CN106755538A

CN106755538A - 灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法

Info

Publication number: CN106755538A
Application number: CN201710122876.7A
Authority: CN
Inventors: 张传清; 胡小然; 时浩杰; 戴德江
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增引物；本发明还同时公开了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒除了包含上述LAMP引物组合物，还包含10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。采用本发明能现场实现快速检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，从而及时指导防治灰霉病的科学用药。

Description

灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环介导等温扩增技术检测含有BCbi143/144内含子灰霉病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定、防治及病原菌抗药性风险预警的技术领域。

背景技术

灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)属于半知菌类丝孢纲丝孢目葡萄孢属，是一条件致病菌，腐生性强，属坏死型植物病原真菌，具有潜伏侵染的特点，潜伏期较长。灰葡萄孢的寄主专化性不强，寄主范围广，可侵染230多种植物，不同寄主植物间的灰葡萄孢可交互侵染，因而很难像专性寄生菌那样发现有效的抗病材料，故而很难培育出抗病品种。

灰霉病菌因具有寄主范围广、繁殖快和遗传变异频繁等特点，使其极易对杀菌剂产生抗性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(QoIs)是一类来源于具有杀菌活性的天然抗生素strobilurinA的新型杀菌剂，包括嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯等药剂，具有广谱高效的抗菌活性。由于其具有独特的作用靶标，与其它现有的杀菌剂不存在交互抗性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用于真菌线粒体呼吸链上的复合体III，通过与细胞色素b基因编码的cytb的Qo位点结合来抑制呼吸链上的电子传递，进而影响呼吸作用阻碍病原真菌的合成，干扰细胞正常分裂和生长，进而造成菌体死亡。

从1996年欧洲开始使用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂防治小麦白粉病到现在，灰霉病菌对嘧菌酯等QoI药剂产生了明显的抗药性。据报道，CYTB上的点突变G143A，F129L和G137R可以引起灰霉病菌对QoI药剂不同水平的抗药性，但是，灰霉病菌田间抗性的产生主要是因为点突变G143A，药剂压力可以提高G143A突变基因的频率，而且该点突变引起的抗性水平稳定。研究表明灰霉病菌中存在2种类型的cyt b基因：Ⅰ型cyt b基因在第143位密码子后紧跟内含子；Ⅱ型cyt b基因在第143位密码子后没有紧跟内含子。灰霉病菌对QoI药剂产生抗性的机制主要是菌株的cyt b基因的第143位密码子由甘氨酸(GGC)突变为了丙氨酸(GCC)，即抗药性机制为cyt b基因的G143A点突变。

QoI药剂是目前市场占有率最高的一类杀菌剂，但是容易抗药性是其面临的主要问题。一旦产生抗药性，药剂的防治效果就会显著降低甚至完全失效。农民就会不断提高药剂的使用剂量，不但防治效果不佳，用药量过高后还可能带来农产品安全和环境安全问题。因此，在防治灰霉病时，在施药前如果能快速确定该地的灰霉病菌是否对QoI药剂容易产生抗药性，对于指导科学用药具有十分重要的意义。而普通的生物测定技术或者PCR等分子生物学技术都不能达到这一要求，生物测定技术需要的时间很长(至少1周以上)、工作量达；PCR等分子生物学技术不但需要昂贵的仪器设备还需要熟练的高级技术操作人员。且目前的生物测定技术或者PCR等分子生物学技术都是用于时候测定病菌对药剂的抗性状况。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是于2000年由Notomi等首次发明、报道的一种新型、方便快捷、灵敏度极高且廉价的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的个区域设计条特异性引物，在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作下，60～65℃恒温扩增，60min左右即可观察结果，具有操作简单、快速、特异性强、产检测便捷等特点。在反应液中添加适当的染料和金属离子，通过指示反应液颜色变化来判断反应结果，加入HNB(羟基萘酚蓝)，在日光灯下通过肉眼即可观察到颜色变化，阳性反应结果会由蓝紫色变成天蓝色。从扩增原理可知，扩增过程中会产生大量大小不一的片段(即茎环DNA、若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构)，当用的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测时，会出现一系列呈梯状的电泳条带。因此，可以利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，来判断是否进行扩增。待测样品为阳性时，会出现呈梯状的电泳条带，反之，不出现呈梯状的电泳条带。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法，即，一种用于检测含有BCbi143/144内含子灰霉病菌的环介导等温扩增方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，该LAMP引物组合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物TB3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ IDNO.4所示的反向内引物BIP组成；

