CN113234794A - 一种提升pcr扩增效率的引物探针设计方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提升PCR扩增效率的引物设计方法，该方法包括：(1)获取目标样本进行核酸提取；(2)对核酸提取后的基因组序列进行二代测序；(3)分析二代测序结果，选取丰度较高区域进行引物设计。本发明利用二代测序“边合成边测序”的特点，发现二代测序的过程和PCR扩增极为相似，因此用二代测序的过程来模拟PCR扩增，利用二代测序中，同一基因组核酸不同片段的丰度来代表该片段的“易PCR性”，找出在基因序列中核酸暴露较多，容易PCR的片段，在这些片段部分进行引物探针设计，从而提高引物探针的筛选效率，并提高PCR反应的扩增效率和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法。
背景技术
PCR是分子生物学中常用的技术，在临床上广泛应用于传染病、肿瘤检测。在国内分子诊断市场中，PCR技术占整个市场的40％以上。实时荧光PCR是目前临床的主流产品，其反应的五要素包括引物探针、酶、dNTP、模版和缓冲液。引物探针是实时荧光PCR中重要的组成成分，不同的引物探针在相同的反应条件中可以达到不同的检测效果。
在PCR试剂的开发中，引物探针的设计原则通常考虑的因素有扩增片段的长度、CG含量、退火温度、引物探针的二聚体及发卡结构等，通过引物探针设计软件辅助设计，在设计过程中大多考虑的是引物探针本身序列的问题，而很少衡量扩增的区域是否适合。但是在qPCR试剂的开发中，经常会出现在同一基因的不同位置设计引物探针，即使在退火温度、引物CG含量等都比较接近的情况下，扩增效率也可以有较大的差异。同一基因的不同区域的引物探针扩增效率不同很可能和该区域的二级结构及蛋白等物质的相互作用有关。一方面，现有的核酸提取方法并不能完全去除掉核酸表面的蛋白、多糖等物质的结合；另一方面，在核酸提取后，在不经过变性的情况下，核酸本身也保有二级结构，如RNA单链会形成发卡结构，这些因素会导致这些区域的核酸暴露较少，在PCR扩增的时候更不易与引物探针结合。因此，在不清楚核酸二级结构和是否与其它物质相互作用的状况下，只通过引物探针的退火温度、二级结构、CG含量等利用引物设计软件来进行引物设计筛选，可能并不能挑选的最优的引物探针组合，因此无法使产品的灵敏度达到最优。
二代测序技术又称下一代测序技术(Next-Generation Sequencing)，是一种高通量测序技术，其核心思想是边合成边测序(Sequencing By Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。二代测序技术通过不同的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测核酸的序列信息。
发明内容
在本发明中，发明人发现二代测序的过程和PCR扩增极为相似，考虑到这一点，使用二代测序来指导引物探针设计，之后利用二代测序中不同片段的丰度来找到该基因中容易被PCR的片段，在这些易PCR的片段进行引物探针设计，从而提高设计的引物探针的扩增效率和灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)获取目标样本进行核酸提取；
(2)对核酸提取后的基因组序列进行二代测序；
(3)分析二代测序结果，选取丰度较高区域进行引物及探针设计。
优选地，所述引物设计原则为：引物长度为15-25bp，引物GC含量为40-60％，引物Tm值为50-60℃，引物的扩增片段为50-150bp。
优选地，所述探针设计原则为：探针长度为14-35bp，探针GC含量为60-70℃，探针Tm值为60-70℃。
优选地，所述引物Tm值为58-60℃，所述探针Tm值为68-70℃。
优选地，采用Primer3软件进行引物设计。
优选地，所述引物包括上游引物及下游引物，所述上游引物与下游引物的Tm值相差不大于5℃。
优选地，所述探针的5’端不能为G
优选地，还包括步骤(4)，所述步骤(4)为利用NCBI Blast软件对设计的引物进行比对分析，确保引物具有较高的特异性。本发明的有益效果在于：本发明充分利用二代测序“边合成边测序”的特点，发现二代测序的过程和PCR扩增极为相似，因此用二代测序的过程来模拟PCR扩增，利用二代测序中，同一基因组核酸不同片段的丰度来代表该片段的“易PCR性”，找出在基因序列中核酸暴露较多，容易PCR的片段，在这些片段部分进行引物探针设计，从而提高引物探针的筛选效率，并能够提高PCR反应的扩增效率和灵敏度。
附图说明
图1为冠状病毒229E基因组序列二代测序结果图；
图2为实施例4冠状病毒229E PCR扩增曲线图；
图3为实施例4样本稀释后冠状病毒229E PCR扩增曲线图；
图4为冠状病毒OC43基因组序列二代测序结果图；
图5为实施例6冠状病毒OC43 PCR扩增曲线图；
图6为实施例6样本稀释后冠状病毒OC43 PCR扩增曲线图。
具体实施例
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1二代测序
