CN111996279A - 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物 - Google Patents

检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN111996279A
CN111996279A CN202010896213.2A CN202010896213A CN111996279A CN 111996279 A CN111996279 A CN 111996279A CN 202010896213 A CN202010896213 A CN 202010896213A CN 111996279 A CN111996279 A CN 111996279A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mas
corynebacterium
detecting
subunit
sdhd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010896213.2A
Other languages
English (en)
Inventor
石延霞
李宝聚
孙炳学
谢学文
柴阿丽
李磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010896213.2A priority Critical patent/CN111996279A/zh
Publication of CN111996279A publication Critical patent/CN111996279A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种以MAS‑PCR技术检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法及其所用引物组合物。所述引物组合物中的特异性引物D95E‑R、H105R‑R、G109V‑R分别为针对抗啶酰菌胺的多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基突变位点D95E、H105R和G109V设计的反向引物，对应的序列在突变位点处，且对3’端碱基进行特殊的设计，提高了引物的特异性。本发明检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法可以在一个PCR反应管中同时检测出D95E、H105R和G109V 3种突变类型，相比较其他只能检测单一突变的检测方法，该方法具有省时，省力，快速，高通量的优点，可准确检测大量样品。

Description

检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法及 所用引物组合物
技术领域
本发明涉及植物保护和生物技术领域中一种检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法及所用引物组合物。
背景技术
由多主棒孢菌(Corynespora cassiicoa)引起的黄瓜棒孢叶斑病是果蔬上一种非常普遍的病害，且危害十分严重，给果蔬生产造成了巨大的损失。黄瓜棒孢叶斑病一般田间发病率为10％-25％，严重时可达60％-70％，甚至100％。目前防治该病害仍然主要依赖于杀菌剂。琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂是生产上现在使用较多的一类杀菌剂。但由于其大量使用，多主棒孢菌已对其产生了抗药性，而该药的防治效果也随之大幅度下降。
对抗性菌株进行研究发现，抗性菌株的琥珀酸脱氢酶B、C、D亚基发生了点突变。研究发现主要的抗性突变类型有：SdhB-H278R/Y,SdhB-I280V,SdhC-S73P,SdhD-G109V,SdhD-H105R,SdhD-D95E,SdhD-S89P，且琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基上不同的点突变分别对应不同的抗性水平。其中，SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变均导致多主棒孢菌对啶酰菌胺产生抗药性。
在我国仅公开号为CN107299147A的中国专利文献公开了一种检测多主棒孢菌SdhB-I280V点突变的AS-PCR检测方法，而SdhD-D95E，SdhD-G109V和SdhD-H105R点突变的检测体系上尚没有建立。申请人从2018年到2020年对田间采集的黄瓜棒孢叶斑病样品进行抗药性监测，发现SdhD-D95E和SdhD-G109V两种突变类型的菌株在田间的比例呈现上升的趋势，因此需要建立一种检测由点突变导致多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法，该检测方法的建立对病害的有效防治和农药的合理使用有指导意义，同时也为抗药性管理策略的指定提供知道性意见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性。
为了解决上述技术问题，本发明提供了检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物。
本发明所提供的检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物，所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变，所述引物组合物由MAS-R、MAS-F、D95E-R、H105R-R和G109V-R组成，所述MAS-F为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的MAS-PCR上游引物，所述MAS-R为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的一条MAS-PCR下游引物，所述D95E-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-D95E突变的一条MAS-PCR下游引物，所述H105R-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-H105R突变的一条MAS-PCR下游引物，所述G109V-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-G109V突变的一条MAS-PCR下游引物。
