CN116397047A - 检测多主棒孢b-i280v突变的引物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测多主棒孢B‑I280V突变的引物组合。本发明公开的引物组合由引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、引物LPF和引物LPB组成，各引物的序列分别如序列表的SEQ ID No.1‑SEQ ID No.6所示。实验证明，本发明的引物组合具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，操作简易的特点，可特异、快速、高效地检测到黄瓜棒孢叶斑病发病组织中多主棒孢B‑I280V突变体，不需要复杂的仪器，并实现可视化，为有效发现田间多主棒孢B‑I280V抗性突变类型，制定有效抗药性治理方案提供技术支持。

Description

检测多主棒孢B-I280V突变的引物组合
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测多主棒孢B-I280V突变的引物组合。
背景技术
多主棒孢(Corynesporacassiicola)是一种全球性真菌，在世界各地均有报道。其寄主范围广泛，可为害葫芦科、茄科、豆科等蔬菜。由多主棒孢引起的黄瓜棒孢叶斑病已成为一种世界性病害，一般田间发病率为10％～25％，严重时可达60％～70％，甚至100％，造成严重的经济损失。由于多主棒孢具高度变异性，易产生抗药性，导致该病害很难防治。靶基因的点突变是多主棒孢对杀菌剂产生抗药性的重要机制之一，目前已报道B-I280V、B-H278Y/R/L、C-S73P、C-N75S、D-S89P、D-D95E、D-H105R和D-G109V等突变可导致多主棒孢对SDHIs杀菌剂产生不同水平的抗性，其中B-I280V突变体低抗啶酰菌胺和吡噻菌胺，中抗氟吡菌酰胺和萎锈灵。此外，该突变体与田间野生型敏感菌株相比无适合度代价，并在华北地区逐渐发展为田间优势群体。因此，及时、快速检测该基因型在田间的发生，对该病害的科学防治尤为重要。
传统的病原菌抗性检测方法包括菌丝生长速率法、孢子萌发法、抑菌圈法等，但存在工作量大、工作周期长等缺点。随着分子生物技术的发展，多种分子检测手段应用于病原菌抗药性检测，如普通PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)、多重等位基因PCR(multiplex allele specific PCR,MAS-PCR)等，但需要特定的PCR扩增仪、凝胶电泳仪和凝胶成像仪等，过程繁琐，且检测时间长，不能满足快速检测的要求。
2000年日本荣研化学株式会社研发了一种环介导等温扩增(LAMP)的新方法，该方法使用了一种链置换DNA聚合酶和针对靶基因6个区域设计4个特异性引物，在等温条件下即可高特异性、高效率快速扩增DNA，若添加环引物，扩增时间可缩短至原来的1/2～1/3。LAMP反应的结果观察有多种方式，可以通过浊度仪实时监测、凝胶电泳形成梯形条带，也可以通过添加不同类型的指示剂实现可视化。然而，目前针对多主棒孢B-I280V突变的LAMP检测体系还未建立。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测多主棒孢B-I280V突变。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测多主棒孢B-I280V突变的引物组，所述引物组由引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、引物LPF和引物LPB组成；
所述引物FIP为序列表的SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；
所述引物BIP为序列表的SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；
所述引物F3为序列表的SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；
所述引物B3为序列表的SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；
所述引物LPF为序列表的SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；
所述引物LPB为序列表的SEQ ID No.6所示的单链DNA分子。
上述引物组中，各单链DNA可独立包装，也可包装在一起。所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物F3、所述引物B3、所述引物LPF和所述引物LPB的摩尔比为8:8:1:1:4:4。
本发明还提供了所述引物组的应用，为如下(b1)至(b6)中的任意一种：
(b1)在检测多主棒孢B-I280V突变中的应用；