本发明还同时提供了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含上述LAMP引物组合物。

作为本发明的试剂盒的改进：LAMP引物组合物的浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

作为本发明的试剂盒的进一步改进：试剂盒还包含：10×ThermoPol Buffer、dNTPs(1mM)、MgCl₂(5mM)、甜菜碱(0.8M)、羟基萘酚蓝(150μM，HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

备注：上述成分组成了环介导等温扩增反应预混液。

本发明还同时提供了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增方法：

25μL反应体系由以下成分组成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mMMgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱4.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。

作为本发明的环介导等温扩增方法的改进：

利用25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，扩增结果的分析和判定方法为选择以下任一：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果为天蓝色判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即显示样品无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌含量未达检测限；

方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含的有BCbi143/144内含子的灰霉病菌未达检测限。

作为本发明的环介导等温扩增方法的进一步改进，LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

作为本发明的环介导等温扩增方法的进一步改进：所述方法一、方法二中的检测限DNA浓度为1pg/μL。

本发明的LAMP引物组合物能用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。

在本发明中，依据灰葡萄孢菌cytb基因第143位氨基酸后紧跟的内含子序列，基于环介导恒温扩增技术建立了含有BCbi143/144内含子灰霉病菌的环介导等温扩增方法，此种类型灰霉菌株均为对QoI药剂抗性风险低的菌株。通过快速的现场含有BCbi143/144内含子灰霉病菌检测，能及时指导防治灰霉病的科学用药。该检测技术具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的检测、抗药性风险预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有含有BCbi143/144内含子灰霉病菌的快速分子检测的相关报道，更没用将LAMP技术应用于快速评价病菌对药剂的抗药性风险的相关技术或报道。

LAMP快速检测技术特异性高，4条引物针对6个不同的区域，任何一个不能匹配反应就无法进行(因此，引物的设计非常重要)，因此特异性高，而且由于简便、快速、准确、廉价、以及不需要特定实验仪器就能快速完成检测，所以更适用于在田间种植基地等基层部门应用。并且本发明首次将LAMP应用于快速评定某地灰霉病菌对药剂抗药性的抗药性风险。

本发明的发明方案具体如下：

1、引物的设计和筛选

引物的筛选是LAMP检测的关键因素，首先从灰霉病菌数据库中下载cytb的基因组序列进行比对分析，根据BCbi143/144内含子的1205bp序列，利用在线软件Primer ExploreV5设计LAMP引物，合理设置各组引物的含量(设置CG含量为50-60％)、发夹结构形成倾向、自身配对倾向等指标，选择比较优化的组合进行设计，调整各条引物退火温度：Flc和Blc(64-66℃)，F2和B2(59-61℃)，F3和B3(55-60℃)，从而确定正向外引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，筛选设计出5套引物，然后对这5套引物进行进一步试验筛选。

表1、初筛引物信息表

筛选过程为：

以筛选出能与含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌反应的LAMP引物为目的，以含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌DNA为模板，取1μL DNA溶液，加入24μL由不同LAMP引物所配制反应液进行LAMP反应，反应温度设为65℃，60min；反应后观察反应管颜色变化，常光下，显色结果观察反应管由反应前蓝紫色变成天蓝色，则该引物符合实验要求，可继续下一步反应条件优化实验；取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，若不能进行显色反应及出现梯形条带，则该引物不符合实验要求，废弃。

所得结果如图1所示，具体为：设计的5套引物对应的反应产物有明暗不同的条带出现，但只有S2引物组，扩增条带最清晰，且反应管颜色变化最明显。可将含有BCbi143/144内含子灰霉病菌样品扩增出来。因此，挑选引物组S2进行下一步实验。

