CN113943828A - 基于lamp快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

基于lamp快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法，其中引物组合物包括：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和环引物LB。该LAMP引物组合物、试剂盒及方法，具有很强的特异性，能够快速、准确、灵敏、方便地检测样品是否为有毒的日本红菇，与老百姓平时采食的美味红菇易于区分，可以满足基层疾控和医疗单位对蘑菇中毒后快速鉴定毒源的要求，对病人进行有效救治，避免医疗资源的过度浪费。

Description

基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物、试剂盒 及方法
技术领域
本发明属于有毒生物的快速检测技术领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测有毒红菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法。
背景技术
日本红菇(Russula japonica)在分类上隶属于担子菌门(Basidiomycota)、蘑菇纲(Agaricomycetes)、红菇目(Russulales)、红菇科(Russulaceae)、红菇属(Russula)。日本红菇为该属最易被老百姓误食的物种，与老百姓平时采食的美味红菇极为相近，无法通过生活经验进行鉴别区分。据2019年及2020年中国疾病防控与预防中心蘑菇中毒年度调查报告显示，根据中毒案例鉴定出56种导致胃肠炎症状的物种，日本红菇导致的中毒案例分布广泛，发病率高，共导致289人中毒，且中毒案例数连年高居第二。
LAMP是日本科学家Notomi发明的一种具高特异性、高效性的核酸扩增技术。对靶基因的6个特异部位设计2对特殊引物(1对内引物FIP和BIP，1对外引物F3和B3)利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶于等温条件下(60-65℃)反应30min～60min催化新链合成，实现靶DNA 109-1010倍的扩增。反应操作简单耗时短，无需昂贵复杂的仪器，适用于现场检测。
然而，目前国内外还没有关于有毒红菇日本红菇快速检测的报道与专利。因此，开发一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法，对于本技术领域具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种基于环介导等温扩增(LAMP)技术、快速检测有毒红菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法，适用于现场即时检测，实现了日本红菇的可视化快速检测。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物，包括：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和环引物LB；碱基序列如下：
FIP：5’-AGCTGGCTTTGAGAGGAAAGCTAATGGTTTCTTGATCAAGAAGGC-3’(由SEQ ID NO:1所示)；
BIP：5’-TAGTAGGGTCTACTTTGCTGATCCTATAGGTTTGCAAAAGCCCAAG-3’(由SEQ ID NO:2所示)；
F3：5’-TGTCGTGATATCTTCAACCTT-3’(由SEQ ID NO:3所示)；
B3：5’-AGTCTCTGACGAGACAGTT-3’(由SEQ ID NO:4所示)；
LB：5’-AGCAAAAGCCTCCAAATTCCAA-3’(由SEQ ID NO:5所示)。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的试剂盒，包含上述的引物组合物。
上述的试剂盒，进一步的，包含：10μM正向内引物FIP、10μM反向内引物BIP、10μM正向外引物F3、10μM反向外引物B3和10μM环引物LB。
再进一步的，还包含：pH＝8.8的10×ThermoPol buffer、100mM MgSO4、10mM dNTPMix、8000U/mLBst DNAPolymeras和3mM HNB。
更进一步的，所述试剂盒的反应体系为10μL，包括：1μLpH＝8.8的10×ThermoPolbuffer、0.4μL浓度为100mM的MgSO4、1.4μL浓度为10mM each的dNTP Mix、0.4μL浓度为8000U/mL的Bst DNAPolymerase、0.6μL浓度为8000U/mL的HNB、1μL浓度为1-10ng/μL的DNA模板、LAMP引物，双蒸水定容；
其中LAMP引物包括：0.12μL浓度为10μM的正向内引物FIP、0.12μL浓度为10μM的10μM反向内引物BIP、1.28μL浓度为10μM的10μM正向外引物F3、1.28μL浓度为10μM的反向外引物B3和0.64μL浓度为10μM的环引物LB。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的方法，包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为DNA模板、上述的引物组合物为引物，进行LAMP反应。
上述的方法，进一步的，所述LAMP反应的体系为10μL，包括：1μL pH＝8.8的10×ThermoPol buffer、0.4μL浓度为100mM的MgSO4、1.4μL浓度为10mM each的dNTP Mix、0.4μL浓度为8000U/mL的Bst DNAPolymerase、0.6μL浓度为8000U/mL的HNB、1μL浓度为1-10ng/μL的DNA模板、LAMP引物，双蒸水定容；
其中LAMP引物包括：0.12μL浓度为10μM的正向内引物FIP、0.12μL浓度为10μM的10μM反向内引物BIP、1.28μL浓度为10μM的10μM正向外引物F3、1.28μL浓度为10μM的反向外引物B3和0.64μL浓度为10μM的环引物LB。
再进一步的，所述LAMP反应的程序为：将反应试剂添加完成后加入石蜡油进行封层，离心混匀后60-65℃(更优选62℃)水浴或金属浴30min～60min，然后在80℃以上孵育至少10min。
更进一步的，终止LAMP反应后，根据反应液颜色变化判断检测结果，若反应液呈蓝色，则表示检测结果为阳性；若反应液呈紫色，则表示检测结果为阴性。