上述引物组合物中，所述MAS-F是核苷酸序列为序列表中序列1的单链DNA，所述MAS-R是核苷酸序列为序列表中序列2的单链DNA，所述D95E-R是核苷酸序列为序列表中序列3的单链DNA，所述H105R-R是核苷酸序列为序列表中序列4的单链DNA，所述G109V-R是核苷酸序列为序列表中序列5的单链DNA。
所述引物组合物中，所述MAS-F、所述MAS-R、所述D95E-R、所述H105R-R和G109V-R的摩尔比为1：1：1：1：1。所述MAS-F、所述MAS-R、所述D95E-R、所述H105R-R和G109V-R可分别单独包装，也可组合在一起。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒，包括上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述SDHI杀菌剂可为啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺、萎锈灵等琥珀酸脱氢酶类杀菌剂。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述SDHI杀菌剂可为啶酰菌胺,氟吡菌酰胺、吡噻菌胺、萎锈灵等琥珀酸脱氢酶类杀菌剂。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法，包括以待鉴别多主棒孢菌的基因组DNA为模板，用所述引物组合物进行MAS-PCR扩增得到MAS-PCR产物，检测所述MAS-PCR产物的大小，如果所述MAS-PCR产物为大于400bp至小于500bp的一个DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌不具有琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；如果所述MAS-PCR产物除了所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段之外，还有大于200bp至小于250bp的DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌具有琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和/或SdhD-D95E这三种氨基酸点突变。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法中，所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段具体可为大小为460-490bp的一个DNA片段(如大小为479bp的一个DNA片段)。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法中，所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于200bp至小于210bp的一个DNA片段(如大小为203bp的一个DNA片段)，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-D95E这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于230bp至小于240bp的一个DNA片段(如大小为233bp的一个DNA片段)，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-H105R这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于240bp至小于250bp的一个DNA片段(如大小为245bp的一个DNA片段)，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-G109V这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法中，所述待鉴别多主棒孢菌可为侵染黄瓜造成黄瓜棒孢叶斑病的多主棒孢菌。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法，包括以待鉴别多主棒孢菌的基因组DNA为模板，用所述引物组合物进行MAS-PCR扩增得到MAS-PCR产物，检测所述MAS-PCR产物的大小，如果所述MAS-PCR产物为大于400bp至小于500bp的一个DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌不具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂的抗药性或候选不具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂的抗药性；如果所述MAS-PCR产物除了所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段之外，还有大于200bp至小于250bp的DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂的抗药性。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法中，所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段具体可为大小为460-490bp的一个DNA片段(如大小为479bp的一个DNA片段)。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法中，所述大于200bp至小于250bp的DNA片段为200bp至小于210bp的DNA片段、大于230bp至小于240bp的DNA片段和/或大于240bp至小于250bp的DNA片段。
上述检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法中，所述待鉴别多主棒孢菌可为可为侵染黄瓜造成黄瓜棒孢叶斑病的多主棒孢菌。所述SDHI杀菌剂可为啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺、萎锈灵等琥珀酸脱氢酶类杀菌剂。
