CN107828906B - 一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒。本发明提供了检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增成套引物由引物Pep‑F3‑2、引物Pep‑B3‑2、引物Pep‑FIP(F1c+F2)‑2、引物Pep‑BIP(B1c+B2)‑2、引物Pep‑LoopF‑2和引物Pep‑LoopB‑2组成；本发明的方法可用于田间样品检测，为玉米常见病害防治和抗性育种提供基础。本发明开发的LAMP检测体系可为玉米瘤黑粉病综合防治提供有效指导，避免病害进一步发生，同时也是植物—病原物分子互作，抗病育种相关研究工作的重要辅助手段。

Description

一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒。

背景技术

由玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)侵染引起玉米瘤黑粉病是玉米上的主要病害之一。在我国玉米主要产区，该病平均发病率在5％至10％之间，严重发生时可达20％。包括作物轮作、种衣剂处理、杀菌剂叶面喷施和生物防治等防治措施并不能有效控制该病害的发生。种植抗病品种被认为是有效预防该病发生的唯一途径，然而，目前并无可用的抗病品种或自交系。因此，建立一种有效、便捷的玉蜀黍黑粉菌快速检测体系对该病的防控和抗病育种显得尤为重要。除了是玉米生产上重要的病原物，玉蜀黍黑粉菌作为重要的模式植物病原真菌，广泛应用于活体营养担子菌与寄主植物的分子互作研究中。故而，玉蜀黍黑粉菌检测体系也可应用于该病菌与寄主互作研究中，以评估病害侵染不同事件中，病害的发生程度。

目前对U.maydis的常用检测方法有形态学鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)等。这些方法在一定程度上存在操作繁杂、费时等缺点。此外，其不能作为快速和定量分析病原体的工具。环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)测定是一种新型的核酸扩增方法，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶作用下，使用1组4或6条序列特异性的引物，识别靶标DNA上至少6个不同区域，以产生含有单链环的扩增产物，不需要重复循环的热变性。

发明内容

本发明一个目的是提供检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增成套引物。

本发明提供的成套引物由引物Pep-F3-2、引物Pep-B3-2、引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、引物Pep-LoopF-2和引物Pep-LoopB-2组成；

所述引物Pep-F3-2、引物Pep-B3-2、引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、引物Pep-LoopF-2和引物Pep-LoopB-2的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

上述成套引物中，所述引物Pep-F3-2、所述引物Pep-B3-2、所述引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、所述引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、所述引物Pep-LoopF-2和所述引物Pep-LoopB-2的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

本发明另一个目的是提供检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增试剂。

本发明提供的试剂，包括链置换型DNA聚合酶、环介导等温扩增缓冲液和上述的成套引物。

上述试剂中，所述引物Pep-F3-2、所述引物Pep-B3-2、所述引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、所述引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、所述引物Pep-LoopF-2和所述引物Pep-LoopB-2的浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、0.8μM和0.8μM。

上述试剂中，所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。

上述环介导等温扩增缓冲液购自广州迪澳科技有限公司，其组分及浓度如下：12.5μL LAMP反应缓冲液：1.6mM dNTPs,1M甜菜碱,8mM MgSO4,20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4和0.1％Triton X-20(Sigma-Aldrich Inc.,Saint Louis,MO,USA)。

本发明第3个目的是提供检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其含有上述的成套引物或上述的试剂。

上述试剂盒还包括荧光染料；

或所述荧光染料为SYTO-9荧光染料和/或SYBR Green I荧光染料。

若荧光定量PCR检测结果，则反应前，在上述试剂中加入荧光染料SYTO-9fluorescent dye；

若用肉眼观察结果，则在反应开始前或结束后，在反应管中加入SYBR Green I。

如下a)或b)的应用也是本发明保护的范围：

a)上述的成套引物在制备上述试剂或上述试剂盒中的应用；

b)上述的成套引物或上述的试剂或上述试剂盒在检测玉蜀黍黑粉菌或制备检测玉蜀黍黑粉菌的产品中的应用；

c)上述的成套引物或上述的试剂或上述试剂盒在定量检测玉蜀黍黑粉菌含量或制备定量检测玉蜀黍黑粉菌含量的产品中的应用。

本发明第4个目的是提供检测或辅助检测待测样品中是否含有玉蜀黍黑粉菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下(a)和(b)的步骤：

