CN109182580A

CN109182580A - 一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法

Info

Publication number: CN109182580A
Application number: CN201811177195.1A
Authority: CN
Inventors: 熊琴; 郑新月; 张琳琳; 张晨; 钱雨琳
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-10-09
Also published as: CN109182580B

Abstract

本发明公开了一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，提取杨树黑斑病叶片的基因组DNA，进行LAMP反应；反应产物直接由肉眼鉴定溶液颜色，天蓝色为阳性，紫色为阴性；选择阳性溶液进行凝胶电泳进一步验证，产物呈现阶梯状条带，为由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病。本申请建立的诊断方法是一种反应速度快、特异性强、设备简单、反应结果易于判别鉴定的检测技术。等温扩增及HNB染料的肉眼观察检测，使LAMP分析适用于自然条件下杨生褐盘二孢菌的检测和监控，具有广阔的应用前景。

Description

一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法

技术领域

本发明属于杨树黑斑病诊断技术领域，具体涉及一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌(Marssonina brunnea)引起的杨树黑斑病的方法。

背景技术

杨树(Poplar)因其自身独特的生物学特性已成为林木基因组学研究的模式物种，是一种主要的人工造林树种，具有较高的经济环保价值。目前我国杨树人工林栽植面积已超过700万公顷，居世界首位，但杨树人工林的林分结构单一，因此容易导致大规模的病虫害暴发流行，丧失其生态、经济和社会价值，造成巨大损失。杨树黑斑病是其重要病害之一，是由半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目盘二孢属(Marrssonina)中的三种病原真菌(杨盘二孢菌(Marrssoninapopuli)；杨生褐盘二孢菌(Marrssonina brunnea)；白杨生褐盘二孢菌(Marssonina castagnei)所引起的(Han et al.，2000)，发生范围相当广泛，是影响木材产量和质量的最严重的威胁之一。其中，杨生褐盘二孢菌(M.brunnea)在欧洲、美洲、大洋洲及亚洲几乎所有杨树栽培的地方，不管是黑杨派、白杨派、青杨派杨树等或其杂交种中均有分布，其会在杨树叶表面和背面以及幼嫩的叶柄、茎段上侵染而产生黑色斑点，从而导致杨树叶片的过早脱落，严重削弱了树势，使得植株光合作用效率下降，严重影响杨树生长量，从而使经济效益明显下降(Zhu et al.，2012)，被认为是杨树黑斑病的主要致病因子。在国内，根据寄主专化型，杨生褐盘二孢菌又被分为单芽管专化型(M.brunneaf.sp.monogermtubi)和多芽管专化型(M.brunnea f.sp.muitigermtubi)。单芽管专化型菌株菌落生长速度较快，菌落颜色为深褐色，并产生酱红色的孢子堆，孢子萌发时只产生一个芽管，对毛白杨(Populus tomentosa)有较强的致病力；而多芽管专化型菌落生长速度较慢，菌落颜色较浅，产生黄绿色孢子堆，孢子萌发时可产生1-5个(一般2-3个)芽管，对黑杨派(Populus euramericana)I-45杨和加杨(Populus canadensis)有较强的致病力(Han etal.，1997)。这些芽管直接穿透通过杨树叶片表皮和表皮壁或间接从气孔穿透形成附着胞(Spiers&Hopcroft，1983)。然而，迄今为止，许多常规杀菌剂对防控杨生褐盘二孢菌都没有明显效果，因此，需要更有效的快速诊断方法以期在出现症状前期检测这种致病菌。目前还未有关于杨生褐盘二孢菌的分子检测报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，具有特异性强和灵敏度高等优点。本发明的另一目的是提供一种鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，具有特异性强和灵敏度高等优点。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，提取杨树黑斑病叶片的基因组DNA，进行LAMP反应；反应产物直接由肉眼鉴定溶液颜色，天蓝色为阳性，紫色为阴性；选择阳性溶液进行凝胶电泳进一步验证，产物呈现阶梯状条带，为由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病，否则不是；其中，LAMP反应所使用的引物序列具体如下：

F3：5′-CGCCAGAGGACCACAA-3′；

B3：5′-CCTTCGGAATGCCAAAGG-3′：

FIP：5′-CCAGAACCAAGAGATCCGTTGTCCCGTGCCATGTCAGT-3′；

BIP：5′-TGAAGAACGCAGCGAAATGCCGCAATGTGCGTTCAAAG-3′。

所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，LAMP反应还添加有环引物FL、BL，其序列具体为：