本发明提供的特异性引物分别为针对抗啶酰菌胺的多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基突变位点D95E、H105R和G109V进行设计，设计的反向引物位于突变位点处，且对3’端碱基进行特殊的设计，加大了对啶酰菌胺敏感和其他抗性突变位点的多主棒孢菌株的错配几率，提高了引物的特异性。而参考引物对抗性菌株和敏感菌株均有扩增，可作为参考片段。通过选择适宜的靶标序列以及合理的对引物的碱基序列进行设计后，采用本发明的引物组合物进行MAS-PCR扩增，即可对表现为啶酰菌胺高抗且突变位点为D95E、H105R和G109V的多主棒孢菌进行扩增。本发明检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法可以在一个PCR反应管中同时检测出D95E、H105R和G109V 3种突变类型，相比较其他只能检测单一突变的检测方法，该方法具有省时，省力，快速，高通量的优点，可准确检测大量样品。
附图说明
图1为引物设计策略及序列示意图。
图2为实施例1中不同待鉴别多主棒孢菌以引物组合物进行MAS-PCR扩增后得到的扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中，M为DNA定量Marker，1-4为阳性对照(具体1为敏感菌株HG14102422-4(WT)、2为携带D95E突变的抗性菌株HG15041351-2、3为携带H105R突变的抗性菌株HG15050748-2、4为携带G109V突变的抗性菌株HG15050725-18，5为阴性对照。
图3为实施例2中6种不同真菌以引物组合物进行MAS-PCR扩增后得到的扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中，M为DNA定量Marker，1-4为阳性对照(具体1为敏感菌株HG14102422-4(WT)、2为携带D95E突变的抗性菌株HG15041351-2、3为携带H105R突变的抗性菌株HG15050748-2、4为携带G109V突变的抗性菌株HG15050725-18)，11为阴性对照，5-10为待测真菌，具体5为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，6为瓜枝孢(Cladosporium cucnerinu)，7为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，8为茄链格孢(Alternaria solani)，9为茄葡柄霉(Stemphylium solani)，10为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)。
图4为本发明实施例2中不同浓度的敏感菌株(HG14102422-4)基因组DNA以引物组合物进行MAS-PCR扩增后得到的扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中，M为DNA定量Marker，1为DNA浓度2ng/μL，2为DNA浓度200pg/μL，3为DNA浓度20pg/μL，4为DNA浓度2pg/μL，5为DNA浓度200fg/μL，6为DNA浓度20fg/μL，7为DNA浓度2fg/μL，8为阴性对照。
图5为本发明实施例3中使用引物G109V-R2和G109V-R的特异性比对结果图其中图5的A图为G109V-R2作为G109V突变的特异性引物进行MAS-PCR的电泳图，图5的B图为G109V-R作为G109V突变的特异性引物进行MAS-PCR电泳图。
具体实施方式
下述实施例1和实施例2中作为阳性对照的多主棒孢菌(Corynespora cassiicoa)分别为敏感菌株HG14102422-4(WT)、携带D95E突变的抗性菌株HG15041351-2、携带H105R突变的抗性菌株HG15050748-2、携带G109V突变的抗性菌株HG15050725-18这些菌株记载于非专利文献“Fadi Zhu,Yanxia Shi,Xuewen Xie,Ali Chai,Baoju Li.Occurrence,Distribution,and Characteristics of Boscalid-Resistant Corynespora cassiicolain China.Plant disease.January 2019,Vol.103,69-76”，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例2中的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、瓜枝孢(Cladosporiumcucnerinu)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄链格孢(Alternaria solani)、茄葡柄霉(Stemphylium solani)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)，记载于非专利文献“孙炳学，石延霞，朱发娣，谢学文，柴阿丽，李宝聚，多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立.中国农业科学，2018，51(24):4647-4658”，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、设计引物组合物
针对抗啶酰菌胺的多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基突变位点SdhD-D95E、SdhD-H105R和SdhD-G109V设计了引物组合物，并在靠近3’端的1-2个碱基进行人为错配，以更加容易区分突变和未突变菌株，具体见图1，所述引物组合物包括参考引物和特异性引物：
参考引物：
MAS-F：5’-GGAGAAATGCCTCAAGATGGAC-3’(即序列表中序列1)；
MAS-R：5’-CGAATACTGGGCGAAACC-3’(即序列表中序列2)；
特异性引物：
针对突变位点SdhD-D95E的下游引物：
D95E-R：5’-GACGAGCAGAGCGCAGAGGATGTTT-3’(即序列表中序列3)；
针对突变位点SdhD-H105R的下游引物：
H105R-R：5’-TCGAAGCCAATGTGCGACC-3’(即序列表中序列4)；
针对突变位点SdhD-G109V的下游引物：
G109V-R：5’-AGTTGGGGAAAGACGTACTCGAACA-3’(即序列表中序列5)。
