CN117511934A - 基于sod2的辣椒炭疽病lamp检测引物、快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法，所述引物以SOD2基因为靶基因。本发明的实施不仅丰富了LAMP检测的靶标基因，且实验表明SOD2基因在LAMP中的检测灵敏度较ITS基因更具优势。

Description

基于SOD2的辣椒炭疽病LAMP检测引物、快速检测方法

技术领域

本发明涉及辣椒炭疽病菌检测方法技术领域，尤其涉及快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

辣椒炭疽病是辣椒的主要病害，可导致辣椒减产。辣椒炭疽病不仅危害生长期的辣椒果实和茎叶，还能在采后贮运过程中持续腐坏果实，导致辣椒的产量和品质严重下降。引起辣椒炭疽病的病原菌属于类别复杂、种类繁多的半知菌亚门炭疽菌属Colletotrichum。田间辣椒炭疽病的快速检测对合理、高效施用化学药剂具有重要指导作用。

目前，辣椒炭疽病菌（Colletotrichum scovillei）的检测主要是通过分离培养病原菌，然后进行形态学特征鉴定和致病性测定结果，该方法对专业技术要求比较高，且存在一定的不确定性，程序繁琐、周期长。虽然基因测序的分析方法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但基层实验室大多不具备基因测序的条件，通常需要把DNA样品或PCR扩增片段提交给专门的测序公司进行检测，且获得测序结果以后，还需要对序列进行比对或生物信息学分析，检测过程所需时间较长，检测成本较高，无法满足快速检测的需求，更不适宜基层检验检疫部门在田间应用。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新的核酸扩增技术，具有操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，更适合于基层检验检疫部门开展工作，具有极为广泛的应用前景。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。目前，分子检测最常用的靶基因有核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed space, ITS)，但单一的靶标基因无法进一步提升检测的灵敏度。本项目根据前期的文献和blast序列比对分析，选择了超氧化物歧化酶2 (Superoxide dismutase 2, SOD2) 基因作为分子鉴定的靶标基因。本发明的实施不仅丰富了LAMP检测的靶标基因，且实验表明SOD2基因在LAMP中的检测灵敏度较ITS基因更具优势。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种辣椒炭疽病的LAMP检测靶标SOD2及其检测引物、快速检测方法，该方法检测速度快、操作简单、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。本发明基于环介导等温扩增 (LAMP) 技术原理，选取辣椒炭疽病菌超氧化物歧化酶2基因序列为检测靶标，在超氧化物歧化酶2基因序列的6个区域设计了上述6条特异性引物SOD2-F3、SOD2-B3、SOD2-FIP、SOD2-BIP、SOD2-LF和SOD2-LB，并且通过对反应体系和反应条件的优化，建立以HNB为显色指示剂的辣椒炭疽病菌可视化LAMP检测技术。上述三对引物的特异性高，只要6个区域中任一区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。并且，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强，且无需贵重仪器设备，适用于田间辣椒炭疽病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对辣椒炭疽病及时有效的防治具有重要的意义，同时为检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。相对于现有LAMP扩增普遍采用2对引物(F3、B3、FIP和BIP)进行环介导等温扩增，本申请增设的一对环引物LF和LB，不仅可以有效提高扩增效率，还能缩短反应时间。

首要目的在于提供快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP引物，该引物由一对外引物SOD2-F3和SOD2-B3、一对内引物SOD2-FIP和SOD2-BIP以及一对环引物SOD2-LF和SOD2-LB组成。其中，外引物SOD2-F3如SEQ ID No .1所示，外引物SOD2-B3如SEQ ID No .2所示，内引物SOD2-FIP如SEQ ID No .3所示，内引物SOD2-BIP如SEQ ID No .4所示，环引物SOD2-LF如SEQ ID No .5所示，环引物SOD2-LB如SEQ ID No .6所示。