FL：5′-ACTATTATATAGTACTCAGACGAC-3′

BL：5′-TGCAGAATTCAGTGAATCATCGA-3′。

所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，25μL LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，4.0μL MgSO₄，4.0μL甜菜碱，3.5μL dNTPs，各2.0μLFIP/BIP，各0.5μL F3/B3，各1.0μL LF/LB，2.0μL HNB，1.0μL Bst DNA聚合酶，1.0μL模板DNA。

所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，LAMP反应程序为：62-65℃反应20-60min，80℃加热5分钟停止反应。优选LAMP反应温度为65℃，反应35min。

一种鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，提取待鉴定菌株的基因组DNA，进行LAMP反应；反应产物直接由肉眼鉴定溶液颜色，天蓝色为阳性，紫色为阴性；选择阳性溶液进行凝胶电泳进一步验证，产物呈现阶梯状条带，为杨生褐盘二孢菌，否则不是；其中，LAMP反应所使用的引物序列具体如下：

F3：5′-CGCCAGAGGACCACAA-3′；

B3：5′-CCTTCGGAATGCCAAAGG-3′；

FIP：5′-CCAGAACCAAGAGATCCGTTGTCCCGTGCCATGTCAGT-3′：

BIP：5′-TGAAGAACGCAGCGAAATGCCGCAATGTGCGTTCAAAG-3′。

所述的鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，LAMP反应还添加有环引物FL、BL，其序列具体为：

FL：5′-ACTATTATATAGTACTCAGACGAC-3′

BL：5′-TGCAGAATTCAGTGAATCATCGA-3′。

所述的鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，25μL LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，4.0μL MgSO₄，4.0μL甜菜碱，3.5μL dNTPs，各2.0μL FIP/BIP，各0.5μLF3/B3，各1.0μL LF/LB，2.0μL HNB，1.0μL Bst DNA聚合酶，1.0μL模板DNA。

所述的鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，LAMP反应程序为：65℃反应35min，80℃加热5分钟停止反应。

有益效果：与现有技术相比，本发明的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，具有以下优势：

1)本方法特异性强，只有杨生褐盘二孢菌专化型菌株基因组DNA有阳性扩增产物，而其它非杨生褐盘二孢菌菌株没有，反应体系中另外再加入2条环引物以加快扩增反应，将恒温反应期缩短一半，扩增时间只需35分钟即可呈现结果。

2)本发明与传统的PCR进行了比较评估，结果表明本方法灵敏度更高、特异性更强、等温、操作简单和检测结果快速、易于判别鉴定等优点，是首选的诊断技术。LAMP最低检测阈值为10pg/μL，比PCR灵敏100倍。而且，LAMP只需35分钟就能完成反应，与PCR至少90分钟相比，明显更快，扩增效率更高。

3)相对于PCR，LAMP在诊断速度方面有很大的优势，反应结果可以立即通过肉眼观察判定。同时，因为没有变性的过程，所以不需要热循环仪，简单的水浴锅或等温保温瓶即可进行LAMP反应。因此，与要求先进仪器的PCR相比，LAMP的检测成本较低。

4)从人工接种感病的和自然发病的杨树叶片中检测杨生褐盘二孢菌，LAMP检测相比于PCR检测显示出较强特异性，没有假阳性或假阴性结果，结果表明本申请的技术体系可准确高效地从发病组织中直接检测出该病原菌，为该菌引起的杨树黑斑病的快速诊断提供了新技术。

5)综上所述，本申请的方法是一种反应速度快、特异性强、设备简单、反应结果易于判别鉴定的检测技术。方法中采用等温扩增及HNB染料的肉眼观察检测，使LAMP分析适用于自然条件下杨生褐盘二孢菌的检测和监控，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是不同温度条件下的LAMP检测图；图中，M：MarkerIII(天根，MD103，中国)；1-4：温度分别为60℃、62.5℃、65℃、67.5℃；NC：空白对照(无模板DNA)。

图2是LAMP方法和PCR方法对杨生褐盘二孢菌的特异性检测比较结果图；图中，A.琼脂糖凝胶电泳LAMP分析；B.HNB染色LAMP分析；C.PCR方法；1-6：杨生褐盘二孢菌单芽管专化型菌株(依次是QC2，QM2，QM3，QM6，QM8和QM15)；7-12：杨生褐盘二孢菌多芽管专化型菌株(依次是J1，J3，214-2，214-4，XY-1和XY-3)；13-14：盘二孢属中其他两个菌株(苹果盘二孢NL-1和月季盘二孢Ms-3)；15-20：其他真菌类群的6个菌株，分别为大豆疫霉P6497、平头炭疽TB8-06-2、稻瘟病菌Guy11、腐皮镰孢菌FS-1、黄萎病菌Vd-1和板栗疫病菌BB-1-5；NC：空白对照(无DNA模板)；M：Marker II(天根，MD102，中国)；