(b2)在制备用于检测多主棒孢B-I280V突变的试剂盒中的应用；
(b3)在检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢中的应用；
(b4)在制备用于检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢的试剂盒中的应用；
(b5)在检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢中的应用；
(b6)在制备用于检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢的试剂盒中的应用。
上述应用中，所述待测样本可为植物组织或病原菌。
本发明还提供了含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)检测多主棒孢B-I280V突变；
(c2)检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢；
(c3)检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢。
上述试剂盒中，所述待测样本可为植物组织或病原菌。
本发明还提供了所述试剂盒在如下(c1)或(c2)或(c3)中的应用：
(c1)检测多主棒孢B-I280V突变；
(c2)检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢；
(c3)检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢。
上述应用中，所述待测样本可为植物组织或病原菌。
本发明还提供了检测多主棒孢B-I280V突变的方法，所述方法包括：以待测样本的基因组DNA为模板，利用所述引物组进行LAMP反应，反应结束后检测反应体系是否发生了阳性扩增；如发生了阳性扩增，所述待测样本为或候选为含有B-I280V突变的多主棒孢，或所述待测样本含有或候选含有B-I280V突变多主棒孢；如未发生阳性扩增，所述待测样本不为或候选不为含有B-I280V突变的多主棒孢，或所述待测样本不含有或候选不含有B-I280V突变多主棒孢。
本发明中，利用所述引物组进行LAMP反应的反应体系均可如下：所述引物FIP和所述引物BIP各1.6μM、所述引物F3和所述引物B3各0.2μM、所述引物LPF和所述引物LPB各0.8μM、1.4mM dNTPs、0.8M Betaine、20mM Tris–HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mMMgSO4、0.1％Tween20、8U/25μL Bst DNA聚合酶、1μLDNA模板、中性红1μL，ddH2O补足至25μL。
LAMP反应的反应条件可为65℃下孵育40min。
本发明中，多主棒孢B-I280V突变为多主棒孢琥珀酸脱氢酶B亚基基因(Sdhb)(Gene Bank号：MG729608，更新日期：2018.03.04)第280位密码子发生突变(ATT→GTT)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)第280位氨基酸由异亮氨酸(Ile,I)突变为缬氨酸(Val,V)。
本发明的引物组合具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，操作简易的特点，可特异、快速、高效地检测到黄瓜棒孢叶斑病发病组织中多主棒孢B-I280V突变体，不需要复杂的仪器，并实现可视化，为有效发现田间多主棒孢B-I280V抗性突变类型，制定有效抗药性治理方案提供技术支持。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为特异性检测结果。其中1-4为分别携带B-I280V、B-H278R、C-S73P、D-D95E突变的多主棒孢(Corynesporacassiicola)HG200320040101、HG17031009-5、HG2005230609、HG200320040201的基因组DNA；5为田间黄瓜健康叶片基因组DNA；6-13分别为瓜枝孢(Cladosporium cucumerinum)HG0903150202、葫芦科刺盘孢(Colletotrichumorbiculare)HG09110501、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)HG16082209、西瓜壳二孢(Ascochyta citrullin)TG08102101、德氏疫霉(Phytophthoradrechsleri Tucker)H2、古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)H1、核盘菌(Sclerotinia sclerrotiorum)HG08032204、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)HG11011608的基因组DNA；14为田间野生型多主棒孢(Corynesporacassiicola)SD1基因组DNA；15为ddH2O。+：阳性反应管，呈粉红色；–：阴性反应管，呈橘黄色。