(a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用上述成套引物进行环介导等温扩增；

(b)根据步骤(a)的扩增结果，按照如下(b1)或(b2)的方法确定所述待测样品中是否含有玉蜀黍黑粉菌：

(b1)反应结束后，若出现S曲线，则所述待测样品中含有或候选含有玉蜀黍黑粉菌；反之，则所述待测样品不含或候选不含有玉蜀黍黑粉菌；

(b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入SYBR Green I荧光染料，然后观察所述反应液的颜色变化；

若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有玉蜀黍黑粉菌；若所述待测样品反应液为橘黄色，则所述待测样品中不含有或候选不含有玉蜀黍黑粉菌。

本发明第5个目的是提供检测待测样品中玉蜀黍黑粉菌或其DNA含量的方法。

本发明提供的方法，包括如下(c)和(d)的步骤：

(c)以含有玉蜀黍黑粉菌SG200DNA或其部分片段的质粒(质粒为重组质粒pEasy-Pep，制备方法见实施例)作为玉蜀黍黑粉菌标准品，将所述玉蜀黍黑粉菌标准品进行梯度稀释，以所得系列浓度的所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液分别作为模板，用上述成套引物进行实时荧光环介导等温扩增(ZYD-S1TM进行反应)，获得对应于各所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液的反应时间阈值，以所述反应时间阈值为纵坐标，以所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液中标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线方程；

(d)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用上述成套引物进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于所述待测样品的基因组DNA的反应时间阈值，然后根据所述标准曲线方程计算得到所述待测样品中玉蜀黍黑粉菌或其DNA含量。

本发明根据UmPep1，UmPit2和UmSee1基因各设计4套LAMP引物进行筛选，得到最佳引物Pep-2，并从Bst DNA聚合酶浓度、内外引物浓度比和Mg²⁺浓度3个变量参数，进行单因素和正交实验，确定了适用于检测U.maydis的LAMP体系。用本发明的引物及LAMP方法可检测到低至44fg/μl的质粒DNA，比之前描述的常规PCR方法高出近200倍。本发明的方法可用于田间样品检测，为玉米常见病害防治和抗性育种提供基础，为玉米瘤黑粉病综合防治提供有效指导，避免病害进一步发生，同时也是植物—病原物分子互作，抗病育种相关研究工作的重要辅助手段。

附图说明

图1为用于U.maydis LAMP引物筛选的12套引物扩增图。

图2为用于U.maydis LAMP引物筛选的12套引物熔解峰图。

图3为U.maydis LAMP引物Pep-2序列及其在目的基因上的位置。

图4为U.maydis LAMP反应体系优化扩增图及熔解峰图。

图5为U.maydis LAMP反应特异性检测。

图6为U.maydis LAMP灵敏度检测。

图7为人工接种U.maydis的样品LAMP检测。

图8为田间样品检测可行性试验。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用U.maydis SG200记载在如下文献中Redkara,A.et al.Asecreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to formtumors.Plant Cell 27,1332–1351(2015)。

以上菌株均保存在30％甘油中，于-80℃长期保存。

下述实施例中所用各个样本的制备：

U.maydis SG200：在PDA平板上活化，于PDA培养基上生长的U.maydis菌落转移到YEPS_L液体培养基中[0.4％(w/v)yeast extracts(BD,Franklin Lakes,NJ,USA),0.4％(w/v)peptone(BD)2％(w/v)sucrose(Fisher Sci.,Pittsburgh,PA,USA)]于28℃下摇培进行扩繁。

植物样品制备：根据以前描述的方法，利用交配型亲和的菌株或单倍体致病株SG200对不同的玉米自交系植株进行人工接种，在玉米瘤黑粉病典型症状出现之前采集玉米植株样品。