图3是LAMP方法和PCR方法对杨生褐盘二孢菌的灵敏度检测比较结果图；图中，A.琼脂糖凝胶电泳LAMP分析；B.HNB染色LAMP分析；C.PCR方法；M：Marker II(天根，MD102，中国)；1-9：不同DNA模板浓度(依次为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL)；NC：空白对照(无DNA模板)；

图4是人工接种感病叶片中杨生褐盘二孢菌的LAMP和PCR检测法比较结果图；图中，A.琼脂糖凝胶电泳LAMP检测分析；B.HNB染色LAMP检测分析；C.PCR检测；PC：阳性对照(杨生褐盘二孢菌XY-3菌株基因组DNA为模板)；NC：阴性对照(从用水代替孢子液喷雾接种健康的杨树叶片中所提取的基因组DNA为模板)；1-8：从杨生褐盘二孢菌单芽管专化型QC2菌株人工接种后发病的毛白杨杨树叶片中所提取的基因组DNA为模板；9-16：从杨生褐盘二孢菌多芽管专化型214-4菌株人工接种后发病的意大利214杨树叶片中所提取的基因组DNA为模板；M：Marker II(天根，MD102，中国)。

图5是林间自然感病杨树叶片中杨生褐盘二孢菌的LAMP和PCR检测法比较结果图；图中，A.琼脂糖凝胶电泳LAMP检测分析；B.HNB染色LAMP检测分析；C.PCR检测。PC：阳性对照(杨生褐盘二孢菌XY-3菌株基因组DNA为模板)；NC：阴性对照(从健康的杨树叶片中所提取的基因组DNA为模板)；NT：空白对照，无DNA模板；1-16：依次从16张有典型黑斑病症状的杨树叶片中提取基因组DNA为模板；M：Marker II(天根，MD102，中国)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

LAMP的引物是依据Genbank公布的杨生褐盘二孢菌多芽管专化型和单芽管专化型的rDNA ITS序列(Genbank accession no.KU508806和Genbank accession no.KM246324)设计的。从Genbank数据库中同时下载其它盘二孢属病原菌ITS序列(苹果盘二孢-EU520097、月季盘二孢-AY904059和苹果盘二孢-JN587494)，应用BioEditV7.2.0进行序列比对分析(Alzohairy，2011)。利用引物设计软件PrimerExplorer V4(http：∥primerexplorer.jp/e/)，依据LAMP引物的设计原则，进行LAMP引物设计(Eiken ChemicalCo.，Ltd.，Tokyo，Japan)。共设计了六条引物，其中两条外引物(F3/B3)和两条内引物(FIP/BIP)，它们能识别目标DNA的六个不同区域，另外两个额外的环引物(FL/BL)，可以加速LAMP的反应。各引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成并纯化。

表1基于ITS序列设计的LAMP引物序列

实施例2

1、真菌材料和基因组DNA提取

用于检测的20种供试菌株、来源及数量见表2，其中杨生褐盘二孢菌多芽管专化型和单芽管专化型菌株各6株，盘二孢属其他菌株苹果盘二孢和月季盘二孢各1株，还有6株属于其它真菌类群的，分别为大豆疫霉(Phytophthora sojae)、平头炭疽(Colletotrichumtruncatum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、黄萎病菌(Verticillium dahli卯)和板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)。将供试菌株转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上(每升加200克马铃薯，2％的葡萄糖和2％的琼脂)，25℃黑暗培养。从菌落边缘切取10块(2mm×2mm)菌丝块转移至马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中震荡培养3-5天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨为菌丝粉，-20℃备用。然后用DNeasyPlant Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)提取菌丝体的基因组DNA。提完gDNA后用超微量分光光度计NanoDrop ND-3300 fluorospectrometer(Thermo-Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)测定样品的浓度。

