CN111500765B - 快速检测苹果黑星病菌的lamp引物、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法，所述LAMP引物由一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成。其中，外引物F3如SEQ ID No.1所示，外引物B3如SEQ ID No.2所示，内引物FIP如SEQ ID No.3所示，内引物BIP如SEQ ID No.4所示，环引物LF如SEQ ID No.5所示，环引物LB如SEQ ID No.6所示。通过采用上述3对特异的LAMP引物对待测样品进行LAMP扩增可实现对苹果黑星病菌的快速检测，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强，检测速度快，适用于田间苹果黑星病的早期诊断和病原菌的检测与鉴定，对苹果黑星病及时有效的防控具有重要的意义。

Description

快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及苹果黑星病菌检测方法技术领域，尤其涉及快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

由苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)引起的苹果黑星病，又称疮痂病(applescab)，是世界各苹果产区的重要病害之一。该病害主要危害苹果叶片和果实，也可侵染叶柄、花、萼片、花梗、幼嫩枝条和芽鳞等，严重时引起落叶、落果，受害果实开裂畸形，直接影响苹果的产量及品质。苹果黑星病具有流行速度快、危害性大、难以防治的特点。近年来，由于果园管理模式粗放，苹果黑星病在我国苹果主产区的发生呈抬头趋势。苹果黑星病菌以菌丝体或子囊壳在芽鳞或病落叶上越冬，子囊孢子是主要初侵染源，翌年5-8月释放子囊孢子，借风雨传播进行侵染，春季多雨高湿有利于病害的发生。此外，苹果黑星病菌具有潜伏侵染特性，如采收前遭遇阴雨天气，病菌会潜伏到果实，条件适宜则引起贮藏期的苹果果实发病。

目前，苹果黑星病菌的检测主要是通过分离培养病原菌，然后进行形态学特征鉴定和致病性测定结果，该方法对专业技术要求比较高，且存在一定的不确定性，且程度繁琐、周期长。而目前的普通PCR反应对病原菌DNA进行扩增、回收和测序，检测时间长，成本高，不能满足经济高效检测的要求。因此，上述现有苹果黑星病菌的检测方法极大地影响了田间中苹果黑星病病情的及时发现和实时监测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是日本学者Notomi于2000年发明的一种新的DNA扩增技术，该方法能够高效、特异、快速在等温条件下完成。LAMP技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应形成不溶的焦磷酸镁沉淀，便于对反映结果的观测。该方法操作简便，结果可靠，成本低廉，在基层诊断方面有着广泛的应用前景。

虽然环介导等温扩增技术具有以上优点，但是由于该技术对引物特异性和条件、体系要求较高，这种检测方式容易由于污染问题、以及环引物件的非特异性结合等导致假阳性的问题，影响检测结果的准确性；而目前还没有发现用于特异性检测苹果黑星病菌的LAMP引物。

发明内容

针对上述问题，本发明实施例提供了一种快速、特异性的检测苹果黑星病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法，该方法检测速度快、操作简单、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物，该引物由一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成。

其中，外引物F3如SEQ ID No.1所示，外引物B3如SEQ ID No.2所示，内引物FIP如SEQ ID No.3所示，内引物BIP如SEQ ID No.4所示，环引物LF如SEQ ID No.5所示，环引物LB如SEQ ID No.6所示。

本发明基于环介导等温扩增(LAMP)技术原理，选取苹果黑星病菌β微管蛋白基因序列为检测靶标，在β微管蛋白基因序列的6个区域设计了上述6条特异性引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，并且通过对反应体系和反应条件的优化，建立以HNB为显色指示剂的苹果黑星病菌可视化LAMP检测技术。上述三对引物的特异性高，只要6个区域中任一区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。并且，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强，且无需贵重仪器设备，适用于田间苹果黑星病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对苹果黑星病及时有效的防治具有重要的意义，同时为检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。