本发明的另一目的在于提供一种辣椒炭疽病菌的LAMP检测试剂盒，其包括如上所述的LAMP引物。使用时，操作人员自行提供检测所需要的LAMP反应体系的其他试剂即可。

进一步的，为了提高LAMP检测试剂盒的完整性，减少操作人员的准备工作，所述试剂盒还包括：预混反应缓冲液、反应酶液、引物缓冲液、羟基萘酚蓝染液。可根据体系大小，选用适量的各种溶液配制反应体系，用于对样品进行辣椒炭疽病菌的检测。

进一步地，上述试剂盒还可包括：甜菜碱。为了进一步增强扩增反应效果，在试剂盒中增加甜菜碱。甜菜碱 (Betaine) 作为高性能的PCR增强剂，可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶的从模板DNA中解离、可稳定DNA-蛋白复合物，从而提高LAMP扩增的成功率。

本发明的另一目的在于提供一种快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法，其采用上所述的LAMP引物进行LAMP扩增。

优选地，上述快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法包括以下步骤：

(1)利用待检测样品DNA模板，LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

25 μl的LAMP反应体系包括以下成分

10 μM的SOD2-F3：0.5 μl

10 μM的SOD2-B3：0.5 μl

10 μM的SOD2-FIP：4 μl

10 μM的SOD2-BIP：4 μl

10 μM的SOD2-LF：2 μl

10 μM的SOD2-LB：2 μl

10 × IsothermalAmp Buffer：2.5 μl

100 mM的MgSO4：1.5 μl

25 mM的dNTPs：1.4 μl

0.5 M的Betaine (甜菜碱)：1 μl

2 mM的HNB (羟基萘酚蓝)：2 μl

8 U/μl的Bst II Pro DNA Polymerase Large Fragment：1 μl

DNA模板：1 μl。

观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或观察琼脂糖凝胶电泳图具有梯形条带判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或琼脂糖凝胶电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

上述体系的最佳反应条件为：先在62 ℃反应60 min。上述DNA模板的浓度为10fg/μl～100 ng/μl。

显色原理为：羟基萘酚蓝是Mg2+的滴定剂，在含有Mg2+的体系中，呈紫色，随着扩增反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去镁离子呈现天蓝色，而未发生反应的体系则仍保持着紫色，由此可以判断LAMP反应结果。

优选地，LAMP扩增的反应条件为：首先，62℃，60min。

可选地，待检测样品DNA为提取的含有待检测病原菌基因组的DNA。

可选地，所述待检测样品DNA的提取方法为：

取待测样品置于研钵中，加入800 μl 研磨液进行研磨；65 ℃水浴45 min；13 000r/min离心3 min；取750 μl上清于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），上下颠倒5 min；12 000 r/min离心8 min；取上清300 μl，加 2 倍体积的冰乙醇，混匀；12000 r/min离心15 min，弃上清；室温晾干后，加20 μl 灭菌ddH2O溶解。

研磨液中包含Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB和PVP。更优选的，各组分浓度为Tris-HCl：100 mM，NaCl：1M，EDTA：50mM，CTAB的质量百分比浓度为2%，PVP的质量百分比浓度为2%。

本发明还提供上述LAMP引物、试剂盒在检测辣椒炭疽病菌中的应用。

本发明实施例提供的快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒具有以下有益效果：

1、特异性强：本发明所设的LAMP引物是基于辣椒炭疽病菌(Colletotrichum scovillei)的超氧化物歧化酶2 基因序列的特异性区域序列中6个不同区域设计出3对特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。

2、灵敏度高：本发明对辣椒炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10 fg/μl，具有很高的灵敏性，且灵敏度高于已报道的ITS引物。

3、实用性好：相较于传统的菌株分离培养方法的病原菌检测的周期长，经验依赖性高，准确度低，存在一定的不确定性，以及普通PCR反应对病原菌DNA进行扩增、回收和测序，检测时间长，成本高，不能满足经济高效检测的要求，本发明提供的LAMP反应检测方法只需要在恒温(62℃)条件下进行短时间反应，结果可通过肉眼在常光下直接判断，能快速准确地检测出病原菌，从而增加了其在农业生产上的应用价值。