图2为灵敏度检测结果。其中，1-8为多主棒孢B-I280V突变体DNA，浓度依次为：4.5×101、4.5×100、4.5×10-1、4.5×10-2、4.5×10-3、4.5×10-4、4.5×10-5、4.5×10-6ng/μL，9为田间野生型多主棒孢(Corynesporacassiicola)SD1的基因组DNA。+：阳性反应管，呈粉红色；–：阴性反应管，呈橘黄色。
图3是实施例3中黄瓜发病组织中多主棒孢B-I280V突变体的LAMP检测，扩增产物在自然光下颜色变化(上图)及在2％琼脂糖凝胶电泳进行电泳的结果(下图)。其中1-4,19分别为携带B-I280V、B-H278R、C-S73P、D-D95E突变以及田间野生型多主棒孢人工接种发病组织基因组DNA，5-18为黄瓜棒孢叶斑病田间自然发病组织DNA，M为BM5000DNAMarker(货号：MD103，北京博迈德基因技术有限公司)，5-6、8、11、13-18的多主棒孢均含有B-I280V突变。+：阳性反应管，呈粉红色；–：阴性反应管，呈橘黄色。
图4为人工接种多主棒孢发病情况。注：1:接种含有SdhB-I280V突变的HG2005230104；2:接种含有SdhB-H278R突变的HG17031008-4；3:接种含有SdhC-S73P突变的HG16010608-2；4:接种含有SdhD-D95E突变的HG200320060301；5:接种WT。
图5为黄瓜棒孢叶斑病田间自然发病情况。
图6为羟基萘酚蓝作为指示剂时颜色变化。左为阳性扩增管(模板为多主棒孢B-I280V突变体基因组DNA)，右为阴性扩增管(阴性对照)。
图7为羟基萘酚蓝做指示剂时灵敏度检测结果。其中，1-8为多主棒孢B-I280V突变体DNA，DNA浓度依次为：4.5×101、4.5×100、4.5×10-1、4.5×10-2、4.5×10-3、4.5×10-4、4.5×10-5、4.5×10-6ng/μL，9为田间野生型多主棒孢(Corynesporacassiicola)SD1的基因组DNA。
图8为甲酚红作为指示剂时颜色变化。左为阳性扩增管(模板为多主棒孢B-I280V突变体基因组DNA)，右为阴性扩增管(阴性对照)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、检测多主棒孢B-I280V突变体的引物组合的制备。
本实施例提供了用于检测多主棒孢(Corynesporacassiicola)B-I280V突变体的引物组合，该引物组由六条引物组成，各引物序列如下：
正向内引物FIP：5’-GAGCCGGGTTCAAGCCCTTGATGTACCGCTGCCACACAG-3’(SEQ IDNo.1)；
反向内引物BIP：5’-AGAGCATGGCTTTCACGTAGGCAACCTTGCAACGTCCCAG-3’(SEQ IDNo.2)；
正向外引物F3：5’-CCCTCAACAACTCGATGAGC-3’(SEQ ID No.3)；
反向外引物B3：5’-CAGCAACGACTCTCTCAACT-3’(SEQ ID No.4)；
正向环引物LPF：5’-CACGTCCTCGAGCAGTTGAGAA-3’(SEQ ID No.5)；
反向环引物LPB：5’-CAAGTGAGCTGTTGGGTAGAGGGT-3’(SEQ ID No.6)。
该引物组中，FIP：BIP：F3：B3：LPF：LPB的摩尔比为8:8:1:1:4:4，各引物均独立包装。
实施例2、实施例1的引物组合对多主棒孢B-I280V突变体的引物特异性。
以表1中不同Sdh突变类型及田间野生型多主棒孢、蔬菜病害常见的病原真菌、田间黄瓜健康叶片作为待测样本，提取各样本的基因组DNA。
分别以各菌株的基因组DNA为模板，利用实施例1的引物组按照以下LAMP反应体系及程序进行扩增，以检测引物组合物的特异性。利用ddH2O与田间黄瓜健康叶片基因组DNA替换菌株DNA模板作为对照。
LAMP反应体系如下：总体系为25μL，含有如下浓度的各物质：正向内引物FIP和反向内引物BIP各1.6μM、正向外引物F3和反向外引物B3各0.2μM、正向环引物LPF和反向环引物LPB各0.8μM、1.4mM dNTPs、0.8M Betaine、20mM Tris–HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4、0.1％Tween20、8U/25μLBst DNA聚合酶、1μLDNA模板、中性红1μL，ddH2O补足至25μL。
将所得LAMP反应体系于65℃下孵育40min。