更进一步的，终止LAMP反应后，根据凝胶电泳平行实验是否检出阶梯型条带判断检测结果，若检测到阶梯型条带，则表示检测结果为阳性；若未检测到阶梯型条带，则表示检测结果为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的LAMP引物组合物和试剂盒具有很强的特异性，能够快速、准确、灵敏、方便地检测样品是否为有毒的日本红菇，与老百姓平时采食的美味红菇易于区分，可以满足基层疾控和医疗单位对蘑菇中毒后快速鉴定毒源的要求，对病人进行有效救治，避免医疗资源的过度浪费。
2、本发明的方法，可根据反应液颜色变化判断检测样品是否含有日本红菇，实现了日本红菇的可视化快速检测，且反应操作简单耗时短，无需昂贵复杂的仪器，适用于现场检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是日本红菇LAMP法HNB染色检测图；
图2是日本红菇LAMP法琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物，包括：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和环引物LB；碱基序列如下：
FIP：5’-AGCTGGCTTTGAGAGGAAAGCTAATGGTTTCTTGATCAAGAAGGC-3’(由SEQ ID NO:1所示)；
BIP：5’-TAGTAGGGTCTACTTTGCTGATCCTATAGGTTTGCAAAAGCCCAAG-3’(由SEQ ID NO:2所示)；
F3：5’-TGTCGTGATATCTTCAACCTT-3’(由SEQ ID NO:3所示)；
B3：5’-AGTCTCTGACGAGACAGTT-3’(由SEQ ID NO:4所示)；
LB：5’-AGCAAAAGCCTCCAAATTCCAA-3’(由SEQ ID NO:5所示)。
日本红菇等红菇属材料于野外采集所得，标本馆藏于湖南师范大学生命科学学院真菌标本馆(Mycological Hebarium of Hunan Normal University,MHHNU)。
日本红菇LAMP等温快速检测的具体操作步骤如下：
A.待检红菇属物种DNA的提取
野外采集红菇属物种标本，通过Fungal DNAKit(OMEGABio-Tek，美国)获取包括日本红菇在内的16种红菇属材料的DNA，-20℃保存以供检测使用。DNA提取方式包括但不限于使用此试剂盒提取。待检材料如表1所示：
表1：红菇属材料来源
Figure BDA0003313231880000041
Figure BDA0003313231880000051
B.日本红菇的特异性LAMP引物的设计
通过生信软件BioEdit进行日本红菇等红菇序列的比对，选取序列特异性区域通过PrimerExplorerV5设计LAMP引物FIP、BIP、F3、B3，并根据序列特点设计环引物LB加速反应速率，引物序列如下所示：
F3：5’-TGTCGTGATATCTTCAACCTT-3’；
B3：5’-AGTCTCTGACGAGACAGTT-3’；
FIP：5’-AGCTGGCTTTGAGAGGAAAGCTAATGGTTTCTTGATCAAGAAGGC-3’；
BIP:5’-TAGTAGGGTCTACTTTGCTGATCCTATAGGTTTGCAAAAGCCCAAG-3’；
LB:5’-AGCAAAAGCCTCCAAATTCCAA-3’。
C.可视化LAMP体系的建立
将LAMP的反应体系(10μL)加入高温灭菌的离心管中，包括：1μL 10×ThermoPolbuffer(PH＝8.8)、0.4μL MgSO4(100mM)、1.4μL dNTP Mix(10mM each)、0.12μL外引物F3/B3(10μM)、1.28μL内引物FIP/BIP(10μM)、0.64μL环引物LB(10μM)、0.4μL Bst DNAPolymerase(8000U/mL)、0.6μLHNB(3mM)、1μLDNA(1-10ng/μL)，补充高温灭菌的ddH2O至反应体系为10μL。应在将上述反应试剂添加完成后加入20-30μL高温灭菌的石蜡油进行封层，离心混匀后62℃水浴或金属浴30min～60min进行日本红菇特异性DNA序列扩增，然后80℃孵育10min使Bst DNAPolymerase失活，终止LAMP反应。
D.HNB可视化检测
HNB是一种金属离子指示剂，也可指示pH值，可在LAMP反应发生前加入反应体系中，且不对反应产生抑制。在反应前，体系呈紫罗兰色，一旦发生LAMP扩增，反应体系中的Mg2+与析出的P2O7 4-生成Mg2O7P2沉淀，游离Mg2+减少，pH值改变，反应体系呈天蓝色。若未发生特异性LAMP扩增，则体系仍呈紫罗兰色。
通过HNB染色法实现可视化体系的建立。若反应液呈蓝色(天蓝色)，则表示检测结果为阳性(检测到日本红菇)；若反应液呈紫色(紫罗兰色)，则表示检测结果为阴性(未检测到日本红菇)。
检测结果如图1所示，编号为1-3的样本的反应液呈天蓝色，鉴定其为日本红菇；编号为4-19的样本的反应液呈紫罗兰色，鉴定其不是日本红菇。
E.凝胶电泳检测
为增强LAMP反应的可信度，通过凝胶电泳平行实验进行检测。若检测到阶梯型条带，则表示检测结果为阳性(检测到日本红菇)；若未检测到阶梯型条带(未检测到日本红菇)，则表示检测结果为阴性(未检测到日本红菇)。
检测结果如图2所示，编号为1-3的样本检测到阶梯型条带(为150-190bp左右片段的倍数排列)，鉴定其为日本红菇；编号为4-19的样本未检测到阶梯型条带，鉴定其不是日本红菇。该结果与HNB可视化检测结果一致，说明本发明的LAMP引物和试剂盒具有很强的特异性，能够快速、准确、灵敏、方便地检测样品是否含有日本红菇。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物、试剂盒及方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtcgtgata tcttcaacct t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtctctgac gagacagtt 19
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctggcttt gagaggaaag ctaatggttt cttgatcaag aaggc 45
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagtagggtc tactttgctg atcctatagg tttgcaaaag cccaag 46
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaaaagcc tccaaattcc aa 22