实施例1冠状病毒229E引物探针设计方法
1.二代测序
在生物安全柜内，采用磁珠法核酸提取试剂盒(重庆中元汇吉生物技术有限公司)提取样本核酸，核酸提取流程参考试剂盒说明书。将提取的样本送专业测序公司(BGIGenomics)，对核酸提取后的冠状病毒229E基因组序列进行二代测序，二代测序的结果如图1所示。
2.引物及探针设计
根据冠状病毒229E二代测序的结果可以看出，冠状病毒229E在基因组的2kb-4kb位置丰度较高，在7kb-13kb位置丰度较低，在16kb-17kb位置丰度处于中间位置，因此我们分别在2kb-4kb、7kb-13kb以及16-17kb这三个区域分别设计引物探针，并使引物的Tm值处于58-60℃范围，探针的Tm值处于68-70℃。
参照文献报道的冠状病毒229E所在基因的GeneBank序列号，从NCBI核酸数据库找到三个区域所对应的基因序列，分别设计引物及探针。
引物设计原则：本发明中用于检测冠状病毒229E的引物对是由Primer3和NCBIBlast软件设计完成，引物长度在15-25个核苷酸之间；引物的GC含量在40％-60％之间；引物的退火温度为58-60℃；避免同一碱基重复过多，特别是连续的4个或更多的G；引物的扩增片段为50-150bp。将各引物的Tm值尽量控制在相同的水平，保证引物对能在同一退火温度下有效地扩增。设计完成后将各引物用NCBI Blast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够比对到比较单一的结果。
探针设计原则：探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35bp，GC含量60-70％，退火温度为68-70℃，5’端第一个碱基避免为G。
根据上述引物探针的设计原则，共设计3组引物及探针：
(1)2kb-4kb：
探针：SEQ ID No.1
ACGTG+GTG+CTA+TGG+GTGATG(碱基前面的+代表锁核酸)(Tm＝69.4)
上游引物：SEQ ID No.2
ATTGAACGCTGCTACACTGC(Tm＝59.2)
下游引物：SEQ ID No.3
TGCGAGGTGCGTTACAATTT(Tm＝58.8)
(2)7kb-13kb:
探针：SEQ ID No.4
GTACA+CAC+CTC+CGA+CTGTCAG(碱基前面的+代表锁核酸)(Tm＝69)
上游引物：SEQ ID No.5
TGAAGCTGATTACCGTTGCG(Tm＝58.9)
下游引物：SEQ ID No.6
GCAGACACGGACAACACATT(Tm＝59.1)
(3)16kb-17kb:
探针：SEQ ID No.7
CTGC+ACG+TG+CCAG+AGTTGA(碱基前面的+代表锁核酸)(Tm＝69.8)
上游引物：SEQ ID No.8
ATCGTGTTCACCGCTTGTTC(Tm＝59.1)
下游引物：SEQ ID No.9
ACACCTCATCCACGACAACA(Tm＝59.2)
实施例2冠状病毒229E引物探针性能验证
(1)扩增效率
为验证实施例3所述针对三个区域设计的引物探针的PCR扩增效率，以临床样本为模板，用实施例3所述3组引物及探针分别进行PCR扩增：
A组使用实施例3第(1)组的引物探针；
B组使用实施例3第(2)组的引物探针；
C组使用实施例3第(3)组的引物探针。
其反应体系如下：
PCR反应条件如下：
PCR反应结果如图2所示，结果显示：在冠状病毒229E基因序列2kb-4kb区域内设计的引物探针在PCR扩增结果中，Ct值最低；在7kb-13kb区域内设计的引物探针在PCR扩增结果中，Ct值最高；而在16kb-17kb区域内设计的引物探针在PCR扩增结果中，Ct值处于中间位置。实验结果表明，在二代测序中丰度较高区域内设计的引物探针具有更高的扩增效率。
(2)灵敏度
将样本进一步稀释到500copies/mL，进行核酸提取后，以同样的条件进行PCR。PCR反应结果如图3所示，结果显示：在2kb-4kb区域内设计的引物探针以及16kb-17kb区域内设计的引物探针在PCR扩增过程中出现了S型曲线，且在2kb-4kb区域内设计的引物探针Ct值更为靠前，相反，在7kb-13k区域内设计的引物探针未出现S型曲线。实验结果表明，在二代测序中丰度较高区域内设计的引物探针具有更高的灵敏度。
实施例3冠状病毒OC43引物探针设计方法
1.二代测序
在生物安全柜内，采用磁珠法核酸提取试剂盒(重庆中元汇吉生物技术有限公司)提取样本核酸，核酸提取流程参考试剂盒说明书。将提取的样本送专业测序公司(BGIGenomics)，对核酸提取后的冠状病毒OC43基因组序列进行二代测序，二代测序的结果如图3所示。
2.引物及探针设计
根据二代测序的结果可以看出：冠状病毒OC43在基因组的1.5kb-2kb位置处丰度较高，在8kb-9kb位置处丰度较低，在13kb-14kb位置处的丰度处于中间位置。因此，我们分别在1.5kb-2kb、8kb-9kb以及13kb-14kb这三个区域设计引物探针，并使引物的Tm值处于58-60℃范围，探针的Tm值处于68-70℃。