表2 20种供试菌株、来源及数量

表中，*NJAU为南京农业大学

2、LAMP反应体系及其结果判断

该LAMP反应体系为(25μL)：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，4.0μL MgSO₄(50mM)，4.0μL甜菜碱(5M，Sigma-Aldrich，USA)，3.5μL dNTPs(10mM)，各2.0μL FIP/BIP(20μM)，各0.5μL F3/B3(10μM)，各1.0μL LF/LB(10μM)，2.0μL HNB(2.4mM，阿拉丁，中国)，1.0μL BstDNA聚合酶(8U μL^-1，NewEngland Biolabs，Tokyo，Japan)，1.0μL模板DNA。去离子水代替菌株gDNA为模板作为阴性对照。为了摸索最优的LAMP反应体系，对LAMP反应中反应温度(60-67.5℃)和不同的反应时间(20-60min)进行优化，最后在80℃加热5分钟以停止反应。反应产物先直接由肉眼鉴定溶液颜色。阳性为天蓝色，阴性为紫色。结果用松下数码相机(ModelDMC-FZ28GK)拍摄记录。经过肉眼鉴定后，这些LAMP产物通过凝胶电泳进一步被验证(80v，2％的琼脂糖凝胶，50分钟)，只有杨生褐盘二孢菌基因组为模板时，其产物呈现阶梯状条带。每个试验至少重复3次。

实施例1设计的引物阳性LAMP反应后将产生大量不同大小的特征性梯状条带(见图1A)。当样品管中没有目的菌株的基因组DNA或没有F3、B3、FIP和BIP中任意一条引物时，LAMP反应不产生扩增。截至2018年8月，在NCBI序列数据库中采用BLAST对所有引物进行序列比对时发现这些引物具有很强的特异性。此外，经测序比对后发现，引物F3和B3扩增所得的杨生褐盘二孢菌部分ITS片段和NCBI数据库中杨生褐盘二孢菌多芽管专化型菌株HY14(GenBank accession number KU508806)和单芽管专化型菌株BBHB2(GenBank accessionnumber KM246324)的ITS有100％的相似性，说明引物F3和B3可用于常规PCR检测引物。

在LAMP反应体系中加入上述所设计验证的四种基本LAMP引物(F3、B3、F1P和B1P)，以100pg杨生褐盘二孢菌多芽管专化型菌株XY-3的基因组DNA为模板，将LAMP反应液分别在60℃、62.5℃、65℃和67.5℃不同恒温条件下进行60分钟孵化，以确定最佳反应温度，从而实现高效扩增。结果如图1A-B所示，只有在62.5℃和65℃时有明显的颜色变化和梯状条带，在其他反应温度下未观察到(见图1A-B)。扩增产物在65.0℃比在62.5℃时显示出更清晰的梯状条带和紫到天蓝的颜色变化，且较高的反应温度可减少引物的非特异性退火(Sung&Lu，2009)，因此，65.0℃被选为LAMP最优反应温度。随后对两个额外的环引物对反应动力学和灵敏度的影响进行了优化。结果发现，使用环引物时，只需要35分钟即可观察到阳性结果(从紫到天蓝色的颜色变化和典型的梯状条带)。因此，后续LAMP体系中均加入了环引物。

实施例3杨生褐盘二孢菌的传统PCR检测方法

对于传统的PCR，引物F3/B3用于扩增rDNA ITS序列的某一特定区域。PCR反应体系：1.0μL模板DNA，12.5μL PrimerSTAR Max Premix(2×，Takara，R045A)，各0.5μL F3/B3(10μM)，加去离子水至总体系为25μL。热循环程序：98℃，4分钟；31个循环(98℃，10秒；56℃，5秒；72℃，5秒)；72℃，5分钟。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳验证(120v，30分钟)，用溴化乙锭(ethidium bromide)染色，然后在紫外凝胶成像仪下拍照记录。DNAladder Marker II(天根，MD102，中国)作为尺寸参考。

用于评估LAMP技术特异性的菌株共20株，其中杨生褐盘二孢菌多芽管专化型和单芽管专化型菌株各6株，苹果盘二孢和月季盘二孢各1株，还有6株其它真菌类群的，分别为大豆疫霉、平头炭疽菌、稻瘟病菌、腐皮镰孢菌、黄萎病菌和板栗疫病菌(见表2)。在扩增之前，在反应液中加入HNB可以肉眼判断阳性或阴性结果。反应结束后，阳性样品反应液的颜色变为天蓝色，而阴性样品的颜色仍为紫色，且同时阳性样品产物经琼脂糖凝胶后呈典型的阶梯状条带。如表2所示，LAMP只对分离自江苏省毛白杨、加杨(Populus×canadensisMoench)、I-214杨和辽宁省小叶杨(Populus simonii Carr.)的12株杨生褐盘二孢菌gDNA产生阳性结果，对其它8株菌株gDNA不产生扩增(见图2A-B)。实验至少重复三次，以验证LAMP反应的特异性。结果表明，LAMP检测方法能特异地检测出来源不同地区不同杨树品种中的杨生褐盘二孢菌。如图2C显示，常规PCR也只对杨生褐盘二孢菌gDNA产生扩增，扩增产物大小为193bp，而对其他真菌gDNA和阴性对照不产生扩增，未见193bp产物条带(见图2C)。可见所建立的LAMP检测结果与常规PCR检测结果一致，进一步表明rDNA ITS靶标适用于杨生褐盘二孢菌的检测。