2、以引物组合物鉴别多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性
选择对SDHI杀菌剂抗药性及突变类型已知的3个多主棒孢菌及1株敏感多主棒孢菌株作为待鉴别多主棒孢菌，以参考引物MAS-R、MAS-F和特异性引物D95E-R、H105R-R、G109V-R组成的引物组合物鉴别，4个待鉴别多主棒孢菌的编号依次为1-4，其中编号5为阴性对照，编号1-4为阳性对照，具体1对应敏感菌株HG14102422-4(WT)、2对应携带D95E突变的抗性菌株HG15041351-2、3对应携带H105R突变的抗性菌株HG15050748-2，4对应携带G109V突变的抗性菌株HG15050725-18。
每个待鉴别多主棒孢菌和阴性对照、阳性对照均按照如下步骤检测：
1)刮取待鉴别多主棒孢菌的少量菌丝，采用CTAB法提取DNA，得到模板DNA；
2)以参考引物MAS-R、MAS-F和特异性引物D95E-R、H105R-R、G109V-R组成的引物组合物进行MAS-PCR(multiplex allele-specific polymerase chain reaction，MAS-PCR)扩增，反应体系和反应条件如下：
50μL反应体系：25μL TaqMasterMix，1μL D95E-R，1μL H105R-R，1μL G109V-R，1μLMAS-R，1μL MAS-F，20～100ng模板DNA，余量为ddH2O；该50μL反应体系中，D95E-R、H105R-R、G109V-R、MAS-R和MAS-F的浓度为均为10μM。
反应条件：a)95℃3min；b)95℃15s，56.4℃15s，72℃30s；c)步骤b)重复35个循环；d)72℃5min；
3)将步骤2)得到的MAS-PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为8％，电压150V,时间90min,电泳后聚丙烯酰凝胶以GoldView染色30min后，在凝胶成像仪器上观察。
鉴别标准如下：MAS-PCR产物为仅有479bp大小的条带，则待鉴别多主棒孢菌不具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂的抗药性；MAS-PCR产物为203bp大小的条带和479bp大小的条带，则待鉴别多主棒孢菌具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂的抗药性，且待鉴别多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基的突变类型为SdhD-D95E突变；MAS-PCR产物为233bp大小的条带和479bp大小的条带，则待鉴别多主棒孢菌具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂的抗药性，且待鉴别多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基的突变类型为SdhD-H105R突变；MAS-PCR产物为245bp大小的条带和479bp大小的条带，则待鉴别多主棒孢菌具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂的抗药性，且待鉴别多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基的突变类型为SdhD-G109V突变。
结果如图2所示，编号为1的菌株仅出现479bp大小的条带，编号为2的菌株出现203bp和479bp大小的条带，编号3的菌株出现233bp和479bp大小的条带，编号4的菌株出现245bp和479bp大小的条带，而其他菌株仅有479bp大小的条带，说明菌株1是WT型，菌株2是D95E突变，菌株3是H105R突变，菌株4为G109V突变，与4个待鉴别多主棒孢菌已知的突变类型均一一相对应。该检测方法具有很高的准确性，可有效地检测多主棒孢菌是否对SDHI杀菌剂具有抗药性。
实施例2
一、特异性检验
1、待测菌株类型
选不同类型的6种真菌：灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、瓜枝孢(Cladosporiumcucnerinu)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄链格孢(Alternariasolani)、茄葡柄霉(Stemphylium solani)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)，以4个多主棒孢菌(Corynesporacassiicoa)作为阳性对照，4个多主棒孢菌包括1个敏感菌株HG14102422-4(WT)和3个分别携带D95E、H105R、G109V突变的抗性菌株(携带D95E突变的抗性菌株HG15041351-2、携带H105R突变的抗性菌株HG15050748-2、携带G109V突变的抗性菌株HG15050725-18)，以(ddH2O)作为阴性对照。
2、引物特异性检测
分别提取以上6种真菌的DNA为模板DNA，用参考引物MAS-R、MAS-F和特异性引物D95E-R、H105R-R、G109V-R组成的引物组合物进行MAS-PCR反应，每次反应均包含1个阴性对照和4个阳性对照。
50μL反应体系：25μL TaqMasterMix，1μL D95E-R，1μL H105R-R，1μL G109V-R，1μLMAS-R，1μL MAS-F，20～100ng模板DNA，余量为ddH2O；该50μL反应体系中，D95E-R、H105R-R、G109V-R、MAS-R和MAS-F的浓度均为为10μM。
反应条件：a)95℃3min；b)95℃15s，56.4℃15s，72℃30s；c)步骤b)重复35个循环；d)72℃5min；
得到的MAS-PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为8％，电压150V,时间90min,电泳后聚丙烯酰凝胶以GoldView染色30min后，在凝胶成像仪器上观察。
从电泳照片上看(图3)，只有编号1-4的阳性对照有条带，其他6种病原菌DNA均未检测到扩增条带，说明该引物组合物只扩增对应特定的真菌，而在其它的真菌上不扩增条带，说明此检测体系可用于不同菌种间多主棒孢菌特定基因型的检测。
二、灵敏度分析