土壤样品制备：从田间采集的瘤状菌瘿中分离冬孢子。血球计数板将制备的冬孢子数调整为10⁹spores/ml。将1ml冬孢子悬浮液接种至灭菌的土壤(10g)中，25℃下培养10天，干燥，研磨成细粉末，置于-80℃下保存待用，用作对照的土样取自没有发病的健康土。

下述实施例中各个样本的DNA提取：

玉蜀黍黑粉菌于28℃下，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8，900g离心5min收集菌体，利用

universal 96Kit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)提取菌体基因组DNA。

利用

SP Fungal DNA Kit(Omega Bio-Tek)提取其余病原真菌菌丝体基因组DNA。

利用

SP Plant DNA Midi Kit(Omega Bio-Tek)提取玉米植株基因组DNA。

参考相关研究研究中的方法提取土壤样品基因组DNA。

实施例1、检测玉蜀黍黑粉菌的LAMP引物的设计筛选以及试剂盒的制备

1、LAMP引物设计

针对玉蜀黍黑粉菌的UmPep1(XM_753041)，UmPit2(XM_752429)和UmSee1(XM_011390277)基因，使用PrimerExplorer V4软件(http://primerexplorer.jp/e/；EikenChemical Co.，Ltd.,Tokyo,Japan)各设计4套引物(上海生工生物工程有限公司合成，HPLC纯化)。

引物序列见表1所示:

表1

2、LAMP引物筛选的筛选

以U.maydis SG200菌株DNA组作为模板，分别用表1所示的每组引物进行LAMP扩增。以弯孢菌为阴性对照(Negative Control,NC)。

25μL反应体系包括:12.5μL LAMP反应缓冲液(广州迪澳科技有限公司)[【缓冲液中各组分最终浓度为1.6mM dNTPs,1M甜菜碱,6mM MgSO4,20mM Tris-HCl(pH8.8),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,and 0.1％Triton X-20(Sigma-Aldrich Inc.,Saint Louis,MO,USA)]】，0.2μM SYTO-9fluorescent dye(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，1.2μM FIP/BIP,0.2μM F3/B3，一对环引物LoopF和LoopB的浓度均为0.8μM，6U Bst DNA聚合酶，2μL模板DNA。上述反应体系配制完成后，加入25μL的矿物油覆盖。

实时荧光定量PCR仪检测结果若呈现S形扩增曲线，则为阳性，若没有S形扩增曲线，则为阴性扩增，。

如果直接用肉眼观察法判断反应结果，则在反应开始前或结束，在反应管内盖中央加入1μL 10倍稀释的SYBR Green I。

实时荧光定量PCR仪检测LAMP反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

结果如图1和图2所示，在12套引物中，Pep-1、Pep-3、Pit-2、Pit-3、See-2、See-3、See-4引物出现假阳性，表明这些引物对目的基因是非特异的，引物Pep-4，See-1虽然不表现假阳性扩增(图1)，但其对应的阴性对照反应也出现熔解峰图，同样地，引物Pep-1,Pep-3,Pit-2,Pit-3,See-2,See-3和See-4参与的反应的阴性对照也出现熔解峰图(图2)。剩下的3套候选引物中，Pep-2与Pit-1、Pit-4相比，扩增效率高，重复性好，无假阳性，且熔解曲线吻合，故选用Pep-2引物用于后续实验。

综合以上结果，引物Pit-1,Pit-4和Pep-2可能适宜作为U.maydis LAMP特异性引物。进一步分析表明，相对于Pit-1,Pit-4，Pep-2最适合作为U.maydis LAMP特异性引物，这是由于其反应阈值时间最短，重复性更好(图1)。

因此，Pep-2引物中的Pep-F3-2、Pep-B3-2、Pep-FIP(F1c+F2)-2、Pep-BIP(B1c+B2)-2、Pep-LoopF-2和Pep-LoopB-2被选为U.maydis LAMP反应体系的引物(即表1中的序列1-序列6)。

