CN110423796A - 一种提高核酸体外扩增反应效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高核酸（核酸）扩增反应效率的方法，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为将碳量子点加入反应体系当中进行核酸体外扩增。本方法可有效提高核酸体外扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高的检测效率。该方法可以被应用于PCR扩增、环介导等温扩增等核酸体外扩增领域，具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高核酸体外扩增反应效率的方法。
背景技术
核酸体外扩增是分子生物学研究的基础，随着生物技术的发展，出现了越来越多的核酸体外扩增技术，如聚合酶链式反应（PCR扩增）、环介导等温扩增等。除了用于分子生物学研究外，核酸体外扩增技术被广泛地应用于精准医疗、食品安全检测和公共安全监控等领域中。由于核酸体外扩增技术灵敏度高，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于核酸体外扩增反应过程中涉及到两条或更多条引物，引物间难免发生非特异性结合产生引物二聚体，会消耗反应体系中的反应底物，从而降低了反应的效率，降低检测灵敏度降低，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何建立一种既有更高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增的核酸体外扩增反应体系，一直是核酸扩增技术领域急需解决的技术难题。
碳量子点（Carbon Quantum Dots, CQD）是指尺寸小于20纳米的具有荧光性质的碳颗粒。由于碳量子点的原料来源广泛，制备成本较低，在医学成像设备、微小的发光二极管、化学传感器、光催化反应等领域中都有较好的应用前景。但尚未有将碳量子点应用于提高核酸体外扩增反应效率的报道。
发明内容
针对现有核酸体外扩增技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明目的在于：提供一种提高核酸体外扩增反应效率的方法。
本发明通过向核酸体外扩增反应体系中添加碳量子点材料来实现对核酸体外扩增的优化，提供了一种提高核酸体外扩增反应效率的方法。采用本发明的检测方法检测，具有高灵敏度和高特异性的优点。
本发明目的通过下述方案实现：一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，其特征在于，通过向核酸体外扩增反应体系中添加碳量子点材料来实现对核酸体外扩增的优化，包括如下步骤：
（1）碳量子点制备：碳量子点试剂利用现有技术制备；
（2）核酸体外扩增反应体系优化：将碳量子点加入到核酸体外扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；
（3）核酸扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。
本发明中，所述的核酸体外扩增反应体系优化，其中用量为：在25µL的核酸扩增反应体系中加入碳量子点的终浓度为0.01-0.3 μg/L。
本发明提供了一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，能够进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，可以很好的解决在核酸体外扩增检测方面遇到的技术难题。
本发明方法中，核酸体外扩增包括但不限于PCR扩增、环介导等温扩增。
本发明方法中，在一具体实施方案（PCR扩增）中，所述核酸扩增反应体系包括引物组P1和P2各0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U，1×扩增缓冲液，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.8mmol/L，碳量子点0.01-0.3 μg/L。本发明方法中，所述PCR扩增反应的反应程序为95℃预变性5 min；每个循环中，94℃变性30s，然后60℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸5 min，共35个循环。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
在另一具体实施方案（环介导等温扩增）中，所述核酸扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，环引物LF和LB各0.8 μmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，1×聚合酶缓冲液，Mg2+ 2-9 mmol/L，dNTP1.0-1.6 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，碳量子点0.01-0.30 μg/ L。例如，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO410 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO4 2 mmol/L。1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理。本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
本发明方法中，扩增结果检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测（包括肉眼直接观察或借助仪器进行扩增曲线判断）等。
本发明为生物技术领域提供了一种提高核酸体外扩增反应效率的方法。本发明有益效果包括：采用本发明检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点。与目前常用的核酸体外扩增检测方法相比，本发明通过向核酸体外扩增反应体系中添加碳量子点材料来实现对核酸体外扩增的优化，操作简单，效果极佳，非常适于分子检测等领域推广使用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。
附图说明
附图1表明本发明实施例1碳量子点对PCR扩增反应体系的优化；
附图2表明本发明实施例2碳量子点对环介导等温扩增反应体系的优化。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，通过向核酸体外扩增反应体系中添加碳量子点材料来实现对核酸体外扩增的优化，按如下步骤：
碳量子点对PCR扩增反应体系的优化，其中：
（1）制备核酸扩增反应体系（除碳量子点外），组成如下表：