为了评估LAMP和PCR反应的灵敏度，杨生褐盘二孢菌代表性菌株XY-3基因组DNA模板经测定浓度后，进行10倍系列连续法稀释，使得质量浓度梯度依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。由图3A-B所示，DNA浓度从左向右依次下降。根据LAMP反应液的颜色变化和阶梯状条带的有无及根据PCR的1.5％琼脂糖凝胶电泳结果，对实验结果进行比较评估。每个试验至少重复3次。LAMP对杨生褐盘二孢菌基因组DNA的检测灵敏度达到10pg/μL(见图3A-B)。而常规PCR仅能从100ne/μl至1ne/μl的样品中有193bp的扩增产物(见图3C)。以上阴性对照均没有扩增产物(见图3A-C)。结果表明，LAMP检测对杨生褐盘二孢菌纯DNA的灵敏度比常规PCR检测高约100倍。

实施例4应用LAMP和PCR方法对人工接种发病叶片中的杨生褐盘二孢菌进行检测

冬天剪下若干健康的毛白杨(P.tomentosa Carr.)和意大利214杨(Populuseuramericana cv.I-214)枝条，于22℃恒温光照培养箱中12小时光照培养。12周后这些枝条产生约20-50片叶子，从中选择状态最佳的8片全伸展叶片，用灭菌水彻底冲洗五至六次，擦干并将其置于2％的水琼脂培养基上，叶背面朝上。

杨生褐盘二孢菌多芽管专化型菌株214-4和单芽管专化型菌株QC2在PDA上培养10天后将产生分生孢子，用无菌水冲刷配制上述两种菌株的孢子悬浮液，使其浓度调整为10⁵个孢子/毫升，并分别喷洒接种于意大利214杨和毛白杨叶背面，同时以去离子水喷洒健康叶背面为阴性对照，以杨生褐盘二孢菌代表性菌株XY-3的基因组DNA为阳性对照。处理后的叶片静置于光照培养箱(22℃、100％相对湿度(RH)、12小时光照)中。3天后，黑斑病症状开始出现。病叶摘下来后立即在液氮中研磨提取DNA。按照实施例2的方法，对人工接种发病叶片中的杨生褐盘二孢菌进行LAMP和PCR检测，每个样品至少重复三次。

用LAMP和PCR技术对人工接种杨生褐盘二孢菌后发病的16张杨树叶片进行检测，LAMP检测法的阳性率为16/16(100％)(见图4A-B)，而PCR的阳性率为10/16(62.5％)(见图4C)。在接种无菌水的健康叶片中，PCR和LAMP法结果均为阴性(见图4)。结果表明，LAMP技术可以更加高效地从人工接种感病杨树叶片中检测出杨生褐盘二孢菌。

实施例5应用LAMP和PCR方法对林间感病叶片中的杨生褐盘二孢菌进行检测

为了评估LAMP方法作为杨生褐盘二孢菌检测工具的实用性，从南京林业大学校园感病的毛白杨和意大利214杨上共采集了16片具有典型黑斑病的叶片，表2中供试的序号1-10的杨生褐盘二孢菌菌株均分离自这两棵杨树上。按照植物gDNA提取试剂盒(OmegaBiotek，中国)说明书上的步骤提取感病叶片gDNA，并用超微量分光光度计NanoDrop ND-3300 fluorospectrometer(Thermo-Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)测定样品gDNA的浓度。从病叶中提取的gDNA作为LAMP和PCR反应的模板，而健康叶片的gDNA作为阴性对照。以杨生褐盘二孢菌代表性菌株XY-3的gDNA作为阳性对照，每个样品至少重复三次。