Pep-2引物与靶标片段对应的位置及与同源基因的比对见图3。

3、检测玉蜀黍黑粉菌的LAMP试剂盒的制备

将上述序列1-序列6所示的引物单独包装到试剂盒中，得到检测玉蜀黍黑粉菌的LAMP试剂盒。

实施例2、检测玉蜀黍黑粉菌的LAMP体系优化及应用

一、最佳LAMP体系优化及检测方法的建立

为了探索对LAMP反应进行优化的可能。在确定引物后，对体系中Bst DNA聚合酶浓度(U)(2.0，4.0，6.0，8.0)，内外引物浓度比(μM)

(0.4:0.2,0.8:0.2,1.2:0.2,1.6:0.2)和Mg²⁺浓度(mmol/L)(5.0,6.0,7.0,8.0)进行单因素试验，随后在单因素试验的基础上进行三因素四水平L16(45)正交实验(表2)，探讨各因素之间的相互作用。

表2为LAMP反应体系优化[L₁₆(4⁵)]正交试验设计

LAMP在实时荧光定量PCR仪CFX96TM real-time PCR(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上进行。

反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

每个循环结束后收集荧光信号；并通过仪器自带的Bio-Rad CFX Manager 3.1软件基于实时收集的荧光信号绘制熔解曲线(由65℃升温至95℃，每0.5s增加0.5℃)。反应完成后，根据机器绘制的扩增曲线判断扩增结果，出现“S”形曲线为阳性扩增，而获得线性或稍微倾斜的扩增曲线则为阴性扩增。

结果Bst DNA聚合酶浓度和Mg²⁺浓度在一定的范围内与扩增效率成正相关，而内引物和外引物浓度比为4:1和6:1时，观察到非特异性扩增，比值调节至8:1时，扩增效率达到最高。正交试验的结果表明体系12的阴性对照在58min时出现些微翘尾，体系8的熔解曲线异常。体系2，3，4可能是由于Mg²⁺浓度较低，影响酶的活性，扩增较慢，体系5，13可能是因为酶的浓度较低导致扩增效果差。而体系1，9，10重复性较差。体系6，11，15，16中，体系16的Cq值最小，无假阳性扩增，扩增曲线重复性好，熔解曲线吻合，实验结果见图4。

因此，25μL最佳LAMP反应体系包括:12.5μL LAMP反应缓冲液[缓冲液中各组分最终浓度为1.6mM dNTPs,1M甜菜碱,8mM MgSO4,20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,0.1％Triton X-20(Sigma-Aldrich Inc.,Saint Louis,MO,USA)]，0.2μMSYTO-9fluorescent dye(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，1.6μM FIP/BIP,0.2μM F3/B3，一对环引物LoopF和LoopB的浓度均为0.8μM，8U Bst DNA聚合酶，2μL模板DNA。

上述引物或最佳反应体系可以用来检测待测样本是否含有玉蜀黍黑粉菌，具体方法如下：

用上述引物或反应体系对待测样本的基因组DNA进行LAMP反应，若检测结果呈现S形扩增曲线，则待测样本含有玉蜀黍黑粉菌，若没有S形扩增曲线，则待测样本不含有玉蜀黍黑粉菌。

上述LAMP反应可以用实时荧光定量PCR仪检测，也可用ZYD-S1TM检测。

ZYD-S1TM(广州双螺旋基因技术有限公司)是一种小型易于使用的荧光测量系统，具有16管座加热模块，可调节温度和光谱设置，可用荧光染料检测扩增产物。在实时扩增过程中，在6-羧基荧光素通道(470nm处激发，520nm检测)获得荧光数据，并使用荧光单位阈值。阈值时间(Tt)从反应起始到荧光达到阈值的时间。阈值是反应初始5min内荧光信号的标准偏差值的10倍与平均值之和。反应结果图中y轴表示荧光单位(mV)，x轴为反应时间(min)。

上述实时荧光定量PCR仪检测LAMP反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

上述ZYD-S1TM检测LAMP反应程序为：63℃反应60min，以30s为间隔收集荧光信号。

二、LAMP特异性检测

为了确认LAMP检测的特异性，选用高粱丝轴黑粉菌(Sporisorium reiliana)，玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolaris maydis)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)和平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)进行LAMP扩增。并使用沙门氏菌(Salmonella choleraesusi)作为阴性对照(NC)，SG200DNA10倍稀释液为阳性对照(PC)。