相对于现有LAMP扩增普遍采用2对引物(F3、B3、FIP和BIP)进行环介导等温扩增，本申请增设的一对环引物LF和LB，不仅可以有效提高扩增效率，还能缩短反应时间。

本发明还提供一种苹果黑星病菌的LAMP检测试剂盒，其包括如上所述的LAMP引物。使用时，操作人员自行提供检测所需要的LAMP反应体系的其他试剂即可。

进一步的，为了提高LAMP检测试剂盒的完整性，减少操作人员的准备工作，所述试剂盒还包括：预混反应缓冲液、反应酶液、引物缓冲液、羟基萘酚蓝染液。可根据体系大小，选用适量的各种溶液配制反应体系，用于对样品进行苹果黑星病菌的检测。

进一步地，上述试剂盒还可包括：甜菜碱。为了进一步增强扩增反应效果，在试剂盒中增加甜菜碱。甜菜碱(Betaine)作为高性能的PCR增强剂，可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶的从模板DNA中解离、可稳定DNA-蛋白复合物，从而提高LAMP扩增的成功率。

本发明还提供一种快速检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法，其采用上所述的LAMP引物进行LAMP扩增。

优选地，上述快速检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法包括以下步骤：

(1)利用待测样品DNA模板，LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

26μL的LAMP反应体系包括以下成分

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO₄：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

5M的Betaine(甜菜碱)：4μL

2.4mM的HNB(羟基萘酚蓝)：2μL

8,000U/mL的BstDNA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL。

(2)可直接通过肉眼观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或通过琼脂糖凝胶电泳观察梯形条带来判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

显色原理为：羟基萘酚蓝是Mg²⁺的滴定剂，在含有Mg²⁺的体系中，呈紫色，随着扩增反应的进行，Mg²⁺与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去镁离子呈现天蓝色，而未发生反应的体系则仍保持着紫色，由此可以判断LAMP反应结果。

优选地，LAMP扩增的反应条件为：首先，62℃，70min；接着，80℃，10min。

可选地，测定样品为提取的苹果黑星病菌基因组DNA。

可选地，所述待测样品的基因组DNA的提取方法为：

取0.1g左右的待测样品放入含有400μLDNA裂解液的离心管内，加入一颗钢珠，在组织研磨仪中65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，-20℃静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物；

其中，DNA裂解液包括以下成分：0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na₂，0.2M NaCl和3mM SDS，PH＝8.0。

本发明还提供上述LAMP引物、试剂盒在检测苹果黑星病菌中的应用。

本发明实施例提供的快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒具有以下有益效果：

1、特异性强：本发明所设的LAMP引物是基于苹果黑星病菌Venturiainaequalis的β微管蛋白基因序列的特异性区域序列中6个不同区域设计出3对特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。

2、灵敏度高：本发明对苹果黑星病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg/μL，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：相较于传统的菌株分离培养方法的病原菌检测的周期长，经验依赖性高，准确度低，存在一定的不确定性，以及普通PCR反应对病原菌DNA进行扩增、回收和测序，检测时间长，成本高，不能满足经济高效检测的要求，本发明提供的LAMP反应检测方法只需要在恒温(62℃)条件下进行短时间反应，结果可通过肉眼在常光下直接判断，能快速准确地检测出病原菌，从而增加了其在农业生产上的应用价值。

4、本发明提供的检测方法操作简单、灵敏度和特异性高，且无需贵重仪器设备，适用于田间苹果黑性病的早期诊断，对苹果黑星病及时有效的防治具有重要意义，同时为检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。

附图说明

图1为LAMP引物特异性检测对比图结果；

其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL2000 DNA Marker，1-7泳道检测样品依次为苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)、苹果褐斑病菌(Marssoninacoronaria)、苹果腐烂病菌(Valsamali)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria mali)和苹果白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)，8泳道为无菌双蒸水阴性对照；

图2为LAMP技术检测苹果黑星病菌的灵敏度测定；

其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；

M表示DL2000 DNA Marker，1-7泳道检测样品的LAMP反应体系中模板DNA浓度依次为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL，8泳道为无菌双蒸水阴性对照；

