CN111100948A

CN111100948A - 快速检测苹果腐烂病菌的lamp引物及其检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN111100948A
Application number: CN202010075037.6A
Authority: CN
Inventors: 刘娜; 任维超; 练森; 王彩霞; 李保华
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2020-05-05

Abstract

本发明公开了快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒，所述LAMP引物由一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成。其中，正向外引物F3如SEQ ID No.1所示，反向外引物B3如SEQ ID No.2所示，正向内引物FIP如SEQ ID No.3所示，反向内引物BIP如SEQ ID No.4所示，正向环引物LF如SEQ ID No.5所示，反向环引物LB如SEQ ID No.6所示。通过采用上述3对特异的LAMP引物对待测样品进行LAMP扩增可实现对苹果腐烂病菌的快速检测，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强、检测速度快，且无需贵重仪器设备，适用于田间苹果腐烂病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定。

Description

快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及苹果腐烂病菌检测方法技术领域，尤其涉及快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒。

背景技术

苹果(Malus domestica)果实酸甜可口，营养丰富，是所有蔬果中营养价值最接近完美的一个，被誉为“百果之王”。近年来随着我国苹果产业的迅速发展，中国已经成为世界最大的苹果生产基地，苹果的种植面积及产量均占世界50％以上。

由黑腐皮壳菌(Valsa mali)引起的苹果腐烂病是我国主要苹果产区危害最为严重的枝干性病害，被称为苹果树的“癌症”。腐烂病能够侵染苹果树韧皮部、木质部，导致树势衰弱、枝干枯死、死树，甚至毁园。苹果腐烂病菌具有潜伏侵染的特点，病菌侵入树体后，通常不立即致病，而处于潜伏状态。当树体或局部组织衰弱时，腐烂病菌就会由潜伏状态转变为致病状态而引起症状。然而，当前针对苹果腐烂病尚无较好的抗病品种且腐烂病菌的潜伏期较长，早期难以通过肉眼观察症状被发现，因此，快速、准确地在发病前期或初期对病菌的侵染动态进行监测，及时采取有效的防治措施对控制病害在田间的发生具有重要意义。

环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是日本荣研化学的Notomi博士等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30～90分钟即可完成扩增反应，效率可达10⁹～10¹⁰个数量级。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此肉眼观察即可判定扩增结果，也可添加染料至扩增产物中通过颜色变化进行判断，无需专业的仪器设备，运用普通水浴锅或其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特点。凭借快速灵敏的优越性，LAMP技术已在多种植物常见病害的快速检测中得到了应用，极大地提高了植物病害鉴定的效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施提供了科学依据。然而，目前该技术在苹果腐烂病菌的检测中的应用尚无相关报道。

目前，苹果腐烂病菌的检测主要是通过分离培养病原菌，然后进行形态学特征鉴定和致病性测定结果，该方法对专业技术要求比较高，且存在一定的不确定性，且程度繁琐、周期长。而目前的普通PCR反应对病原菌DNA进行扩增、回收和测序，检测时间长，成本高，不能满足经济高效检测的要求。因此，上述现有苹果腐烂病菌的检测方法极大地影响了田间中苹果腐烂病病情的及时发现和实时监测，还有待进一步发展。

发明内容

针对现有技术中对苹果腐烂病菌的检测方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低的缺点，本发明实施例提供了快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒，该方法检测速度快、操作简单、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物，该引物由一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成。

其中，正向外引物F3如SEQ ID No.1所示，反向外引物B3如SEQ ID No.2所示，正向内引物FIP如SEQ ID No.3所示，反向内引物BIP如SEQ ID No.4所示，正向环引物LF如SEQID No.5所示，反向环引物LB如SEQ ID No.6所示。