提取上述各个菌的基因组DNA作为模板，加入上述一的最佳LAMP反应体系中，在实时荧光定量PCR仪进行LAMP反应，反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

实时荧光定量PCR仪检测结果如图5a所示，可以看出，除了阳性对照外，只有SG200DNA模板能够产生特异性扩增(S型曲线)，而以其他病原物中提取的DNA为模板均未发生扩增。

SYBR Green I荧光染料判断：LAMP反应结束后加入1μl荧光染料SYBR GreenⅠ，将反应管置于黑色背景下观察，结果如图5b所示，可以看出，在测试的病原菌中，只有在SG200DNA为模板的反应管中可以清晰观察到绿色荧光，其他反应管全部为橙色。说明Pep-2引物对U.maydis具有高度的特异性。

三、灵敏度检测

为了确定上述引物检测U.maydis的灵敏度，首先用外引物UmPepF(5'-TCGTGTACCAATGCCAAAG-3')和UmPepR(5'-TACCGATTCCTCCTAGCAG-3')扩增U.maydis SG200基因组DNA，得到LAMP靶区域的DNA片段(190bp)。

将LAMP靶区域的DNA片段克隆到pGEM-T Easy载体(Promega,Fitchburg,WI,USA)，得到重组质粒pEasy-Pep(标准品)。

重组质粒pEasy-Pep的浓度为440ng/μL，并以10倍梯度稀释(1×10⁰～1×10^{- 7}copies)，评估LAMP测定的检测限。

以上述各个梯度浓度的重组质粒为模板，加入上述一的最佳LAMP反应体系中，在实时荧光定量PCR仪进行LAMP反应，反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

同时使用ZYD-S1^TM恒温荧光检测仪进行灵敏度的验证。

实时荧光定量PCR仪结果如图6a左图所示，LAMP在0.44×10^-3ng/μl-0.44×10^{- 7}ng/μl范围内对U.maydis进行检测，LAMP最低能够检测到44fg/μl pEasy-Pep质粒DNA，说明此方法检测U.maydis的灵敏度较高。根据其Cq值和起始浓度对数值(初始模板质粒DNA的对数量)之间的关系制作标准曲线(R²>0.99，P<0.05)(6a右图)，即为实时荧光定量PCR仪的标准曲线，表明其满足定量检测的线性要求。

ZYD-S1^TM恒温荧光检测仪检测结果图6b左图所示，与Bio-Rad实时荧光定量PCR仪结果一致，LAMP最低能够检测到44fg/μl pEasy-Pep质粒DNA。根据反应阈值时间和起始浓度对数值之间的关系制作标准曲线，如图6b右图所示，即为ZYD-S1TM检测系统的标准曲线。

因此，上述引物或最佳反应体系可以用来定量检测待测样本中玉蜀黍黑粉菌含量，具体方法如下：

(c)以重组质粒pEasy-Pep作为玉蜀黍黑粉菌标准品，将所述玉蜀黍黑粉菌标准品进行梯度稀释，以所得系列浓度的所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液分别作为模板，用上述引物进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于各所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液的反应时间阈值，以所述反应时间阈值为纵坐标，以所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液中标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线方程；

(d)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用上述成套引物进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于所述待测样品的基因组DNA的反应时间阈值，然后根据所述标准曲线方程计算得到所述待测样品中玉蜀黍黑粉菌的含量。

上述LAMP反应可以用实时荧光定量PCR仪检测，也可用ZYD-S1TM检测。

上述实时荧光定量PCR仪检测LAMP反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

上述ZYD-S1TM检测LAMP反应程序为：63℃反应60min，以30s为间隔收集荧光信号。

实施例3、检测玉蜀黍黑粉菌的LAMP引物的应用

一、人工侵染样品的检测

为验证LAMP适用于在U.maydis侵染之前或之后的野外样品检测。

将U.maydis SG200的孢子悬浮液10倍稀释至1.6×10⁰个孢子/g土壤样品，得到感染后的土壤样本。提取感染后的土壤样本的基因组DNA为模板进行LAMP扩增。