结果显示，该引物组合可对多主棒孢B-I280V突变体的DNA进行扩增，同时对多主棒孢Sdh其他突变体、田间野生型多主棒孢、蔬菜上常见的其他真菌病害及黄瓜健康叶片基因组DNA均无扩增产物，见图1。以上结果说明该引物组合可以特异检测多主棒孢B-I280V突变体。
表1、菌株信息
Figure SMS_1
Figure SMS_2
注：“WT”：Sdh无突变，即田间野生型多主棒孢；“-”：Sdh突变类型未知。
其中，菌株HG200320040101、HG2005230609、HG200320040201均记载在“孙炳学，多主棒孢菌sdh多位点突变对SDHIs杀菌剂抗性的研究[D].北京:中国农业科学院,2022.”一文中。HG200320040101的琥珀酸脱氢酶B亚基基因(Sdhb)第280位密码子发生突变(ATT→GTT)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)第280位氨基酸由异亮氨酸(Ile,I)突变为缬氨酸(Val,V)；HG2005230609的琥珀酸脱氢酶C亚基基因(Sdhc)第73位密码子发生突变(TCG→CCG)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhC)第73位氨基酸由丝氨酸(Ser,S)突变为脯氨酸(Pro,P)；HG200320040201的琥珀酸脱氢酶D亚基基因(Sdhd)第95位密码子发生突变(GAC→GAA)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhD)第95位氨基酸由天冬氨酸(Asp,D)突变为谷氨酸(Glu,E)；
HG17031009-5、SD1、HG09110501、HG16082209、TG08102101、H1、H2均记载在“朱广雪,阎昱韬,孙炳学,周荣佳,岳圆圆,谢学文,柴阿丽,李磊,李宝聚,石延霞.多主棒孢SdhB-H278Y突变位点real-time PCR检测体系的建立与应用[J].中国蔬菜,2023,(01):60-67”一文中，HG17031009-5的琥珀酸脱氢酶B亚基基因(Sdhb)第278位密码子发生突变(CAC→CGC)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)第278位氨基酸由组氨酸(His,H)突变为精氨酸(Arg,R)；
HG0903150202为文献“孙炳学,石延霞,朱发娣,等.多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立[J].中国农业科学,2018,51(24):4647-4658.”中的瓜枝孢；
HG08032204为文献“孙炳学,石延霞,朱发娣,等.多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立[J].中国农业科学,2018,51(24):4647-4658.”中的核盘菌；
HG11011608为文献“孙炳学,石延霞,朱发娣,等.多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立[J].中国农业科学,2018,51(24):4647-4658.”中的灰葡萄孢。
实施例3、实施例1的引物组合对多主棒孢B-I280V突变体的灵敏度。
以实施例2的多主棒孢B-I280V突变体(多主棒孢(Corynesporacassiicola)HG200320040101)的基因组DNA为模板检测实施例1的引物组合的灵敏度。该目标菌株DNA提取后进行浓度测定，随后10倍浓度梯度稀释使DNA浓度分别为4.5×101、4.5、4.5×10-1、4.5×10-2、4.5×10-3、4.5×10-4、4.5×10-5、4.5×10-6ng/μL,吸取1μL各浓度DNA模板至LAMP反应体系中，编号为1-8，阴性对照(模板为ddH2O)编号为9。
按照实施例2的反应体系及反应程序进行LAMP反应。结果显示，实施例1的引物组合的检测对多主棒孢B-I280V突变体的灵敏度可达到4.5×10-3ng/μL的DNA样本，见图2。
实施例4、实施例1的引物组合对黄瓜棒孢叶斑病发病组织样本中多主棒孢B-I280V突变体的检测。
分别将表2中的各菌株人工接种健康的黄瓜叶片，并对人工接种及自然发病的黄瓜叶片组织进行取样，见图4、图5。样本收集后采用75％乙醇表面消毒3次，随后用无菌水清洗3次，利用DNA提取试剂盒提取发病组织基因组DNA，ddH2O稀释至40ng·μL-1备用。
按照实施例2的反应体系及反应程序进行LAMP反应。
结果显示，LAMP检测体系可以准确检测到发病植株组织中的多主棒孢B-I280V突变体，而接种携带其他突变的非目标菌株的DNA无阳性扩增。LAMP检测的阳性扩增产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上呈现梯形条带，而阴性扩增没有条带，见图3。添加了中性红的LAMP检测产物，阳性扩增管呈现粉红色，阴性扩增管显示橘黄色，见图3。