图3为LAMP技术检测苹果黑星病发病样品；

其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；

M表示DL2000 DNA Marker，1-7泳道分别为不同的苹果黑星病发病样品，

8泳道为无菌双蒸水阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1引物设计和合成

根据苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)的β微管蛋白基因序列(该序列见序列表中SEQ ID No.7)特异性，利用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorer(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计出了一套苹果黑星病菌特异性的LAMP引物并进行序列合成，所述LAMP引物包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，以及环引物LF和LB，引物序列分别为：F3：5’-GCTTCCGTCTACCTTCCTGT-3’；(SEQ ID No.1)

B3：5’-CCGGTCTGGAGATGAACCTA-3’；(SEQ ID No.2)

FIP：5’-AGTGGACGTACAATTTCGCGCA-ACTCCCGTACCCAATTCTCT-3’；(SEQ ID No.3)

BIP：5’-CGTCCCCTGAATCCTCTGCC-CCACGAAGTACACGTTAGCT-3’；(SEQ ID No.4)

LF：5’-TGTTGACGGTGGTGAGGT-3’；(SEQ ID No.5)

LB：5’-CCGCGTCCAGGCTTTCA-3’。(SEQ ID No.6)

将上述合成的引物，用灭菌双蒸水分别稀释为10μmol/L，将引物置于-20℃冰箱避光保存备用。

实施例2苹果黑星病菌的LAMP检测

1、待测苹果黑星病菌的基因组DNA的提取

取适量待测样品于含有400μL的DNA裂解液(0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na₂，0.2M NaCl，3mM SDS，PH＝8.0)的离心管中，加入一颗钢珠，65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，-20℃静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物。

2、LAMP反应检测体系的建立：

以上述提取的待测样品的基因组DNA为模板，利用引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系以26μL为例，具体反应体系包括：

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO₄：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

5M的Betaine：4μL

2.4mM的HNB：2μL

8,000U/mL的BstDNA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL。

上述体系的最佳反应条件为：先在62℃反应70min；接着于80℃，保持10min。上述DNA模板的浓度为100fg/μL～100ng/μL。

3、检测结果的观察和分析

一种最直观的判断方法为：直接通过肉眼观察反应管中反应产物，如果显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，若反应产物显示为紫色，则判断结果为阴性。这种方法最为快速，简单，检测成本最低。

另一种方法为仅采用电泳检测结果进行检测。方法具体为：对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果出现梯形条带，判定检测结果为阳性；否则，检测结果为阴性。

为提高检测结果的准确度，最佳方案是将上述两种结果进行结合，即：当LAMP反应产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，判断为阳性；当LAMP反应产物显示紫色，电泳图谱无条带，判断为阴性。

实施例3LAMP引物的特异性测试

按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系，依次对苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)、苹果褐斑病菌(Marssoninacoronaria)、苹果腐烂病菌(Valsamali)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria mali)和苹果白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)这7种待测样品进行LAMP检测，分别编号A1-A7，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图1所示，只有样品A1(苹果黑星病菌)的反应管中反应产物为天蓝色，且电泳结果为梯形条带，检测显示为阳性结果；其他6个样品和阴性对照的检测结果都为阴性，反应管中产物为紫色。该结果说明：本发明提供的3对引物对苹果黑星病菌具有很高的特异性，能很好将其与其他病菌进行区分，检测结果精准。

实施例4检测方法的灵敏度测试

按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系，将待测样品苹果黑星病菌的基因组DNA，采用灭菌双蒸水进行不同浓度的稀释，得到DNA浓度分别1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL，的待测样品B1-B7，分别以其作为模板进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图2所示，样品B1-B5的检测结果都为阳性，样品B6-B7和阴性对照的检测结果为阴性。这说明本申请的检测方法可检测的DNA浓度可低至100fg/μL，灵敏度极高。