其中引物P1和P2为金黄色葡萄球菌特异性核酸扩增引物，模板为金黄色葡萄球菌DNA（来源于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC 1.2465，菌株经培养后使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA），模板量做了系列稀释。
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料碳量子点，每25 µL的体系中加入0.2 µL的碳量子点溶液，终浓度为0.02 µg/L。同时，做不加优化材料的相应对照实验，然后95℃预变性5 min；每个循环中，94℃变性30s，然后60℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸5min，共35个循环。
（3）将扩增产物加入Sybr Green I进行显色检测
扩增结果如图1所示，图中样品从左至右反应体系中加入的金黄色葡萄球菌模板的量分别为0（即阴性对照）、1000fg、100fg、10fg和1fg，第一组不加入本发明优化材料碳量子点，第二组加入本发明优化材料碳量子点。从图中可以看出，未加入优化材料碳量子点的体系在模板量为1000fg和100fg的样品管显色为亮绿色，判断为阳性，而模板量为0、10fg和1fg的样品管显色为橙色，判断为阴性，表明不添加优化材料碳量子点的反应体系最低可检测到100 fg的模板（相当于20个细菌）；而加入优化材料碳量子点的体系模板量为1000fg、100fg和10fg的样品管显色为亮绿色，判断为阳性，而模板量为0和1fg的样品管显色为橙色，判断为阴性，表明添加优化材料碳量子点的反应体系最低可检测到10 fg的模板（相当于2个细菌）。该核酸扩增结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，优化效果显著。
实施例2
一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，通过向核酸体外扩增反应体系中添加碳量子点材料来实现对核酸体外扩增的优化，按如下步骤：
碳量子点对鲤春病毒血症病毒环介导等温扩增反应体系的优化，其中，
（1）制备核酸反应体系，组成如下表，其中引物FIP、BIP、F3和B3为鲤春病毒血症病毒特异性核酸扩增引物（体系中未添加环引物LF），模板为鲤春病毒血症病毒cDNA。碳量子点加样量为2.0 µL（终浓度为20 μg/ L）：
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料碳量子点，每个25µL的体系中加入2.0 µL的碳量子点溶液，终浓度为2.0 µg/L，同时，做不加优化材料的相应对照实验，然后，在63℃条件下进行核酸反应60 min，80℃终止反应5min。
（3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图2所示，样品1-2反应体系中没有添加优化材料碳量子点，3-4添加了优化材料量子点，其中1和3模板量为1ng，2和4模板量为0（即阴性对照），M为分子量标记（TakaRa公司DL2000，分别为2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）。可以看出在没有添加碳量子点的处理中，模板量为1 ng和0的反应体系电泳均呈现特征性的梯形条带，表明存在非特异性扩增（即假阳性）；而在添加碳量子点的处理中，模板量为1 ng的反应体系电泳槽呈现特征性的梯形条带，判断为阳性，而模板为0的反应体系（即阴性对照）未出现特征性的梯形条带性，判断为阴性；模板量为10fg和0的反应体系未出现特征性的梯形条带，判断为阴性，显示消除了非特异性扩增。该核酸扩增结果显示，本发明可以消除非特异性扩增，避免假阳性，优化效果显著。
Claims (5)
1.一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，其特征在于，通过向核酸体外扩增反应体系中添加碳量子点材料来实现对核酸体外扩增的优化，包括如下：
（1）核酸扩增反应体系优化：将碳量子点加入到核酸扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；
（2）核酸扩增产物检测：通过电泳检测、浊度检测或显色检测。
2.根据权利要求1所述的一种提高核酸体外扩增反应效率的方法， 其特征在于，在25µL的核酸扩增反应体系中加入碳量子点的终浓度为0.01-0.3 μg/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，其特征在于，所述的核酸体外扩增为PCR扩增和环介导等温扩增。
4.根据权利要求3所述的一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，其特征在于，在PCR扩增中，所述核酸扩增反应体系包括引物组P1和P2各0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U，1×扩增缓冲液，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.8 mmol/L，碳量子点0.01-0.3 μg/L，所述PCR扩增反应的反应程序为95℃预变性5 min；每个循环中，94℃变性30s，然后60℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸5 min，共35个循环。
5.根据权利要求3所述的一种提高核酸体外扩增反应效率的方法，其特征在于，在环介导等温扩增中，所述核酸扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，环引物LF和LB各0.8 μmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，1×聚合酶缓冲液，Mg2+ 2-9 mmol/L，dNTP1.0-1.6 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，碳量子点0.01-0.30 μg/ L；当1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液选用1×Thermopol反应缓冲液，包含pH 8.8的Tris-HCl 20mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 10 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO4 2 mmol/L；1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理，反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。
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