综上所述，实施例1的引物组合检测B-I280V突变体的特异性高，可直接用于田间黄瓜棒孢叶斑病发病组织中多主棒孢B-I280V突变体的检测。
表2、人工接种的携带不同CcSdh突变的多主棒孢
Figure SMS_3
注：“WT”：Sdh无突变，即田间野生型多主棒孢；“-”：Sdh突变类型未知。
其中，菌株HG2005230104记载在文献(孙炳学，多主棒孢菌sdh多位点突变对SDHIs杀菌剂抗性的研究[D].北京:中国农业科学院,2022.)，HG2005230104的琥珀酸脱氢酶B亚基基因(Sdhb)第280位密码子发生突变(ATT→GTT)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)第280位氨基酸由异亮氨酸(Ile,I)突变为缬氨酸(Val,V)；
菌株HG17031008-4记载在文献(阎昱韬,孙炳学,陈长军,等.啶酰菌胺不同抗性类型多主棒孢的生物学特性[J].农药学学报,2020,22(6):973-983.)，HG17031008-4的琥珀酸脱氢酶B亚基基因(Sdhb)第278位密码子发生突变(CAC→CGC)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)第278位氨基酸由组氨酸(His,H)突变为精氨酸(Arg,R)；
菌株HG16010608-2记载在文献(朱发娣.黄瓜多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)对啶酰菌胺的抗性及其机理研究[D].北京:中国农业科学院,2018.)，HG16010608-2的琥珀酸脱氢酶C亚基基因(Sdhc)第73位密码子发生突变(TCG→CCG)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhC)第73位氨基酸由丝氨酸(Ser,S)突变为脯氨酸(Pro,P)；
菌株HG200320060301记载在文献(孙炳学，多主棒孢菌sdh多位点突变对SDHIs杀菌剂抗性的研究[D].北京:中国农业科学院,2022.)，HG200320060301的琥珀酸脱氢酶D亚基基因(Sdhd)第95位密码子发生突变(GAC→GAA)，导致琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhD)第95位氨基酸由天冬氨酸(Asp,D)突变为谷氨酸(Glu,E)。
对比例1、引物序列对多主棒孢B-I280V突变体检测的影响。
在FIP的3’末端倒数第2、3位人为引入错配碱基，将实施例1的引物组合中的正向内引物FIP分别替换为表3中的各单链DNA，以实施例2的多主棒孢B-I280V突变体(多主棒孢(Corynesporacassiicola)HG200320040101)的基因组DNA为模板，按照实施例2的反应体系及反应程序进行LAMP反应。
结果显示，引物替换后均不能对目标基因进行特异性阳性扩增，当FIP为表3中序号为1、2、5-8、10-16的引物时，阳性对照反应管和阴性对照管均无阳性扩增，反应管颜色均为橘黄色；当FIP为表3中序号为4、9的引物时，阳性对照反应管和阴性对照反应管均能进行阳性扩增，反应管颜色均为粉红色，无特异性；当FIP为表3中序号为3的引物时，阳性对照反应管能进行阳性扩增，反应管颜色呈粉红色，而阴性对照反应管不能阳性扩增，反应管颜色呈橘黄色。阳性对照反应管以实施例2的多主棒孢B-I280V突变体(多主棒孢(Corynesporacassiicola)HG200320040101)的基因组DNA为模板，阴性对照反应管以实施例2的田间野生型多主棒孢(Corynesporacassiicola)SD1的基因组DNA为模板。
表3、FIP引物信息
Figure SMS_4
对比例2、指示剂对多主棒孢B-I280V突变体检测的影响。
分别以羟基萘酚蓝、甲酚红作为指示剂，检测指示剂LAMP反应的影响：
当羟基萘酚蓝作为指示剂时，LAMP反应体系如下：总体系为25μL，含有如下浓度的各物质：实施例1的正向内引物FIP和外向内引物BIP各1.6μM、正向外引物F3和反向外引物B3各0.2μM、正向环引物LPF和反向环引物LPB各0.8μM、1.4mM dNTPs、0.8M Betaine、20mMTris–HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4、0.1％Tween20、8U/25μLBst DNA聚合酶、1μLDNA模板(实施例2的多主棒孢B-I280V突变体(多主棒孢(Corynesporacassiicola)HG200320040101的基因组DNA为阳性对照，田间野生型多主棒孢(Corynesporacassiicola)SD1的基因组DNA为阴性对照)、羟基萘酚蓝1.8μL，ddH2O补足至25μL。
反应条件：65℃下孵育40min。
结果(图6)如下：阳性扩增管呈天蓝色，阴性扩增呈紫罗兰色，但颜色差异小，自然光下不易区分。