4、本发明提供的检测方法操作简单、灵敏度和特异性高，且无需贵重仪器设备，适用于田间辣椒炭疽病的早期诊断，对辣椒炭疽病及时有效的防治具有重要意义，同时为检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。

图1为LAMP引物特异性检测对比图结果；其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL5000 DNA Marker ，1-7 泳道检测样品依次为辣椒炭疽病菌(C. scovillei)、大豆炭疽病菌(C. truncatum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒根腐病菌(Fusarium solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、水稻纹枯病菌种(Rhizoctonia solani)和水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)，8泳道为无菌双蒸水阴性对照；

图2为使用本发明SOD2基因引物的LAMP技术检测辣椒炭疽病菌的灵敏度测定；其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；M表示DL5000 DNA Marker，1-7泳道检测样品的LAMP反应体系中模板DNA浓度依次为1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100fg/μl、10 fg/μl和1 fg/μl，8泳道为无菌双蒸水阴性对照；

图3为使用ITS基因引物的LAMP技术检测辣椒炭疽病菌的灵敏度测定；其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；M表示DL5000 DNA Marker，1-7泳道检测样品的LAMP反应体系中模板DNA浓度依次为1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl和1 fg/μl，8泳道为无菌双蒸水阴性对照；

图4为LAMP技术检测辣椒炭疽病发病样品；其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；M表示DL5000 DNA Marker，1-7泳道分别为不同的辣椒炭疽病发病样品，8泳道为无菌双蒸水阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1引物设计和合成：

根据辣椒炭疽病菌(C. scovillei)的超氧化物歧化酶2 基因序列(该序列见序列表中SEQ ID No .)特异性，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/lamp v5e/index.html)设计出了一套辣椒炭疽病菌特异性的LAMP引物并进行序列合成，所述LAMP引物包括外引物SOD2-F3和SOD2-B3，内引物SOD2-FIP和SOD2-BIP，以及环引物SOD2-LF和SOD2-LB引物序列如下：

SOD2-F3：5’- ACGCAAACCCTCTCCAAAG -3’；(SEQ ID No .1)

SOD2-B3：5’- CAGAGCGGCGTTAAAGACC -3’；(SEQ ID No .2)

SOD2-FIP：5’- TGGGGAGAGGTTCTCCCAGAAACCTCGCAGCCCTTAACTTTC -3’；(SEQ IDNo .3)

SOD2-BIP：5’- TTCAAGCCCGGATGCTTCGCAGACCACCCCAGATACGAG -3’；(SEQ ID No.4)

SOD2-LF：5’- TGATGTGACCACCACCGT -3’；(SEQ ID No .5)

SOD2-LB：5’- CGGCACCGAAGCTGATC -3’；(SEQ ID No .6)

同时，根据文献报道[辣椒炭疽病菌快速检测技术研发及其协同增效药剂筛选]合成ITS基因LAMP引物，用于比较不同靶标基因间的检测灵敏度，引物包括外引物ITS-F3和ITS-B3，内引物ITS-FIP和ITS-BIP，以及环引物ITS-LB引物序列分别为：

ITS-F3：5’- AGCATTCTGGCGAGCATG -3’；(SEQ ID No .7)

ITS-B3：5’- TGATCCGAGGTCAACCTGTA -3’；(SEQ ID No .8)

ITS-FIP：5’- CCTTTAAGGGCCCACGTGTGCAGCGTCATTTCAACCCTCAA -3’；(SEQ ID No.9)

ITS-BIP：5’- CGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAAGGGTTTTACGGCAAGAGTCC -3’；(SEQ ID No.10)

ITS-LB：5’- CTAACGTCTCGCACTGGGAT -3’。(SEQ ID No .11)