人工接种了1ml(10⁸U.maydis SG200孢子悬浮液的玉米植株样品，在接种后第一天(1day post inoculation,1DPI)和第六天(6DPI)，在瘤状菌瘿症状出现之前采集植株样品，提取基因组DNA，以约354ng/μl SG200基因组DNA，用作定量参考。

以上述各个基因组DNA为模板，加入实施例2的一的最佳LAMP反应体系中，在实时荧光定量PCR仪进行LAMP反应，反应程序为：63℃，30s预变性；63℃，15s，63℃，45s，60个循环。

结果如下：

对于人工接种的玉米植物样品，LAMP可在1DPI检测出低至4.36×10^-2ng/μl的U.maydis基因组DNA，在6DPI检测出34ng/μl U.maydis(图7a)。

对于人工接种的1.6×10⁷-1.6×10²个孢子/g土壤样品，LAMP的检测限为1.6×10³个孢子/g土壤样品，说明此方法对U.maydis检测的灵敏度非常高，且线性关系良好(R²＝0.994)(图7b，横坐标为起始浓度对数值(每g土壤样品的孢子数浓度)，纵坐标为cq值)。LAMP对人工接种样品检测的高灵敏度表明该方法可应用于田间样品的定量检测。

二、田间样品的检测

1、种植于玉米瘤黑粉病高发地块的8个玉米自交系植株

采集种植于玉米瘤黑粉病高发地块的8个玉米自交系植株，提取基因组DNA作为模板，加入实施例2的一的最佳LAMP反应体系中，在ZYD-S1^TM检测仪上进行LAMP扩增。

结果表明，以这8种DNA为模板的LAMP反应中，来自于玉米自交系A801，B73，B104和87-1的DNA能够检测出U.maydis，而其他4个样品的DNA中不能检测表现为阴性(图8a)。

同样的样品基因组DNA为模板，加入实施例2的一的最佳LAMP反应体系中，在ZYD-S1^TM检测仪上进行LAMP反应，得到8个玉米自交系的反应阈值时间，将各个玉米自交系的反应阈值时间代入前面的标准曲线(图6b右图为ZYD-S1TM检测系统的标准曲线)中，得到各个样本中U.maydis DNA的浓度。

结果如图8b所示，可以看出，来自于玉米自交系A801，B73，B104和87-1的DNA能够检测出U.maydis，而其他4个样品的DNA中不能检测表现为阴性。

2、从未种植过玉米的玉米种植田或田间

为进一步评估LAMP方法对现场采集样品进行诊断的可行性，在从未种植过玉米的玉米种植田或田间收集了100份土壤样品(来自河南省的四个不同的城市)和72份玉米植物样品进行检测。

提取各个样品基因组DNA作为模板，加入实施例2的一的最佳LAMP反应体系中，在ZYD-S1^TM检测仪上进行LAMP扩增，得到各个样品的反应阈值时间，将各个样品的代入前面的标准曲线(图6b右图为ZYD-S1TM检测系统的标准曲线)中，得到各个样本中U.maydis DNA的浓度，再将该浓度通过每1.6×10⁶个孢子的DNA浓度为8ng/ul，计算得到孢子数。

结果如表3和表4所示，可以看出，172份样品中140个样品显示为阳性，阳性检出率为82％，土壤样品占57％。

表3为土壤样本

N/A,不确定

-,无检测结果

a地块位置

A,河南省新乡县七里营镇

B,河南省开封市杜良镇

C,河南省许昌市坡胡镇

D,河南省舞阳县吴城镇

表4为植株样本

N/A,不确定

-,无检测结果

b玉米植株样品基因型

A,A801

B1,B73

B2,B104

C,Chang7-2

D,Dan340

M,Mo17

S,Shen137

Z,Zheng58

序列表

<110> 曹言勇

<120>一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

tcgtgtacca atgccaaag 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

taccgattcc tcctagcag 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tggcttgaac cgcatcgtaa gtatcttcaa tgtgattgtg cc 42