将定量的敏感菌株(HG14102422-4)(WT)基因组DNA按浓度进行10倍梯度稀释，获得的DNA浓度依次是2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL。
以各个浓度梯度稀释的DNA为模板，以参考引物MAS-R、MAS-F和特异性引物D95E-R、H105R-R、G109V-R组成的引物组合物进行MAS-PCR扩增，反应体系和反应条件如下：
50μL反应体系：25μL TaqMasterMix，1μL D95E-R，1μL H105R-R，1μL G109V-R，1μLMAS-R，1μL MAS-F，20～100ng模板DNA，余量为ddH2O。该50μL反应体系中，D95E-R、H105R-R、G109V-R、MAS-R和MAS-F的浓度均为为10μM。
反应条件：a)95℃3min；b)95℃15s，56.4℃15s，72℃30s；c)步骤b)重复35个循环；d)72℃5min。
得到的MAS-PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为8％，电压150V,时间90min,电泳后聚丙烯酰凝胶以GoldView染色30min后，在凝胶成像仪器上观察。
结果见图4，结果表明该检测体系的检测下线为20pg/μL，说明此检测体系可以检测到DNA浓度大于20pg/μL的样品，可用于田间多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的检测。
三、MAS-PCR和测序方法的一致性分析
将从多地采集的多主棒孢菌128株分别进行测序和MAS-PCR分析，分析MAS-PCR在应用于田间检测的效果。
首先对采集的多主棒孢菌进行基因组DNA的提取，提取方法参考CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒。
1、测序方法分析
将提取的各种多主棒孢菌DNA分别作为模板DNA，以表1中的KES 862(F)和KES 762(R)作为引物，进行PCR扩增，反应体系和反应条件如下：
50μL反应体系：25μL TaqMix，1μL KES 862(F)，1μL KES 762(R)，1μL模板DNA模板，余量为ddH2O。该50μL反应体系中，KES 862(F)，1μL KES 762(R)均为10μM。
反应程序：a)95℃3min；b)95℃15s，56℃15s，72℃1min；c)步骤b)重复35个循环；d)72℃5min。
PCR产物送到北京博迈德基因有限公司进行测序分析。
2、MAS-PCR分析。
同样对将提取的各种多主棒孢菌DNA分别作为模板DNA，以表1中的MAS-R、MAS-F作为参考引物，以表1中的D95E-R、H105R-R、G109V-R作为特异性引物，共同组成的引物组合物，进行MAS-PCR反应。反应体系和反应条件如下：
50μL反应体系：25μL TaqMasterMix，1μL D95E-R，1μL H105R-R，1μL G109V-R，1μLMAS-R，1μL MAS-F，20～100ng模板DNA，余量为ddH2O。
反应条件：a)95℃3min；b)95℃15s，56.4℃15s，72℃30s；c)步骤b)重复35个循环；d)72℃5min。
表1供试引物
Figure BDA0002658499390000091
3、测序和MAS-PCR结果一致性分析
对PCR产物的测序结果和MAS-PCR的结果进行对比分析，128株多主棒孢菌的统计分析结果见表2，两种方法中仅有1株菌D95E的检测结果出现不一致的现象。
表2128株多主多主棒孢菌SdhD亚基突变信息
基因类型 突变类型 测序突变数(％) MAS-PCR突变数(％)
D95E GAC→GAA(His→Arg) 21/128(16.41％) 20/128(15.63％)
H105R CAC→CGC(Asp→Glu) 1/128(0.78％) 1/128(0.78％)
G109V GGC→GTC(Gly→Val) 6/128(4.69％) 6/128(4.69％)
SdhD无变异 - 100/128(78.13％) 101/128(78.90％)
表3MAS-PCR和测序方法的一致性分析
Figure BDA0002658499390000092
Figure BDA0002658499390000101
Kappa值:0.97，CI 95％[90.2％；100％]
对两种方法检测的结果进行Kappa统计分析，Kappa值为0.97，95％的置信区间为[90.2％；100％](表3)，说明MAS-PCR检测方法的准确率高，可用于田间多主棒孢菌对SDHIs杀菌剂抗药性的检测。
实施例3
1、G109V-R特异性引物优化
为筛选出合适的G109V-R特异性引物，分别以引物G109V-R和G109V-R2进行MAS-PCR反应，表4中以双下划线标出两种引物的区别，引物组中的其他参考引物和D95E和H105R突变的特异性引物不变，具体引物序列见实施例1中的步骤1。
表4特异性引物优化序列
Figure BDA0002658499390000102
G109V-R的反应体系为50μL反应体系，具体是25μL Taq MasterMix，1μL D95E-R，1μL H105R-R，1μL G109V-R，1μL MAS-R，1μL MAS-F，20～100ng模板DNA，余量为ddH2O；该50μL反应体系中，D95E-R、H105R-R、G109V-R、MAS-R和MAS-F的浓度均为为10μM。
G109V-R2的反应体系为50μL反应体系，具体是25μL TaqMasterMix，1μL D95E-R，1μL H105R-R，1μL G109V-R2，1μL MAS-R，1μL MAS-F，20～100ng模板DNA，余量为ddH2O；该50μL反应体系中，D95E-R、H105R-R、G109V-R2、MAS-R和MAS-F的浓度均为为10μM。
反应条件均为：a)95℃3min；b)95℃15s，56.4℃15s，72℃30s；c)
步骤b)重复35个循环；d)72℃5min；
得到的MAS-PCR产物分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为8％，电压150V,时间90min,电泳后聚丙烯酰凝胶以GoldView染色30min后，在凝胶成像仪器上观察。