实施例5LAMP技术在检测苹果黑星病发病植株的应用

将不同来源的7株苹果黑星病(Venturiainaequalis)发病样品分别作为待测样品，分别编号C1-C7，按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系并进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图3所示，7个待测样品的检测显示都为阳性结果，反应管中反应产物为天蓝色，且电泳结果为梯形条带。这实验进一步地说明本发明的方法对苹果黑星病菌的检测特异性高，具有很好的应用前景，可广泛用于在不同发病区域进行苹果黑星病菌的检测。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物、试剂盒及其检测方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 外引物 F3(Outer primer F3)

<400> 1

gcttccgtct accttcctgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 外引物 B3(Outer primer B3)

<400> 2

ccggtctgga gatgaaccta 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 内引物 FIP(Inter primer FIP)

<400> 3

agtggacgta caatttcgcg caactcccgt acccaattct ct 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 内引物BIP(Inter primer BIP)

<400> 4

cgtcccctga atcctctgcc ccacgaagta cacgttagct 40

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 环引物LF(Ring primer LF)

<400> 5

tgttgacggt ggtgaggt 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 环引物LB( Loop primer LB)

<400> 6

ccgcgtccag gctttca 17

<210> 7

<211> 437

<212> DNA

<213> 苹果黑星病菌的β微管蛋白基因(β tubulin gene ofVenturiainaequalis)

<400> 7

tgcaacgaca acagcttccg tctaccttcc tgtatcctca aactcccgta cccaattctc 60

tacccacaac aacctcacca ccgtcaacat gcgcgaaatt gtacgtccac tcaccgtttg 120

aacgcgtccc ctgaatcctc tgccccgcgt ccaggctttc acaacaacat taaggaaact 180

atagctaacg tgtacttcgt ggtataggtt catctccaga ccggtcaatg tgtaagttaa 240

agtcgatatc tccatcaaca aagccaatta cttacagtcc acagggtaac caaattggtg 300

ctgccttctg gttcgtccac gaccgcaata tatacctcga cctcgactaa ttcagctcca 360

ggcaaaccat ctctggcgaa cacggtctcg atggatccgg agtgtaagca atactcggac 420

aagaagggca ttggcca 437

Claims (10)

1.快速检测苹果黑星病菌的LAMP引物，其特征在于，由一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成，其中，外引物F3如SEQ ID No.1所示，外引物B3如SEQID No.2所示，内引物FIP如SEQ ID No.3所示，内引物BIP如SEQ ID No.4所示，环引物LF如SEQ ID No.5所示，环引物LB如SEQ ID No.6所示；以苹果黑星病菌β微管蛋白基因序列为检测靶标。

2.一种用于快速检测苹果黑星病菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：预混反应缓冲液、反应酶液、引物缓冲液、羟基萘酚蓝染液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括甜菜碱。

5.一种快速检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的LAMP引物对样品进行LAMP扩增。

6.根据权利要求5所述的快速检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用待测样品DNA模板，LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

26μL的LAMP反应体系包括以下成分：

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO₄：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

Betaine：4μL

HNB：2μL

BstDNA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL；

(2)可直接通过肉眼观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或通过琼脂糖凝胶电泳观察梯形条带来判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

7.根据权利要求6所述的快速检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法，其特征在于，DNA模板为提取的苹果黑星病菌基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的快速检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法，其特征在于，苹果黑星病菌基因组DNA的提取方法为：

取待测样品放入含有400μLDNA裂解液的离心管内，加入一颗钢珠，在组织研磨仪中65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，于-20℃条件下静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物；

其中，DNA裂解液包括以下成分：0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na₂，0.2M NaCl和3mMSDS，PH＝8.0。

9.根据权利要求6所述的检测苹果黑星病菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件为：首先，62℃，70min；接着，80℃，10min。

10.如权利要求1所述的LAMP引物、如权利要求2-4中任一项所述的试剂盒在检测苹果黑星病菌中的应用。

Images