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

agggtggcac tggaggaatc ctggtcgtta gagtctg 37

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gcctgagatc caagagcatt 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

cactgacgac gacacctc 18

Claims (15)

1.检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增成套引物，其由引物Pep-F3-2、引物Pep-B3-2、引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、引物Pep-LoopF-2和引物Pep-LoopB-2组成；

所述引物Pep-F3-2、引物Pep-B3-2、引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、引物Pep-LoopF-2和引物Pep-LoopB-2的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述引物Pep-F3-2、所述引物Pep-B3-2、所述引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、所述引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、所述引物Pep-LoopF-2和所述引物Pep-LoopB-2的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

3.检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺和权利要求1所述的成套引物。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述引物Pep-F3-2、所述引物Pep-B3-2、所述引物Pep-FIP(F1c+F2)-2、所述引物Pep-BIP(B1c+B2)-2、所述引物Pep-LoopF-2和所述引物Pep-LoopB-2的浓度分别为0.2μM:0.2μM:1.6μM:1.6μM:0.8μM:0.8μM。

5.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。

6.检测玉蜀黍黑粉菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-5中任一所述的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光染料；

所述荧光染料为SYTO-9荧光染料和/或SYBR Green I荧光染料。

8.权利要求1或2所述的成套引物在制备权利要求3-5中任一所述试剂中的应用。

9.权利要求1或2所述的成套引物在制备权利要求6或7所述试剂盒中的应用。

10.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-5中任一所述的试剂或权利要求6或7所述试剂盒在检测玉蜀黍黑粉菌中的应用。

11.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-5中任一所述的试剂或权利要求6或7所述试剂盒在制备检测玉蜀黍黑粉菌的产品中的应用。

12.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-5中任一所述的试剂或权利要求6或7所述试剂盒在定量检测玉蜀黍黑粉菌或其DNA含量中的应用。

13.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-5中任一所述的试剂或权利要求6或7所述试剂盒在制备定量检测玉蜀黍黑粉菌或其DNA含量的产品中的应用。

14.检测或辅助检测待测样品中是否含有玉蜀黍黑粉菌的方法，包括如下(a)和(b)的步骤：

(a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述成套引物进行环介导等温扩增；

(b)根据步骤(a)的扩增结果，按照如下(b1)或(b2)的方法确定所述待测样品中是否含有玉蜀黍黑粉菌：

(b1)反应结束后，若出现S曲线，则所述待测样品中含有或候选含有玉蜀黍黑粉菌；反之，则所述待测样品不含或候选不含有玉蜀黍黑粉菌；用该方法确定时需在所述环介导等温扩增前向扩增体系加入荧光染料SYTO-9 fluorescent dye；

(b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入SYBR Green I荧光染料，然后观察所述反应液的颜色变化，若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有玉蜀黍黑粉菌；若所述待测样品反应液为橘黄色，则所述待测样品中不含有或候选不含有玉蜀黍黑粉菌。

15.检测待测样品中玉蜀黍黑粉菌或其DNA含量的方法，包括如下(c)和(d)的步骤：

(c)以含有玉蜀黍黑粉菌SG200 DNA或其部分片段的质粒作为玉蜀黍黑粉菌标准品，将所述玉蜀黍黑粉菌标准品进行梯度稀释，以所得系列浓度的所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液分别作为模板，用权利要求1或2所述成套引物进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于各所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液的反应时间阈值，以所述反应时间阈值为纵坐标，以所述玉蜀黍黑粉菌标准品的溶液中标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线方程；

(d)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述成套引物进行实时荧光环介导等温扩增，且在所述环介导等温扩增前向扩增体系加入荧光染料SYTO-9fluorescent dye；

获得对应于所述待测样品的基因组DNA的反应时间阈值，然后根据所述标准曲线方程计算得到所述待测样品中玉蜀黍黑粉菌或其DNA含量。

Images