CN106381340A

CN106381340A - 番茄灰霉病菌lamp检测引物、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN106381340A
Application number: CN201611084324.3A
Authority: CN
Inventors: 兰成忠; 姚锦爱; 阮宏椿; 吴玮
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN106381340B

Abstract

本发明公开了一种番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用。其外侧引物对为F3/B3、内侧引物对为FIP/BIP；试剂盒包括LAMP反应混合液、1对外侧引物F3/B3、1对外侧引物FIP/BIP、8 U Bst聚合酶和核酸染料1000×SYBR Green I。通过待测样品DNA 提取、环介导等温扩增、显色检测等三步即可检测到是否感染番茄灰霉病菌。本发明根据番茄灰霉病菌ITS序列设计引物，采用LAMP 技术进行检测，特异性强、灵敏度高，具有快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便等优点，解决了现有技术中存在的周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，在番茄灰霉病菌检测方面潜力巨大。

Description

番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用，可用于番茄灰霉病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

番茄（Lycopersicon seculentum Mill）是一种在世界范围广泛种植的蔬菜作物，也是我国主要的蔬菜消费品种之一。近年来，番茄栽培面积逐年增加，与此同时，番茄病虫害防治工作从理论到实践都取得了很大进步。番茄是病害种类最多的蔬菜作物之一，病害严重制约了番茄产业的发展。其中，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的番茄灰霉病是番茄设施栽培中高危害、高损失且影响蔬菜产量、品质、安全的最主要病害之一。该菌可通过侵染番茄植株的叶片、茎杆、花和果实导致番茄灰霉病的发生，病原菌在土壤或病残体上能以菌丝或菌核形式休眠越过冬天或夏天，温湿度适宜时萌发形成大量的分生孢子后凭风雨飞散或借农事操作传播引起番茄植株感病，发病处新生的灰霉分生孢子能够进行重复再侵染，从而导致病情极易扩展和加重。在中国，番茄灰霉病一般年份造成20%左右的减产，严重时超过50%，甚至绝收；该病已在全国各地普通发生，且呈上升趋势，成为当前番茄生产上的重要病害。因此，建立一套快速灵敏的检测方法用于番茄灰霉病的早期诊断，防止其从发病区向未发病区传播，对番茄灰霉病的及时控制具有重要意义。

植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。

随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多；但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处。如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性；PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR 等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，对于需要快速通关的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，需要开发新型的、快速、简便、可靠且低成本的检测手段。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 对目的DNA片段进行特异性扩增。和常规扩增方法相比，该技术主要优点体现在如下几个方面：1) 该方法仅需水浴或金属浴等恒温装置，以提供实现核酸扩增的条件，不需要热循环仪等贵重设备；2)特异性高，采用4条特异引物识别目的基因上的6个区域；3) 扩增速度快，效率高，1小时内扩增效率达到10⁹~10¹⁰个数量级，可在30-60分钟内获得结果；4) 结果判定简单，扩增产生大量产物和焦磷酸镁沉淀，无需电泳，结果可经肉眼直接判断，结合使用荧光染料或试纸条，检测结果更为灵敏可靠，结合专门开发的浊度仪，可实时观测扩增进程，可使检测时间缩短至15 分钟。目前已经应用于食品安全、环境微生物、农业病害及医学诊断等领域。

目前尚未见采用环介导等温扩增方法检测番茄灰霉病菌的试剂盒及方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中对番茄灰霉病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了番茄灰霉病菌新的分子检测方法，对番茄灰霉病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1. 番茄灰霉病菌LAMP检测引物：

通过测定番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和其它灰霉病菌（Botrytis spp）的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对灰霉菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套番茄灰霉病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：

F3: 5’- AGCTTG- TCGACCAAGTTCTT-3’，

B3: 5’- ACGGTATCGGAAACCTTTGG-3’，

FIP: 5’- CCACCACCGAGAGAGTGGGTAA -TCGTGAAGCTGAAGGCTGT-3’，

BIP: 5’- TCTCCAAGATCCGCGAGGAGT -CGATGGGACGACGGAGAA- 3’。

2. 一种利用权利要求1所述引物制备的番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒：

包括1对外侧引物F3/B3、1对外侧FIP/BIP、LAMP反应混合液，8 U Bst聚合酶和核酸染料1000×SYBR Green I；

其中LAMP反应混合液由40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs和0.2% Trion X-100组成。

3. 一种利用上述番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒检测番茄灰霉病菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

用于检测植物组织中存在番茄灰霉病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在番茄灰霉病菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：63.5 ℃温育60 min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番茄灰霉病菌；橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在番茄灰霉病菌。

本发明的显著优点

本发明提供了一组适用于番茄灰霉病菌LAMP检测的引物对；将该组引物对应用于番茄灰霉病菌LAMP检测具有快速、简便、特异性强、灵敏度高等优点；可用于带菌植株组织和土壤中番茄灰霉病菌的检测，或用于番茄灰霉病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：本发明分析了番茄灰霉病菌ITS序列和其他病原菌在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的LAMP引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明利用所设计出的LAMP引物基础上建立了番茄灰霉病菌LAMP检测方法，只有番茄灰霉病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明LAMP检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高：本发明对番茄灰霉病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：本发明的LAMP检测方法不像PCR检测法需要要热循环仪（PCR仪）等贵重仪器设备，这样就摆脱了对热循环仪等贵重设备的依赖；只要有稳定的热源，LAMP 反应就可以发生，极大扩展了番茄灰霉病菌的检测范围。同时，本发明的LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。