参照文献报道的冠状病毒OC43基因的GeneBank序列号，从NCBI核酸数据库找到三个区域所对应的基因序列，分别设计引物及探针。
引物设计原则：本发明中用于检测冠状病毒229E的引物对是由Primer3和NCBIBlast软件设计完成，引物长度在15-25个核苷酸之间；引物的GC含量在40％-60％之间；引物的退火温度为58-60℃；避免同一碱基重复过多，特别是连续的4个或更多的G；引物的扩增片段为50-150bp。将各引物的Tm值尽量控制在相同的水平，保证引物对能在同一退火温度下有效地扩增。设计完成后将各引物用NCBI Blast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够比对到比较单一的结果。
探针设计原则：探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35bp，GC含量60-70％，退火温度为68-70℃，5’端第一个碱基避免为G。
根据上述引物探针的设计原则，共设计3组引物及探针：
(1)1.5kb-2kb:
探针：SEQ ID No.10
ATG+CG+AC+GC+GCTAAATTTAGT(碱基前面的+代表锁核酸)(Tm＝68.9)
上游引物：SEQ ID No.11
GGTGTTTCAGATGTGTGGCAT(Tm＝59.1)
下游引物：SEQ ID No.12
AAGGCATAAAGCCATCTGCAC(Tm＝59.3)
(2)8kb-9kb:
探针：SEQ ID No.13
ATGT+CCC+TAC+CAA+AGTGTTACGAT(碱基前面的+代表锁核酸)(Tm＝68.7)
上游引物：SEQ ID No.14
GCTTGTCCCATTGTTGTTGC(Tm＝59.1)
下游引物：SEQ ID No.15
AGCACACAGCCACTAGCATA(Tm＝59.3)
(3)13kb-14kb:
探针：SEQ ID No.16
TGG+TGG+TGC+GTCTGTTTGT(碱基前面的+代表锁核酸)(Tm＝68.6)
上游引物：SEQ ID No.17
CCCGATGCTACCACTAGTCA(Tm＝58.6)
下游引物：SEQ ID No.18
CTTCCATCCCGCCAAAATCC(Tm＝59.3)
实施例4冠状病毒OC43引物探针性能验证
(1)扩增效率
为验证实施例5所述针对三个区域设计的引物探针的PCR扩增效率，以XX为模板，用实施例5所述3组引物及探针分别进行PCR扩增：
A组使用实施例5第(1)组的引物探针；
B组使用实施例5第(2)组的引物探针；
C组使用实施例5第(3)组的引物探针。
其反应体系如下：
PCR反应条件如下：
PCR反应结果如图5所示，结果显示：在冠状病毒OC43基因序列1.5kb-2kb区域内设计的引物探针在PCR扩增结果中，Ct值最低；在8kb-9kb区域内设计的引物探针在PCR扩增结果中，Ct值最高；而在13kb-14kb区域内设计的引物探针在PCR扩增结果中，Ct值处于中间位置。实验结果表明，在二代测序中丰度较高区域内设计的引物探针具有更高的扩增效率。
(2)灵敏度
将样本进一步稀释到500copies/mL，进行核酸提取后，以同样的条件进行PCR。PCR反应结果如图6所示，结果显示：在1.5kb-2kb区域内设计的引物探针在PCR扩增过程中出现了S型曲线，而在8kb-9kb以及13kb-14kb区域内设计的引物探针在PCR扩增过程中未出现S型曲线。实验结果表明，在二代测序中丰度较高区域内设计的引物探针具有更高的灵敏度。
在二代测序过程中，信号收集的过程其实就是PCR扩增的过程，考虑到这一点，我们使用二代测序来指导引物探针设计，其中因为超声会使核酸表面的蛋白多糖等物质分离，因此在片段化核酸的过程中我们选用酶处理法。之后利用二代测序中不同片段的丰度来找到该基因中容易被PCR的片段，在这些易PCR的片段进行引物探针设计，从而提高设计的引物探针的扩增效率和灵敏度。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法
<130> 2021.3.29
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 1
acgtggtgct atgggtgatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 2
attgaacgct gctacactgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 3
tgcgaggtgc gttacaattt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 4
gtacacacct ccgactgtca g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 5