将上述合成的引物，用灭菌双蒸水分别稀释为10 μmol/L，将引物置于-20℃冰箱避光保存备用。

实施例2 辣椒炭疽病菌的LAMP检测：

1、待测辣椒炭疽病菌的基因组DNA的提取

取待测样品置于研钵中，加入800 μl 研磨液进行研磨；65 ℃水浴45 min；13 000r/min离心3 min；取750 μl上清于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），上下颠倒5 min；12 000 r/min离心8 min；取上清300 μl，加 2 倍体积的冰乙醇，混匀；12000 r/min离心15 min，弃上清；室温晾干后，加20 μl 灭菌ddH2O溶解。

2、LAMP反应检测体系的建立：

以上述提取的待测样品的基因组DNA为模板，利用引物SOD2-F3、SOD2-B3、SOD2-FIP、SOD2-BIP、SOD2-LF和SOD2-LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系以25 μl为例，具体反应体系包括：

10 μM的SOD2-F3：0.5 μl

10 μM的SOD2-B3：0.5 μl

10 μM的SOD2-FIP：4 μl

10 μM的SOD2-BIP：4 μl

10 μM的SOD2-LF：2 μl

10 μM的SOD2-LB：2 μl

10 × IsothermalAmp Buffer：2.5 μl

100 mM的MgSO4：1.5 μl

25 mM的dNTPs：1.4 μl

0.5 M的Betaine(甜菜碱)：1 μl

2 mM的HNB(羟基萘酚蓝)：2 μl

8 U/μl的Bst II Pro DNA Polymerase Large Fragment：1 μl

DNA模板：1 μl

上述体系的最佳反应条件为：先在62 ℃反应60 min。上述DNA模板的浓度为10fg/μl～100 ng/μl。

3、检测结果的观察和分析

一种最直观的判断方法为：直接通过肉眼观察反应管中反应产物，如果显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，若反应产物显示为紫色，则判断结果为阴性。这种方法最为快速，简单，检测成本最低。

另一种方法为仅采用电泳检测结果进行检测。方法具体为：对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果出现梯形条带，判定检测结果为阳性；否则，检测结果为阴性。

为提高检测结果的准确度，最佳方案是将上述两种结果进行结合，即：当LAMP反应产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，判断为阳性；当LAMP反应产物显示紫色，电泳图谱无条带，判断为阴性。

实施例3 LAMP引物的特异性测试：

按照实施例2 的方法建立LAMP反应检测体系，依次对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum scovillei)、大豆炭疽病菌(C. truncatum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒根腐病菌(Fusarium solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、水稻纹枯病菌种(Rhizoctonia solani)和水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)这7种待测样品进行LAMP检测，分别编号A1-A7，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。所选病原菌均是茄科常见病原菌或者为辣椒轮作作物的致病菌，均可已致病或非致病的状态传播到辣椒作物上。

测试结果：如图1所示，只有样品A1 (辣椒炭疽病菌)的反应管中反应产物为天蓝色，且电泳结果为梯形条带，检测显示为阳性结果；其他6个样品和阴性对照的检测结果都为阴性，反应管中产物为紫色。该结果说明：本发明提供的3对引物对辣椒炭疽病菌具有很高的特异性，能很好将其与其他病菌进行区分，检测结果精准。

实施例4 检测方法的灵敏度测试：

按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系，将待测样品辣椒炭疽病菌的基因组DNA，采用灭菌双蒸水进行不同浓度的稀释，得到DNA浓度分别1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL，的待测样品B1-B7，分别以其作为模板进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图2所示，样品B1-B5的检测结果都为阳性，样品B7和阴性对照的检测结果为阴性。这说明本申请的检测方法可检测的DNA浓度可低至100 fg/μl，灵敏度极高。