优化结果如图5所示，在以G109V-R为特异性引物进行MAS-PCR扩增时，仅有参考引物条带和特异性条带，无其他非特异性扩增，可明确区分D95E、H105R、G109V这3种突变类型。然而在在以G109V-R2为特异性引物进行MAS-PCR扩增时，有明显的非特异性扩增现象，在D95E和WT菌株为DNA模板进行扩增时，均有2条带产生，而H105R和G109V均有3条带产生，且片段大小无法区分，从而无法准确区分D95E、H105R、G109V这3种突变类型。
本发明提供的特异性引物分别为针对抗啶酰菌胺的多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基突变位点D95E、H105R和G109V进行设计，设计的反向引物位于突变位点处，且对3’端碱基进行特殊的设计，加大了对啶酰菌胺敏感和其他抗性突变位点的多主棒孢菌株的错配几率，提高了引物的特异性。而参考引物对抗性菌株和敏感菌株均有扩增，可作为参考片段。通过选择适宜的靶标序列以及合理的对引物的碱基序列进行设计后，采用本发明的引物组合物进行MAS-PCR扩增，即可对表现为啶酰菌胺高抗且突变位点为D95E、H105R和G109V的多主棒孢菌进行扩增。本发明检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法可以在一个PCR反应管中同时检测出D95E、H105R和G109V 3种突变类型，相比较其他只能检测单一突变的检测方法，该方法具有省时，省力，快速，高通量的优点，可准确检测大量样品。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法及所用引物组合物
<130> GNCSY201913
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagaaatgc ctcaagatgg ac 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaatactgg gcgaaacc 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgagcaga gcgcagagga tgttt 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgaagccaa tgtgcgacc 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agttggggaa agacgtactc gaaca 25

Claims (10)

1.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的引物组合物，其特征在于：所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变，所述引物组合物由MAS-R、MAS-F、D95E-R、H105R-R和G109V-R组成，所述MAS-F为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的MAS-PCR上游引物，所述MAS-R为对应于野生型多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基的一条MAS-PCR下游引物，所述D95E-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-D95E突变的一条MAS-PCR下游引物，所述H105R-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-H105R突变的一条MAS-PCR下游引物，所述G109V-R为对应于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶D亚基上SdhD-G109V突变的一条MAS-PCR下游引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述MAS-F是核苷酸序列为序列表中序列1的单链DNA，所述MAS-R是核苷酸序列为序列表中序列2的单链DNA，所述D95E-R是核苷酸序列为序列表中序列3的单链DNA，所述H105R-R是核苷酸序列为序列表中序列4的单链DNA，所述G109V-R是核苷酸序列为序列表中序列5的单链DNA。
3.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合物；所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和SdhD-D95E这三种氨基酸点突变。
4.权利要求1或2所述的引物组合物在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用。
5.权利要求3所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性中的应用或在制备检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性产品中的应用。
6.检测或辅助检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型的方法，其特征在于，所述方法包括以待鉴别多主棒孢菌的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物进行MAS-PCR扩增得到MAS-PCR产物，检测所述MAS-PCR产物的大小，如果所述MAS-PCR产物为大于400bp至小于500bp的一个DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌不具有琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；如果所述MAS-PCR产物除了所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段之外，还有大于200bp至小于250bp的DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌具有琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；