本发明基于环介导等温扩增(LAMP)技术原理，选取苹果腐烂病菌ITS基因序列为检测靶标，在ITS基因序列的6个区域设计了上述6条特异性引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，并且通过对反应体系和反应条件的优化，建立以HNB为显色指示剂的苹果腐烂病菌可视化LAMP检测技术。上述三对引物的特异性高，只要6个区域中任一区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。并且，该技术操作简单、灵敏度高、特异性强，且无需贵重仪器设备，适用于田间苹果腐烂病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对苹果腐烂病进行及时有效的防治具有重要意义，同时为口岸等检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。

相对于现有LAMP扩增普遍采用2对引物(F3、B3、FIP和BIP)进行环介导等温扩增，本申请增设的一对环引物LF和LB，不仅可以有效提高扩增效率，还能缩短反应时间。

本发明还提供一种快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其采用上所述的LAMP引物进行LAMP扩增。

优选地，上述快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法包括以下步骤：

(1)利用待测样品DNA模板，LAMP引物建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；

26μL的LAMP反应体系包括以下成分

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO4：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

5M的Betaine(甜菜碱)：4μL

2.4mM的HNB(羟基萘酚蓝)：2μL

8,000U/mL的BstDNHA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL。

(2)可直接通过肉眼观察反应管中反应产物显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，或通过琼脂糖电泳观察梯形条带来判定检测结果为阳性；反应产物显示为紫色，或电泳图谱无条带，判断检测结果为阴性。

优选地，LAMP扩增的反应条件为：首先，62℃，65min；接着，80℃，10min。

可选地，作为模板的待测样品DNA为提取的待测苹果腐烂病菌的基因组，或者用待测苹果腐烂病菌的ITS基因扩增产物。

可选地，所述待测样品的基因组DNA的提取方法为：

取0.1g左右的待测样品放入含有400μL DNA裂解液的离心管内，加入一颗钢珠，在组织研磨仪中65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，-20℃静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物；

其中，DNA裂解液包括以下成分：0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na2，0.2M NaCl和3mM SDS，PH＝8.0。

本发明还提供一种苹果腐烂病菌的LAMP检测试剂盒，其包括如上所述的LAMP引物。使用时，操作人员自行提供检测所需要的LAMP反应体系的其他试剂即可。

进一步的，为了提高LAMP检测试剂盒的完整性，减少操作人员的准备工作，所述试剂盒还包括：Bst DNHA聚合酶、HNB和Betaine。进一步地，还可包括：Thermo Pol ReactionBuffer、MgSO₄和dNTPs。

本发明实施例提供的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒具有以下有益效果：

1、特异性强：本发明所设的LAMP引物是基于苹果腐烂病菌Valsa mali的ITS基因序列中6个不同区域设计出3对特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性显著提高。

2、灵敏度高：本发明对苹果腐烂病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg/μL，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：相较于传统的病原菌检测的周期长，经验依赖性高，准确度低，以及普通PCR反应的检测时间长，成本高的缺点，本发明提供的LAMP反应检测方法只需要在恒温(62℃)条件下进行短时间反应，结果可通过肉眼在常光下直接判断，能快速检测出病原菌，从而增加了其在农业生产上的应用价值。

4、该技术操作简单、灵敏度和特异性高，且无需贵重仪器设备，适宜于田间苹果腐烂病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对苹果腐烂病进行及时有效的防治具有重要意义，同时为口岸等检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。

附图说明

图1为LAMP引物特异性检测对比图结果；

其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL 2000DNA Marker，检测样品a1-a7依次为苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、苹果褐斑病菌(Marssoninacoronaria)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)、苹果白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria mali)，8为无菌双蒸水阴性对照；A图中，样品a1为阳性，样品a2-a7为阴性；

图2为LAMP技术检测苹果腐烂病菌的灵敏度测定；

其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；

M表示DL 2000DNA Marker，b1-b7的LAMP反应体系中的模板DNA浓度分别100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL，8为无菌双蒸水阴性对照；A图中，样品b1-b7为阳性，8为阴性；