最终筛选出一套稳定性和特异性相对最好的引物，如下述表2所示。

表2、本发明中检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的LAMP引物组合物

2、特异性实验

验证能特异性检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的LAMP引物为目的。用本发明试剂盒即上述筛选出的相对最佳引物组合，同反应预混液构成检测液，对不同灰霉菌株DNA(浓度均为100ng/μL)1μL进行检测，加入24μL所述检测溶液进行LMAP反应，并设置双蒸水为阴性对照。反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。进一步用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证。反应后观察反应管颜色变化，结果见图3。含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的反应管均发生了颜色变化，对应的电泳检测结果也均有典型的LAMP梯形条带产生，而不含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的反应管和阴性对照反应前后均未发生颜色变化，电泳检测也结果表明，没有LAMP条带产生。检测到三株含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌菌株(编号为1，2，3；寄主分别为草莓，草莓，番茄)和四株不含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌菌株(编号为4～7，寄主分别为草莓，草莓，番茄，番茄)说明该引物组可以特异性检测出含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。

本发明通过对灰霉病菌cytb基因所含BCbi143/144内含子的1205序列进行LAMP引物设计，筛选出特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立该菌对QoI杀菌剂抗性风险的快速评定技术，可用肉眼观察检测结果。

本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：

1)、实用性好。传统的杀菌剂敏感性检测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为敏感型菌株，该方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，耗时长。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳，需要溴化乙锭(EB)染色并在紫光灯下观察才可判别结果，且检测时间长，检测成本高昂，不能满足经济高效检测的需求。而LAMP反应只需在恒温(65℃)下进行，反应结束后可通过肉眼在常光下直接判断结果，能快速检测出病原菌抗药性，从而增加了其在田间检测的应用价值。

2)、恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源如恒温水浴锅LAMP反应就可以完成，不需要昂贵的仪器设备，因而便于基层农业生产单位推广应用。LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

3)、准确性高。传统的灰霉病菌抗药性检测技术是在含药培养基上培养鉴定，鉴定方法耗时长、易受人为及环境等诸多因素的干扰。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都显著提高，几乎不受其他任何外源DNA和杂质的影响。所以更适用于在田间种植基地等基层部门应用，为生产中病原菌对药剂抗药性群体发展的风险监测、抗药性植物病害的流行预测及植物病害的综合防控提供用药指导。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为引物筛选图；

a：引物筛选LAMP显色变化图；b：引物筛选LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL2000DNAMarker；1、2、3、4、5代表5组引物组合，6、ddH₂O阴性对照。

图2为试剂盒通用性考察；

a：LAMP显色变化图；b：LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL2000DNAMarker；1、不含BCbi143/144内含子的灰霉病菌；2、含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；3、ddH₂O。

图3为LAMP检测不同类型灰霉菌株；

a：特异性LAMP显色变化图；b：LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL2000DNAMarker；1、2、3：含有BCbi143/144内含子的不同灰霉病菌菌株；寄主分别为草莓，草莓，番茄；4、5、6、7：不含有BCbi143/144内含子的不同灰霉病菌菌株；寄主分别为草莓，草莓，番茄，番茄；8：ddH₂O空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中使用的主要试剂及仪器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs、MgCl₂(Sigma)，dNTPs，甜菜碱、ddhH₂O水、分子质量标准DL DNA Maker(TaKaRa生物工程公司基因组)、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)，上海精宏实验仪器厂DK-8D型电加热恒温水浴锅。

以下所用的所有含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌以及不含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，均已事先检测证明了其定性的正确性。

实施例1、本发明最佳LAMP反应引物组筛选：

根据灰霉病菌cytb基因(NW_001814458.1)，BCbi143/144内含子的1205bp序列，设计LAMP引物，合理设置各组引物的CG含量为50-60％、发夹结构形成倾向、自身配对倾向等指标，选择比较优化的组合进行设计，调整各条引物退火温度：Flc和Blc(64-66℃)，F2和B2(59-61℃)，F3和B3(55-60℃)，从而确定正向外引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，筛选设计出5套引物，以含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌菌株的DNA为模板进行LAMP试验，筛选出能特异性检测出含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌菌株的LAMP引物组合。

各引物序列如下：

F3：5’-CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT-3’

B3：5’-CGTACAGTAACCATGGGATA-3’

