CN112501336A

CN112501336A - 一种检测青稞黑穗病的lamp引物及其试剂盒和应用

Info

Publication number: CN112501336A
Application number: CN202011408290.5A
Authority: CN
Inventors: 姚强; 杨帆; 胡章薇; 郭青云; 闫佳会; 侯璐; 严浩浩
Original assignee: Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2021-03-16

Abstract

本发明公开了一种检测青稞黑穗病的LAMP引物及其试剂盒和应用，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB，所述的内引物FIP/BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外引物F3/B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物LF/LB的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明提供的引物组检测青稞黑穗病具有操作简单，耗时少的特点，且具有很好的准确性。

Description

一种检测青稞黑穗病的LAMP引物及其试剂盒和应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测青稞黑穗病的LAMP引物及其试剂盒和应用。

背景技术

黑粉菌目的真菌寄主范围极广，几乎囊括世界重要的粮食作物。侵染青稞的大麦坚黑粉菌(Ustilago hordei)和裸黑粉菌(Ustilago nuda)属于黑粉菌目的成员，在我国青稞主产区多有发生，也是青海省青稞产区的重要病害，两者皆为种传病害。侵染青稞的黑粉菌为兼性寄生的真菌，在冬孢子形成之前，与健康植株无异，田间一旦发病再进行防治没有实际意义。生产上使用杀真菌种子处理剂和种植抗性品种，可有效控制此类病害。因此在过去几十年中，相关研究较少。近年来，有机农业的日益兴起，化学药剂的使用受到社会的广泛关注，且生产上对化学药剂也有减少使用的要求，导致种传病害重新受到重视。

两者病原菌侵染植株后，会随着植株的生长而在其组织细胞间和细胞内大量的繁殖和延伸，尤其是在分生组织内，开花后在子房内大量繁殖，最终植株的花序被冬孢子所取代。青稞散黑穗(Ustilago nuda)与坚黑穗(Ustilago hordei)的区别在于，前者(Ustilagonuda)侵染植株后明显高于健康植株以便冬孢子的传播。病穗在露出苞叶后不久，黑粉团包膜破裂，释放出冬孢子，有些冬孢子随风飘落到附近植株正开口的花器中，侵染子房，以休眠菌丝形态潜伏于种子内成为次年田间病害的侵染源；后者(Ustilago hordei)侵染植株后明显矮于正常植株，菌丝始终定殖在分生组织内，直到花器形成，病菌菌丝侵入子房，形成被一层薄膜包裹的冬孢子，收割脱粒过程中薄膜破裂释放出冬孢子，散落于田间或聚集于种皮，冬孢子可与种子一同萌发，进而侵染种子的胚芽鞘进行再侵染。源于两者的区别，传统的检测方式也有所不同。U.nuda主要通过种胚染色后显微观查，U.hordei则是通过直接显微观察、洗涤离心种皮携带物进行显微观察以及冷冻吸水纸法等进行检测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，L AMP)是2000年由Notomi等报道的一种新的核酸扩增技术，其能够识别靶序列上的6个特异区域的4条正、反向外引物和正反向内引物，在59℃～67℃恒温条件下利用高活性的链置换DNA聚合酶特异、高效、快速的扩增靶基因。这种特异、高效、快速的分子检测技术现已成功应用于真菌、细菌、病毒等的检测，检测体系的灵敏度是普通P CR的100倍。LAMP技术检测结果可通过电泳仪、real-time PCR仪及浊度仪进行检测，还可通过SYBR Green I、钙黄绿素、羟基奈酚蓝染色后用肉眼识别。整个过程操作简单，反应时间短，结果易于判断。

发明内容

本发明基于青稞黑穗病的ITS基因序列设计，设计了引物组建立以实时荧光扩增曲线和SYBR Green I为双重判定标准的LAMP检测技术，以期为青稞黑穗病的防控和抗性育种等提供科学、便捷的检测技术。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测青稞黑穗病的LAMP引物，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB，所述的内引物FIP/BIP的核苷酸序列如S EQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外引物F3/B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物LF/LB的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

优选的，所述的引物还包括将FIP/BIP、F3/B3和LF/LB序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。

在本发明的另一方面，提供了一种检测青稞黑穗病的试剂盒，所述的试剂盒包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB。

所述的试剂盒中内引物、外引物和环引物的摩尔浓度比为8:1:2。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测青稞黑穗病的方法，包括以下步骤：

1)提待测样品DNA；

2)以获得的DNA为模板，利用上述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB进行扩增反应；

3)反应结束后根据扩增曲线和加入SYBR Green I染料(阳性呈绿色，阴性呈橙色)对检测结果进行双重判定。

进一步的，反应体系为：20ng/μL DNA模板2μL、SYBR Green I 0.6×、dNTPs1.8mM、甜菜碱0.8mM、镁离子10mM、DNA聚合酶0.32U/L、40μmol/L内引物FIP/BIP、5μmol/L外引物F3/B3，10μmol/L环引物，加无菌去离子水补足至25μL。

进一步的，反应条件为65℃，60min，间隔1min读取荧光。

在本发明的另一方面，还提供了上述内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB在检测青稞黑穗病中的应用。

本发明的有益效果为：

种子带菌是青稞U.hordei和U.nuda于田间发生的初侵染来源，本发明建立的快速检测体系对青稞坚黑粉菌和裸黑粉菌特异，检测灵敏度达到了200fg/μL。利用实时荧光扩增曲线和SYBR Green I显色法双重判定，无需经过琼脂糖电泳，操作简单、成本低、灵敏度高，假阳性概率小。