所述琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型为SdhD-G109V，SdhD-H105R和/或SdhD-D95E这三种氨基酸点突变。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于200bp至小于210bp的一个DNA片段，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-D95E这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于230bp至小于240bp的一个DNA片段，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-H105R这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型；所述大于200bp至小于250bp的DNA片段含有大于240bp至小于250bp的一个DNA片段，所述待鉴别多主棒孢菌具有SdhD-G109V这种琥珀酸脱氢酶D亚基点突变类型。
8.检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法，其特征在于，包括以待鉴别多主棒孢菌的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物进行MAS-PCR扩增得到MAS-PCR产物，检测所述MAS-PCR产物的大小，如果所述MAS-PCR产物为大于400bp至小于500bp的一个DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌不具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂的抗药性或候选不具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂的抗药性；如果所述MAS-PCR产物除了所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段之外，还有大于200bp至小于250bp的DNA片段，则所述待鉴别多主棒孢菌具有针对琥珀酸脱氢酶抑制剂杀菌剂的抗药性。
9.根据权利要求8所述的检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法，其特征在于：所述大于400bp至小于500bp的一个DNA片段为大小为460-490bp的一个DNA片段。
10.根据权利要求8或9所述的检测或辅助检测多主棒孢菌对SDHI杀菌剂抗药性的方法，其特征在于：所述方法中，所述大于200bp至小于250bp的DNA片段为200bp至小于210bp的DNA片段、大于230bp至小于240bp的DNA片段和/或大于240bp至小于250bp的DNA片段。
CN202010896213.2A 2020-08-31 2020-08-31 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物 Pending CN111996279A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010896213.2A CN111996279A (zh) 2020-08-31 2020-08-31 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010896213.2A CN111996279A (zh) 2020-08-31 2020-08-31 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111996279A true CN111996279A (zh) 2020-11-27

Family

ID=73465519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010896213.2A Pending CN111996279A (zh) 2020-08-31 2020-08-31 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111996279A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114875048A (zh) * 2022-05-05 2022-08-09 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用
CN115786560A (zh) * 2022-08-12 2023-03-14 上海市农业科学院 一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法
CN116397047A (zh) * 2023-05-10 2023-07-07 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 检测多主棒孢b-i280v突变的引物组合

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684486A (zh) * 2008-09-24 2010-03-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 线粒体琥珀酸脱氢酶基因突变检测方法和试剂盒
CN101768637A (zh) * 2009-11-20 2010-07-07 温州医学院 用于同时检测线粒体dna a1555g和c1494t突变的试剂盒及其使用方法
CN107299147A (zh) * 2017-08-22 2017-10-27 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684486A (zh) * 2008-09-24 2010-03-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 线粒体琥珀酸脱氢酶基因突变检测方法和试剂盒
CN101768637A (zh) * 2009-11-20 2010-07-07 温州医学院 用于同时检测线粒体dna a1555g和c1494t突变的试剂盒及其使用方法
CN107299147A (zh) * 2017-08-22 2017-10-27 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱发娣: "黄瓜多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）对啶酰菌胺的抗性及其机理研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)农业科技辑》 *