Claims (10)

1.一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物，其特征在于，包括：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和环引物LB；碱基序列如下：
FIP：5’-AGCTGGCTTTGAGAGGAAAGCTAATGGTTTCTTGATCAAGAAGGC-3’；
BIP：5’-TAGTAGGGTCTACTTTGCTGATCCTATAGGTTTGCAAAAGCCCAAG-3’；
F3：5’-TGTCGTGATATCTTCAACCTT-3’；
B3：5’-AGTCTCTGACGAGACAGTT-3’；
LB：5’-AGCAAAAGCCTCCAAATTCCAA-3’。
2.一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的引物组合物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包含：10mM正向内引物FIP、10μM反向内引物BIP、10μM正向外引物F3、10μM反向外引物B3和10μM环引物LB。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含：pH＝8.8的10×ThermoPolbuffer、100mM MgSO4、10mM dNTPMix、8000U/mLBst DNAPolymeras和3mM HNB。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为10μL，包括：1μLpH＝8.8的10×ThermoPol buffer、0.4μL浓度为100mM的MgSO4、1.4μL浓度为10mM each的dNTP Mix、0.4μL浓度为8000U/mL的Bst DNAPolymerase、0.6μL浓度为8000U/mL的HNB、1μL浓度为1-10ng/μL的DNA模板、LAMP引物，双蒸水定容；
其中LAMP引物包括：0.12μL浓度为10μM的正向内引物FIP、0.12μL浓度为10μM的10μM反向内引物BIP、1.28μL浓度为10μM的10μM正向外引物F3、1.28μL浓度为10μM的反向外引物B3和0.64μL浓度为10μM的环引物LB。
6.一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为DNA模板、如权利要求1所述的引物组合物为引物，进行LAMP反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述LAMP反应的体系为10μL，包括：1μLpH＝8.8的10×ThermoPol buffer、0.4μL浓度为100mM的MgSO4、1.4μL浓度为10mM each的dNTP Mix、0.4μL浓度为8000U/mL的Bst DNAPolymerase、0.6μL浓度为8000U/mL的HNB、1μL浓度为1-10ng/μL的DNA模板、LAMP引物，双蒸水定容；
其中LAMP引物包括：0.12μL浓度为10μM的正向内引物FIP、0.12μL浓度为10μM的10μM反向内引物BIP、1.28μL浓度为10μM的10μM正向外引物F3、1.28μL浓度为10μM的反向外引物B3和0.64μL浓度为10μM的环引物LB。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述LAMP反应的程序为：将反应试剂添加完成后加入石蜡油进行封层，离心混匀后60-65℃水浴或金属浴30min～60min，然后在80℃以上孵育至少10min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，终止LAMP反应后，根据反应液颜色变化判断检测结果，若反应液呈蓝色，则表示检测结果为阳性；若反应液呈紫色，则表示检测结果为阴性。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，终止LAMP反应后，根据凝胶电泳平行实验是否检出阶梯型条带判断检测结果，若检测到阶梯型条带，则表示检测结果为阳性；若未检测到阶梯型条带，则表示检测结果为阴性。
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罗宏: "毒蘑菇的组学研究", 《菌物学报》, no. 12, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 37 - 48 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114875174A (zh) * 2022-06-28 2022-08-09 上海市农业科学院 一种快速鉴别毒红菇的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN114875174B (zh) * 2022-06-28 2023-07-07 上海市农业科学院 一种快速鉴别毒红菇的lamp引物组、试剂盒及检测方法

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