仪时，如在反应时间内出现S型扩增曲线为阳性，无S型扩增曲线则为阴性；当使用HNB显色剂时，如颜色由紫罗兰变为天蓝色为阳性，颜色保持不变为阴性；当使用酚红显色剂时，如颜色由酒红色变为黄色为阳性，颜色保持不变为阴性。
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