陆国辉: "《产前遗传病诊断》", 30 October 2002, 广东科技出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114875048A (zh) * 2022-05-05 2022-08-09 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用
CN114875048B (zh) * 2022-05-05 2023-12-08 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用
CN115786560A (zh) * 2022-08-12 2023-03-14 上海市农业科学院 一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法
CN115786560B (zh) * 2022-08-12 2024-03-22 上海市农业科学院 一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法
CN116397047A (zh) * 2023-05-10 2023-07-07 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 检测多主棒孢b-i280v突变的引物组合

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111996279A (zh) 检测多主棒孢菌的琥珀酸脱氢酶d亚基点突变类型的方法及所用引物组合物
Williams et al. The application of species-specific assays based on the polymerase chain reaction to analyse Fusarium crown rot of durum wheat
Tommerup et al. Reliability of RAPD fingerprinting of three basidiomycete fungi, Laccaria, Hydnangium and Rhizoctonia
CN102154459B (zh) 一种长穗偃麦草e组染色体特异issr-scar标记
CN105063036B (zh) 水稻黄单胞杆菌的分子标记及其应用
CN112063747B (zh) 一种基于荧光pcr技术快速高效检测耳念珠菌用引物探针组、试剂盒及其应用
Chavhan et al. Multiplex molecular marker-assisted analysis of significant pathogens of cotton (Gossypium sp.)
Mirhendi et al. Identification of pathogenic Aspergillus species by a PCR-restriction enzyme method
Hauser et al. Improved detection and differentiation of poleroviruses infecting beet or rape by multiplex RT-PCR
CN105713990A (zh) 小麦分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用
Naqvi et al. Molecular genetic analysis and sequence characterized amplified region-assisted selection of blast resistance in rice
CN107828906B (zh) 一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒
CN102747070A (zh) 甜瓜抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的两个CAPs标记与使用方法
CN108456743B (zh) 与大豆开花期和成熟期相关的snp标记及其检测引物、方法与应用
CN106701968B (zh) 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用
Juthaporn et al. Genetic diversity and species identification of cultivar species in subtribe Cucumerinae (Cucurbitaceae) using RAPD and SCAR markers
KR101650987B1 (ko) 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0566 및 이를 포함하는 분자마커
CN108950043B (zh) 一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒
CN108018375B (zh) 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb1、引物及应用
CN108384881B (zh) 煤污假尾孢的荧光定量pcr检测方法
CN112301142A (zh) 拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用
Tan et al. A molecular protocol using quenched FRET probes for the quarantine surveillance of Tilletia indica, the causal agent of Karnal bunt of wheat
CN106755422B (zh) 一种与黄牛生长性状相关的meg3基因snp的检测方法及其应用
CN105177138A (zh) 一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用
CN109402292B (zh) 一对用于检测小麦赤霉病抗性的引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201127