图3为LAMP技术检测苹果腐烂病发病植株；

其中，A为LAMP显色变化图；B为LAMP扩增产物电泳图；

M表示DL 2000DNA Marker，c1-c7分别为不同的苹果腐烂病发病样品，8为无菌双蒸水阴性对照；A图中，样品c1-c7为阳性，8为阴性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1引物设计和合成

根据苹果腐烂病菌(Valsa mali)的ITS(Internal Transcribed Spacer)序列(该序列见序列表中SEQ ID No.7)特异性，利用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorer(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计一套苹果腐烂病菌特异性的LAMP引物并进行序列合成，所述LAMP引物包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，以及环引物LF和LB，引物序列分别为：

F3：5’-CGAATCTTTGAACGCACATTGC-3’；(SEQ ID No.1)

B3：5’-GGGTTTTACGGCAGGGC-3’；(SEQ ID No.2)

FIP：5’-CCAAGCAGGGCTTGAGGGTT-TCTGGTATTCCAGAGGGCA-3’；(SEQ ID No.3)

BIP：5’-CTGAAATTTAGTGGCGAGCTCGC-CGCGCCAGTACAGTCCA-3’；(SEQ ID No.4)

LF：5’-TGACGCTCGAACAGGCA-3’；(SEQ ID No.5)

LB：5’-GGACTCCGAGCGCAGTAGT-3’。(SEQ ID No.6)

将上述合成的引物，用灭菌双蒸水分别稀释为10μmol/L,将引物置于-20℃冰箱避光保存备用。

实施例2苹果腐烂病菌的LAMP检测

1、待测苹果腐烂病菌的基因组DNA的提取

取适量待测样品于含有400μLDNA裂解液(0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na₂，0.2MNaCl，3mM SDS，PH＝8.0)的离心管中，加入一颗钢珠，65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，-20℃静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物。

2、LAMP反应检测体系的建立：

以上述提取的待测样品的基因组DNA为模板，利用引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系以26μL为例，具体反应体系包括：

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO4：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

5M的Betaine：4μL

2.4mM的HNB：2μL

8,000U/mL的BstDNHA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL。

上述体系的最佳反应条件为：先在62℃反应65min；接着于80℃，保持10min。上述DNA模板的浓度为100fg/μL～100ng/μL。

3、检测结果的观察和分析

一种最直观的判断方法为：直接通过肉眼观察反应管中反应产物，如果显示为天蓝色，判断检测结果为阳性，若反应产物显示为紫色，则判断结果为阴性。这种方法最为快速，简单，检测成本最低。

另一种方法为仅采用电泳检测结果进行检测。方法具体为：对反应产物进行琼脂糖电泳，若电泳结果出现梯形条带，判定检测结果为阳性；否则，检测结果为阴性。

为提高检测结果的准确度，最佳方案是将上述两种结果进行结合，即：当LAMP反应产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，判断为阳性；当LAMP反应产物显示紫色，电泳图谱无条带，判断为阴性。

实施例3LAMP引物的特异性测试

按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系，同时对苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、苹果褐斑病菌(Marssoninacoronaria)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)、苹果白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria mali)这7种待测样品进行LAMP检测，分别编号a1-a7，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图1所示，只有样品a1(苹果腐烂病菌)的反应管中反应产物为天蓝色，且电泳结果为梯形条带，检测显示为阳性结果；其他6个样品和阴性对照的检测结果都为阴性。该结果说明：本发明提供的3对引物对苹果腐烂病菌具有很高的特异性，能很好将其与其他病菌进行区分，检测结果精准。

实施例4检测方法的灵敏度测试

按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系，将待测样品苹果腐烂病菌的基因组DNA，采用灭菌双蒸水进行不同浓度的稀释，得到DNA浓度分别100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL，的待测样品b1-b7，分别以其作为模板进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图2所示，样品b1-b7的检测结果都为阳性，仅阴性对照的检测结果为阴性。这说明本申请的检测方法可检测的DNA浓度可低至100fg/μL，灵敏度极高。