tgaagctgat taccgttgcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 6
gcagacacgg acaacacatt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 7
ctgcacgtgc cagagttga 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 8
atcgtgttca ccgcttgttc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 9
acacctcatc cacgacaaca 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 10
atgcgacgcg ctaaatttag t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 11
ggtgtttcag atgtgtggca t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 12
aaggcataaa gccatctgca c 21
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 13
atgtccctac caaagtgtta cgat 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 14
gcttgtccca ttgttgttgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 15
agcacacagc cactagcata 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 16
tggtggtgcg tctgtttgt 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 17
cccgatgcta ccactagtca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 18
cttccatccc gccaaaatcc 20
Claims (8)
1.一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)获取目标样本进行核酸提取；
(2)对核酸提取后的基因组序列进行二代测序；
(3)分析二代测序结果，选取丰度较高区域进行引物及探针设计。
2.根据权利要求1所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述引物设计原则为：引物长度为15-25bp，引物GC含量为40-60％，引物Tm值为50-60℃，引物的扩增片段为50-150bp。
3.根据权利要求2所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述探针设计原则为：探针长度为14-35bp，探针GC含量为60-70℃，探针Tm值为60-70℃。
4.根据权利要求3所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述引物Tm值为58-60℃，所述探针Tm值为68-70℃。
5.根据权利要求3所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，采用Primer3软件进行引物设计。
6.根据权利要求3所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述引物包括上游引物及下游引物，所述上游引物与下游引物的Tm值相差不大于5℃。
7.根据权利要求4所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，所述探针的5’端不能为G。
8.根据权利要求1所述的一种提升PCR扩增效率的引物探针设计方法，其特征在于，还包括步骤(4)，所述步骤(4)为利用NCBI Blast软件对设计的引物进行比对分析。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 400037 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Applicant after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 400037 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Applicant before: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information |