调整反应体系中DNA模板的浓度，结果显示，利用羟基萘酚蓝作为指示剂的灵敏度低，仅为4.5×10-1ng/μL，是中性红作为指示剂时灵敏度的1/100。
当甲酚红作为指示剂时，LAMP反应体系如下：总体系为25μL，含有如下浓度的各物质：正向内引物FIP和外向内引物BIP各1.6μM、正向外引物F3和反向外引物B3各0.2μM、正向环引物LPF和反向环引物LPB各0.8μM、1.4mM dNTPs、0.8M Betaine、20mM Tris–HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4、0.1％Tween20、8U/25μLBst DNA聚合酶、1μLDNA模板(实施例2的多主棒孢B-I280V突变体(多主棒孢(Corynesporacassiicola)HG200320040101的基因组DNA为阳性对照，田间野生型多主棒孢(Corynesporacassiicola)SD1的基因组DNA为阴性对照)、甲酚红1.25μL，ddH2O补足至25μL。
反应条件：65℃下孵育40min。
结果(图8)如下：阳性扩增管和阴性扩增管均为紫红色，无明显颜色差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (8)

1.用于检测多主棒孢B-I280V突变的引物组，由引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、引物LPF和引物LPB组成；
所述引物FIP为序列表的SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；
所述引物BIP为序列表的SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；
所述引物F3为序列表的SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；
所述引物B3为序列表的SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；
所述引物LPF为序列表的SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；
所述引物LPB为序列表的SEQ ID No.6所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述引物组的应用，为如下(b1)至(b6)中的任意一种：
(b1)在检测多主棒孢B-I280V突变中的应用；
(b2)在制备用于检测多主棒孢B-I280V突变的试剂盒中的应用；
(b3)在检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢中的应用；
(b4)在制备用于检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢的试剂盒中的应用；
(b5)在检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢中的应用；
(b6)在制备用于检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述待测样本为植物组织或病原菌。
4.含有权利要求1所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)检测多主棒孢B-I280V突变；
(c2)检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢；
(c3)检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述待测样本为植物组织或病原菌。
6.权利要求4或5所述试剂盒在如下(c1)或(c2)或(c3)中的应用：
(c1)检测多主棒孢B-I280V突变；
(c2)检测待测病原菌是否为B-I280V突变多主棒孢；
(c3)检测待测样本是否含有B-I280V突变多主棒孢。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述待测样本为植物组织或病原菌。
8.检测多主棒孢B-I280V突变的方法，包括：以待测样本的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行LAMP反应，反应结束后检测反应体系是否发生了阳性扩增；如发生了阳性扩增，所述待测样本为或候选为含有B-I280V突变的多主棒孢，或所述待测样本含有或候选含有B-I280V突变多主棒孢；如未发生阳性扩增，所述待测样本不为或候选不为含有B-I280V突变的多主棒孢，或所述待测样本不含有或候选不含有B-I280V突变多主棒孢。
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