对南京林业大学户外采集的感病杨树叶进行LAMP检测，从所有的户外采集的16个病叶样本和阳性对照(杨生褐盘二孢菌XY-3菌株纯DNA)中均可通过LAMP准确地检测到杨生褐盘二孢菌(见图5A-B)，但仅有6个病叶样本可以被常规PCR检测到(见图5C)。以健康叶片总DNA样本为模板时，LAMP和PCR反应均不产生扩增。结果表明，本申请所建立的LAMP检测具有实际应用价值，可用于杨树黑斑病的快速诊断。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法

<130> 100

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> F3（forward outer primer）引物序列(Artificial)

<400> 1

rwardtrrmr 10

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> B3（backward outer primer）引物序列(Artificial)

<400> 2

ccttcggaat gccaaagg 18

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> FIP（forward inner primer）（F1c+F2）引物序列(Artificial)

<400> 3

ccagaaccaa gagatccgtt gtcccgtgcc atgtcagt 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> BIP（backward inner primer）（B1c+B2）引物序列(Artificial)

<400> 4

tgaagaacgc agcgaaatgc cgcaatgtgc gttcaaag 38

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> LF（forward loop primer）引物序列(Artificial)

<400> 5

actattatat agtactcaga cgac 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> LB（backward loop primer）引物序列(Artificial)

<400> 6

tgcagaattc agtgaatcat cga 23

<210> 7

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

rwardtrrmr 10

Claims

1.一种快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，其特征在于，提取杨树黑斑病叶片的基因组DNA，进行LAMP反应；反应产物直接由肉眼鉴定溶液颜色，天蓝色为阳性，紫色为阴性；选择阳性溶液进行凝胶电泳进一步验证，产物呈现阶梯状条带，为由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病，否则不是；其中，LAMP反应所使用的引物序列具体如下：

F3：5′-CGCCAGAGGACCACAA-3′；

B3：5′-CCTTCGGAATGCCAAAGG-3′；

FIP：5′-CCAGAACCAAGAGATCCGTTGTCCCGTGCCATGTCAGT-3′；

BIP：5′-TGAAGAACGCAGCGAAATGCCGCAATGTGCGTTCAAAG-3′。

2.根据权利要求1所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，其特征在于，LAMP反应还添加有环引物FL、BL，其序列具体为：

FL：5′-ACTATTATATAGTACTCAGACGAC-3′

BL：5′-TGCAGAATTCAGTGAATCATCGA-3′。

3.根据权利要求2所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，其特征在于，25μL LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，4.0μL MgSO₄，4.0μL甜菜碱，3.5μL dNTPs，各2.0μL FIP/BIP，各0.5μL F3/B3，各1.0μL LF/LB，2.0μL HNB，1.0μLBst DNA聚合酶，1.0μL模板DNA。

4.根据权利要求1或2所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，其特征在于，LAMP反应程序为：62.5-65℃反应20-60min，80℃加热5分钟停止反应。

5.根据权利要求1或2所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，其特征在于，LAMP反应温度为65℃。

6.根据权利要求5所述的快速诊断由杨生褐盘二孢菌引起的杨树黑斑病的方法，其特征在于，LAMP反应温度为65℃，反应35min。

7.一种鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，其特征在于，提取待鉴定菌株的基因组DNA，进行LAMP反应；反应产物直接由肉眼鉴定溶液颜色，天蓝色为阳性，紫色为阴性；选择阳性溶液进行凝胶电泳进一步验证，产物呈现阶梯状条带，为杨生褐盘二孢菌，否则不是；其中，LAMP反应所使用的引物序列具体如下：

F3：5′-CGCCAGAGGACCACAA-3′；

B3：5′-CCTTCGGAATGCCAAAGG-3′；

FIP：5′-CCAGAACCAAGAGATCCGTTGTCCCGTGCCATGTCAGT-3′；

BIP：5′-TGAAGAACGCAGCGAAATGCCGCAATGTGCGTTCAAAG-3′。

8.根据权利要求7所述的鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，其特征在于，LAMP反应还添加有环引物FL、BL，其序列具体为：

FL：5′-ACTATTATATAGTACTCAGACGAC-3′

BL：5′-TGCAGAATTCAGTGAATCATCGA-3′。

9.根据权利要求8所述的鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，其特征在于，25μL LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，4.0μL MgSO₄，4.0μL甜菜碱，3.5μL dNTPs，各2.0μLFIP/BIP，各0.5μL F3/B3，各1.0μL LF/LB，2.0μL HNB，1.0μL Bst DNA聚合酶，1.0μL模板DNA。

10.根据权利要求8所述的鉴定杨生褐盘二孢菌的方法，其特征在于，LAMP反应程序为：65℃反应35min，80℃加热5分钟停止反应。