实施例5LAMP技术在检测苹果腐烂病发病植株的应用

将不同来源的7株苹果腐烂病(Valsa mali)发病样品分别作为待测样品，分别编号c1-c7，按照实施例2的方法建立LAMP反应检测体系并进行LAMP反应，同时以无菌双蒸水作为阴性对照的模板进行同步实验。

测试结果：如图3所示，7个待测样品的检测显示为阳性结果，反应管中反应产物为天蓝色，且电泳结果为梯形条带。这实验进一步地说明本发明的方法对苹果腐烂病菌的检测特异性高，具有很好的应用前景，可广泛用于在不同发病区域进行苹果腐烂病菌的检测。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列F3(Synthetic sequence F3)

<400> 1

cgaatctttg aacgcacatt gc 22

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列B3(Synthetic sequence B3)

<400> 2

gggttttacg gcagggc 17

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成序列FIP(Synthetic sequence FIP)

<400> 3

ccaagcaggg cttgagggtt tctggtattc cagagggca 39

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成序列BIP(Synthetic sequence BIP)

<400> 4

ctgaaattta gtggcgagct cgccgcgcca gtacagtcca 40

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列LF(Synthetic sequence LF)

<400> 5

tgacgctcga acaggca 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列LB(Synthetic sequence LB)

<400> 6

ggactccgag cgcagtagt 19

<210> 7

<211> 260

<212> DNA

<213> 苹果腐烂病菌的ITS基因(ITS of Valsa mali)

<400> 7

tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ctctggtatt 60

ccagagggca tgcctgttcg agcgtcattt caaccctcaa gccctgcttg gtgttggggc 120

attacctgag gccgcccccg ggcgggccgg gtaagccctg aaatttagtg gcgagctcgc 180

caggactccg agcgcagtag taaaaccctc gctttggact gtactggcgc ggccctgccg 240

taaaaccccc aacttcgaaa 260

Claims

1.快速检测苹果腐烂病菌的LAMP引物，其特征在于，由一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB组成，其中，正向外引物F3如SEQ ID No.1所示，反向外引物B3如SEQ ID No.2所示，正向内引物FIP如SEQ ID No.3所示，反向内引物BIP如SEQ IDNo.4所示，正向环引物LF如SEQ ID No.5所示，反向环引物LB如SEQ ID No.6所示。

2.一种快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的LAMP引物进行LAMP扩增。

3.根据权利要求2所述的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

26μL的LAMP反应体系包括以下成分

10μM的F3：0.5μL

10μM的B3：0.5μL

10μM的FIP：2μL

10μM的BIP：2μL

10μM的LF：1μL

10μM的LB：1μL

10×ThermoPolReaction Buffer：2.5μL

100mM的MgSO₄：4μL

10mM的dNTPs：3.5μL

5M的Betaine：4μL

2.4mM的HNB：2μL

8,000U/mL的BstDNHA聚合酶：1μL

DNA模板：2μL；

4.根据权利要求3所述的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，作为模板的待测样品DNA为提取的待测苹果腐烂病菌的基因组，或者用待测苹果腐烂病菌的ITS基因扩增产物。

5.根据权利要求4所述的快速检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，待测样品的基因组DNA的提取方法为：

取待测样品放入含有400μL DNA裂解液的离心管内，加入一颗钢珠，在组织研磨仪中65Hz震荡1min，12000rpm离心2min，取上清200μL，加入400μL无水乙醇，于-20℃条件下静置30min，12000rpm离心2min，弃上清，晾干，加入30μL无菌双蒸水溶解DNA，得到基因组DNA提取物；

其中，DNA裂解液包括以下成分：0.15M Tris-HCl，0.04M EDTA-Na2，0.2M NaCl和3mMSDS，PH＝8.0。

6.根据权利要求2所述的检测苹果腐烂病菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件为：首先，62℃，65min；接着，80℃，10min。

7.一种苹果腐烂病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物。