FIP：5’-TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG-3’

BIP：5’-CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT-3’。

实施例2、本发明反应体系及检测试剂盒体系优化：

为了确定反应检测体系中各组分的最佳含量构成，设置Bst DNA polemerase(0.08/0.16/0.24/0.32/0.40U/μL)，dNTPs(0.4/0.6/0.8/1.0/1.2mM)，甜菜碱(0.6/0.8/1.0/1.2/1.4M)，F3/B3引物(0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μM)和FIP/BIP引物(0.4/0.8/1.2/1.6/2.0μM)，最终确定反应25μL体系：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、5mM MgCl₂、0.8M甜菜碱、150μM羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

实施例3、一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的LAMP试剂盒：

该试剂盒包含环介导等温扩增引物混合液和环介导等温扩增反应预混液构成的检测溶液，引物组合混合液浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、5mM MgCl₂、0.8M甜菜碱、150μM羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

且LAMP引物组序列如下：

F3：5’-CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT-3’

B3：5’-CGTACAGTAACCATGGGATA-3’

FIP：5’-TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG-3’

BIP：5’-CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT-3’。

检测溶液共24μL，加入待测DNA模板1μL，构成25μL检测反应体系。体系中含有8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱4.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至25μL。

实施例4、本发明试剂盒通用性考察：

选择含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，以不含有BCbi143/144内含子的不同灰霉病菌DNA模板作为阴性对照；ddH₂O作为空白对照。取1μL DNA溶液(浓度为：100ng/μL)，加入24μL实施例3中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管颜色变化，图2可以看出，常光下，第二个PCR管中含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株的样品在常光下变为天蓝色，第一个PCR管中不含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株样品的阴性对照和第三个PCR管中含有ddH₂O空白对照的反应管均呈蓝紫色；分别取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，只有第二管含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株DNA的样品出现梯形条带，判断为阳性，即显示检测到BCbi143/144内含子的灰霉菌株，不含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株样品和ddH₂O空白对照均无扩增条带，则判断为阴性，说明本发明引物组合物及由此制备的试剂盒具有很好的通用性。

实施例5、本发明试剂盒对不同类型灰霉菌株特异性检测：

用本发明试剂盒对不同类型灰霉菌株DNA进行检测，取不同灰霉菌株DNA 1μL作为模板(浓度均为100ng/μL)，加入24μL实施例3中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管颜色变化，结果见图3。检测到3株含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株(反应管1、2、3，反应前后反应管颜色由蓝紫色变为天蓝色)；反应管4～7检测到为不含BCbi143/144内含子的灰霉菌株，反应前后颜色变化不明显，均为蓝紫色；反应管8为空白对照；凝胶电泳检测结果与显色结果相对应。

实施例6、本发明试剂盒的最低检测限(灵敏度)：

以考察本发明试剂盒检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的灵敏度，将含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌菌株DNA模板稀释为不同的浓度梯度分别为：100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。分别取不同浓度DNA 1μL作为模板，加入24μL实施例3中的检测溶液进行LMAP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管颜色变化，并进一步用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证。反应试验结果具体为：BCbi143/144内含子的灰霉病菌DNA模板浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL时LAMP反应结果均呈阳性，反应前后反应管的颜色由蓝紫色变成天蓝色，且用2％琼脂糖凝胶电泳检测反应后产物，均有典型的LAMP梯形条带出现；当模板DNA浓度低于1pg/μL时反应前后反应管颜色无明显变化，仍为蓝紫色，2％琼脂糖凝胶电泳检测也无梯形条带出现。本反应中普通PCR的最低检测限为100pg/μL，结果表明本发明LAMP反应的灵敏度达到1pg/μL是普通PCR的100倍。

实施例7、本发明试剂盒的S2引物组与其他引物组优越性对比：

根据实施例6得出，由S2引物组构成的检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌试剂盒的最低检测限为1pg/μL，进一步对比其他S1、S3、S4、S5引物组的构成的检测液，最低检测限分别为100ng/μL、10ng/μL、100ng/μL、100ng/μL，但反应产物颜色变化均不明显且没有S2引物组变化明显，电泳检测结果均只是有少量条带产生。即使DNA浓度调至1000ng/μL，S1、S3、S4、S5引物组的构成的检测液反应产物颜色变化仍然不明显，此结果表明S2引物组的灵敏度远远大于其他引物组，且反应前后反应管颜色变化最明显，电泳条带最清晰。