4、操作简便快速：本发明提供的检测番茄灰霉病菌的LAMP方法克服了现有技术中番茄灰霉病菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪等贵重设备的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到番茄灰霉病菌，不需要复杂仪器，只需一个恒温设备即可，能较好满足对番茄灰霉病菌的现场检测。

附图说明

图1 为本发明番茄灰霉病菌的LAMP特异性检测，其中管1-3呈绿色，4-8呈橙色。图中1-3为番茄灰霉病菌，4-7分别为葱腐葡萄孢、蚕豆葡萄孢、番茄晚疫病菌、番茄早疫病菌，8为阴性对照。

图2 为本发明番茄灰霉病菌LAMP检测灵敏性，其中管1-6呈绿色，7-10呈橙色。图中1-9模板DNA浓度分别为1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，10为阴性对照。

图3 为本发明检测方法对发病植株和带菌土壤中番茄灰霉病菌的检测，其中管1-4呈绿色，5-8呈橙色。图中1为阳性对照，2-3为番茄晚疫病发病叶片，4为番茄晚疫病发病田块土壤，5-6为健康番茄叶片，7为高压灭菌土壤，8为阴性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：番茄灰霉病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/LNaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r· min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3mol.L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

表1 供试菌株

2. 番茄灰霉病菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物的设计

通过测定番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和其它灰霉病菌（Botrytis spp）的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对灰霉菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套番茄灰霉病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列发下：

F3: 5’- AGCTTG- TCGACCAAGTTCTT-3’，

B3: 5’- ACGGTATCGGAAACCTTTGG-3’，

FIP: 5’- CCACCACCGAGAGAGTGGGTAA -TCGTGAAGCTGAAGGCTGT-3’，

BIP: 5’- TCTCCAAGATCCGCGAGGAGT -CGATGGGACGACGGAGAA- 3’。

3.番茄灰霉病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63.5 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番茄灰霉病菌；橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在番茄灰霉病菌。

4.引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试的菌株中只有番茄灰霉病菌显色结果可观察到绿色荧光，其余真菌显色结果为橙色（附图1），说明所设计的番茄灰霉病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP可以将番茄灰霉病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于番茄灰霉病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：番茄灰霉病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

用无菌超纯水对番茄灰霉病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的番茄灰霉病菌基因组DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63.5 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

3. LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的番茄灰霉病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光；其余浓度及阴性对照显色结果为橙色。说明所设计的番茄灰霉病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP通过LAMP扩增，对番茄灰霉病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（附图2）。

实施例3：发病组织中番茄灰霉病菌的LAMP检测

样品采集：从福建周宁、三明、连城采集番茄灰霉病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63.5 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

检测结果：检测结果（附图3）表明，番茄灰霉病发病的叶片通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在番茄灰霉病菌；而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在番茄灰霉病菌，该套技术能用于植物组织中番茄灰霉病菌的快速分子检测。

实施例4：带菌土壤中番茄灰霉病菌的LAMP检测

样品采集：从福建周宁、三明和连城番茄灰霉病发病严重的田块采集植株根部土壤带回实验室备用，以高压灭菌的土壤为对照；

土壤DNA提取：采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNAIsolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

检测结果：检测结果（附图3）表明，番茄灰霉病发病严重田块土壤DNA通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在番茄灰霉病菌，而高压灭菌土壤及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在番茄灰霉病菌，该套技术可用于土壤中番茄灰霉病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> F3

<400> 1

agcttgtcga ccaagttctt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> B3

<400> 2

acggtatcgg aaacctttgg 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> FIP

<400> 3

ccaccaccga gagagtgggt aatcgtgaag ctgaaggctg t 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> BIP

<400> 4

tctccaagat ccgcgaggag tcgatgggac gacggagaa 39

Claims

1.番茄灰霉病菌LAMP检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：

F3: 5’- AGCTTGTCGACCAAGTTCTT-3’，

B3: 5’- ACGGTATCGGAAACCTTTGG-3’，

FIP: 5’- CCACCACCGAGAGAGTGGGTAATCGTGAAGCTGAAGGCTGT-3’，

BIP: 5’- TCTCCAAGATCCGCGAGGAGTCGATGGGACGACGGAGAA- 3’。

2.一种利用权利要求1所述引物制备的番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，其组分为：一对外侧引物F3/B3、一对内侧引物FIP/BIP、LAMP反应混合液、8U Bst聚合酶以及核酸染料1000×SYBR Green I。

3.如权利要求2所述的一种番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应混合液由40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs和0.2% Trion X-100组成。

4.一种利用权利要求2所述番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒检测番茄灰霉病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品DNA；

（2）LAMP反应体系配制：以步骤（1）提取的DNA为模板，在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5μM外侧引物F3和B3各1.0μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP 反应：将步骤（2）中PCR 管于63.5℃恒温反应60min ；

（4）分析判断反应产物结果：待LAMP反应结束后，在步骤（3）中所得反应产物中加入1.0μl SYBR green Ⅰ核酸染料，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番茄灰霉病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在番茄灰霉病菌。

5.利用权利要求1所述的番茄灰霉病菌LAMP检测引物在番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。

6.利用权利要求2所述的番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒在番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。