按照实施例2的LAMP反应检测体系，将SOD2引物组更换为ITS引物组，将待测样品辣椒炭疽病菌的基因组DNA，采用灭菌双蒸水进行不同浓度的稀释，得到DNA浓度分别1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl和1 fg/μl，的待测样品C1-C7，分别以其作为模板进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图3所示，样品C1-C4的检测结果都为阳性，样品C5、C6、C7和阴性对照的检测结果为阴性，说明以ITS基因作为靶标可检测的DNA最低浓度为1 pg/μl。因此，本发明实施例4中所用的SOD2靶基因检测灵敏度较ITS靶基因提高10倍。

实施例5 LAMP技术在检测辣椒炭疽病发病植株的应用：

将不同来源的7株辣椒炭疽病(C. scovillei)发病样品分别作为待测样品，分别编号D1-D7，按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系并进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图4所示，7个待测样品的检测显示都为阳性结果，反应管中反应产物为天蓝色，且电泳结果为梯形条带。这实验进一步地说明本发明的方法对辣椒炭疽病菌的检测特异性高，具有很好的应用前景，可广泛用于在不同发病区域进行辣椒炭疽病菌的检测。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP引物，其特征在于，由一对外引物SOD2-F3和SOD2-B3，一对内引物SOD2-FIP和SOD2-BIP以及一对环引物SOD2-LF和SOD2-LB组成，其中，外引物SOD2-F3如SEQ ID No .1所示，外引物SOD2-B3如SEQ ID No .2所示，内引物SOD2-FIP如SEQID No .3所示，内引物SOD2-BIP如SEQ ID No .4所示，环引物SOD2-LF如SEQ ID No .5所示，环引物SOD2-LB如SEQ ID No .6所示。

2.一种用于快速检测辣椒炭疽病菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：预混反应缓冲液、反应酶液、引物缓冲液、羟基萘酚蓝染液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括甜菜碱。

5.一种快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的LAMP引物对样品进行LAMP扩增。

6.根据权利要求5所述的快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用待测样品DNA模板，LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

25 μl的LAMP反应体系包括以下成分：

10 × IsothermalAmp Buffer：2.5 μl

MgSO₄ (100 mM)：1.5 μl

dNTP Mix (25 mM)：1.4 μl

10 μM的SOD2-F3：0.5 μl

10 μM的SOD2-B3：0.5 μl

10 μM的SOD2-FIP：4 μl

10 μM的SOD2-BIP：4 μl

10 μM的SOD2-LF：2 μl

10 μM的SOD2-LB：2 μl

Betaine (0.5 M)：1 μl

HNB (2 mM)：2 μl

Bst II Pro DNA Polymerase Large Fragment (8 U/μl)：1 μl

DNA模板：1 μl；

(2)观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或观察琼脂糖凝胶电泳图具有梯形条带判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或琼脂糖凝胶电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

7.根据权利要求6所述的检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件为：62℃，60 min。

8.根据权利要求6所述的快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法，其特征在于，所述DNA模板为提取的含有待检测病菌基因组的DNA。

9.根据权利要求7所述的快速检测辣椒炭疽病菌的LAMP检测方法，其特征在于，所述DNA模板的提取方法为：

取待测样品置于研钵中，加入800 μl 研磨液进行研磨；65 ℃水浴45 min；13 000 r/min离心3 min；取750 μl上清于一新离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），上下颠倒5 min；12 000 r/min离心8 min；取上清300 μl，加 2 倍体积的冰乙醇，混匀；12000 r/min离心15 min，弃上清；室温晾干后，加20 μl 灭菌ddH2O溶解，

其中，研磨液中包含Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB和PVP，各组分浓度为Tris-HCl：100mM，NaCl：1 M，EDTA：50 mM，CTAB的质量百分比浓度为2%，PVP的质量百分比浓度为2%。

10.如权利要求1所述的LAMP引物、如权利要求2-4中任一项所述的试剂盒在检测辣椒炭疽病菌中的应用。