实施例8、本发明试剂盒对其他外源植物病原菌的特异性检测：

为了检验本发明试剂盒的特异性，用本发明试剂盒对其他外源植物病原菌进行LAMP检测。以含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株(Botrytis cinerea)作为阳性对照，不含BCbi143/144内含子的灰霉菌株(Botrytis cinerea)作为阴性对照，以双蒸水作为空白对照，利用实施例3中所述的发明试剂盒，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min，对含有cyt b-G143(2157bp)内含子交链格孢(Alternaria alternata)、大豆核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)等不同基因型及病原菌为供试材料，进行LAMP检测。反应检测结果表明，只有含有BCbi143/144内含子的灰霉菌株(Botrytis cinerea)的阳性对照的反应产物发生颜色变化，电泳检测有典型的LAMP梯形条带，其他供试菌株反应产物颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，且电泳检测结果也判断为阴性。表明本发明检测方法具有排他性和特异性。

对比例1-1、将F3、B3改成如下内容：

F3-1：GACTAGAATTAACATCTACCGAATT

B3-1：CGAGTTCCGTTTCCATGT；

其余内容等同于实施例3。

所得结果为：取1μLDNA模板(浓度为：100ng/μL)，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管无颜色变化，结果表明该引物组构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。即使将DNA模板的浓度增加至1000ng/μL，仍然无法有效区分。

对比例1-2、将F3、B3改成如下内容：

B3-1：GGAAGTGGGGTTAAACTTG

F3-2：CAATTTGTAAAACATAGTGGGC；

其余内容等同于实施例3。

所得结果为：取1μLDNA模板(浓度为：500ng/μL)，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管无颜色变化，结果表明该引物组构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。即使将DNA模板的浓度增加至1000ng/μL，仍然无法有效区分。

对比例2-1、将FIP、BIP改成如下内容：

FIP-1：GCTGGAATACGTTTAGCCATTTGATTATGGTTTTATTAAGTGCGTCT

BIP-1：AACGAATAGGACCGCATCATCACGGTACTCAGCGTGAGAA；

其余内容等同于实施例3。

所得结果为：取1μLDNA溶液(浓度为：100ng/μL)，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管无颜色变化，结果表明该引物组构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。即使将DNA模板的浓度增加至1000ng/μL，仍然无法有效区分。

对比例2-2、将FIP、BIP改成如下内容：

FIP-2：TTGCACCGAAGATTTTAATCCAAATCAACTAACTCTTTCACTTTTGAGG

BIP-2：AGTGCAGGAGTGAAAGACCAGGTGTTGCTTTACTAAACTTCGTAAT；

其余内容等同于实施例3。

所得结果为：所得结果为：取1μLDNA溶液(浓度为：100ng/μL)，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应管无颜色变化，结果表明该引物组构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。即使将DNA模板的浓度增加至1000ng/μL，仍然无法有效区分。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江农林大学

<120> 灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法

<160> 4

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F3

<400> 1

cctaatcaaa tggctaaacg tatt 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物TB3

<400> 2

cgtacagtaa ccatgggata 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物FIP

<400> 3

tgagaatcac ctaagagtga accatgcttt taaacgaata ggaccg 46

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BIP

<400> 4

ccgattacat ggaaacggaa ctcaaaagtc atgcagtcac aat 43

Claims

1.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：

F3：CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT；

TB3：CGTACAGTAACCATGGGATA；

FIP：TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG；

BIP：CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT。

2.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP引物组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合物的浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含：10×ThermoPolBuffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

5.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：25μL反应体系由以下成分组成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱4.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝1μL、DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL。

6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：

利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，扩增结果的分析和判定方法为选择以下任一：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果为天蓝色判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即显示样品无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌含量未达检测限；

7.根据权利要求6所述的环介导等温扩增方法，其特征在于LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

8.根据权利要求7所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述方法一、方法二中的检测限DNA浓度为1pg/μL。