附图说明

图1是本发明LAMP引物扩增曲线与分析；

图2是本发明灵敏度检测；其中，N：阴性对照；a：U.hordei实时荧光扩增曲线；b：U.nuda实时荧光扩增曲线；c：SYBR Green I显色变化；1～6：分别表示U.nuda的DNA模板为20fg/μL、200f g/μL、2pg/μL、20pg/μL、200pg/μL、2ng/μL浓度下的显色变化；7～12：分别表示U.hordei的DNA模板为20fg/μL、200fg/μL、2pg/μL、20pg/μL、200pg/μL、2ng/μL浓度下的显色变化；

图3是本发明特异性检测；其中，N：阴性对照；a：实时荧光扩增曲线；b：SYBR GreenI显色变化；1～6：分别表示DNA为青稞6种常见病害U.hordei、U.nuda、Dactylobotrysgraminicola、Pyreno phora graminea、Pyrenophora teres、Fusarium graminearum时的显色变化。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1材料、试剂与仪器

青稞黑穗病病菌采自青海青稞主产区具有典型症状的坚黑穗病和散黑穗病的病穗，经实验室鉴定分别为大麦坚黑粉菌(Ustilago h ordei)和裸黑粉菌(Ustilago nuda)；对比菌种选用青稞上常见病害的病原菌(详见表1)，供试病原菌均由青海省农业有害生物综合治理重点实验室提供。

表1用于LAMP检测青稞病原菌菌株信息

试剂：真菌基因组DNA提取试剂盒，OMEGA；Prime STAR Max Premix(2×)，TaKaRa；Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase(10×Isothermal Amplification Buffer、MgSO 4、Bst DNA聚合酶)，美国NEB公司；甜菜碱5M,Sigma-Aldrich；10mM dNTPs,Takara；SY BRGreen I，Solarbio。

仪器：Monad MiniSpeed 3300离心机，北京必吉生物科技有限公司；Powerpacuniversal通用电泳仪，美国BIO-RAD公司；BBx24B细胞组织破碎仪，美国BIO-RAD公司；PCR仪，美国BIO-RAD公司；Thermo Fisher 7500 RT-PCR仪，美国BIO-RAD公司；No-Onec微量核酸蛋白测定仪，美国BIO-RAD公司。

2方法

2.1病原菌DNA提取及测序

黑粉菌的DNA提取，将冬孢子粉放于加有0.2mm钢珠的1.5mL离心管内，加入缓冲液后经细胞组织破碎仪破碎10min；其他对照病原菌分别于PDA培养基上培养后刮取菌丝放于装有2mm钢珠的1.5mL离心管内，液氮冷冻后进行组织破碎6min。病原菌总DNA的提取采用真菌基因组DNA提取试剂盒进行，具体操作参照试剂盒说明，获得的DNA稀释后于-20℃保存备用。

将提取的DNA进行ITS序列扩增，选用的ITS引物为ITS4/ITS5(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'/5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')，PCR扩增体系为：DNA2μl、Prime STAR Max Premix(2×)12.5μl、10μmol/L上下游引物各1μl，加入灭菌水补充至25μl。

扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

完成反应后将扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2.2引物设计

获得ITS序列后利用DNAMAN软件进行比对，筛选U.hordei和U.nuda与其它病原菌同源性低的区段，设计青稞黑穗病菌的LAMP引物，详见表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2本研究所用LAMP引物组

2.3实时荧光LAMP检测方法的建立

建立的实时荧光LAMP检测方法反应体系：20ng/μL DNA模板2μL、SYBR Green I0.6×、dNTPs 1.8mM、甜菜碱0.8mM、镁离子10mM、DNA聚合酶0.32U/L、40μmol/L内引物FIP/BIP、5μmol/L外引物F3/B3，10μmol/L环引物LF/LB，加无菌去离子水补足至25μL，合上盖子轻击使溶液充分混合并瞬时离心，最后加入20μL石蜡油。

扩增反应条件：65℃，60min，间隔1min读取荧光。反应结束后根据扩增曲线(“s”为阳性；“—”为阴性)和加入0.5μL SYBR Green I染料(阳性呈绿色，阴性呈橙色)对检测结果进行双重判定。

结果显示，以坚黑粉菌和裸黑粉菌的基因组为模板，在65℃条件下进行实时荧光LAMP反应。结果显示(图1)，本发明设计引物组的两种黑穗病的实时荧光扩增曲线呈“S”型，阴性对照呈“—”型，确定引物效果最好，无非特异性扩增。

实施例2灵敏度检测

根据建立的检测方法，将调至20ng/μL的黑粉菌DNA稀释为2n g/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL，将以上不同浓度的黑粉菌DNA 2μL作为模板进行灵敏度检测。通过实时荧光扩增曲线和SYBR Green I染色法2种方法来确定LAMP检测的灵敏度。

利用引物，对浓度为2ng/μL～2×10^-5ng/μL的青稞散黑穗、坚黑穗病原菌DNA进行实时荧光LAMP检测，实时扩增曲线(图2-a、b)和显色法(图2-c)皆显示，最低检出浓度为2×10^-4ng/μL。同时根据各浓度DNA的扩增时间，确定扩增反应时间为60min。

实施例3特异性检测

利用引物组和最优检测体系对坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麦类核腔菌、大麦网斑菌、禾谷镰孢菌的总DNA进行实时荧光LAMP扩增。反应结束后通过实时荧光扩增曲线和加入SYBR Green I后肉眼观察2种方法评估检测方法的特异性。

分别以坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麦类核腔菌、大麦网斑菌、禾谷镰孢菌的总DNA为模板进行实时荧光LAMP扩增，结果显示青稞散黑穗和青稞坚黑穗的扩增曲线呈“S”型(图3-a)，加入SYBR Green I后，颜色变为绿色(图3-b)，而以青稞条纹病菌、青稞网斑病菌、青稞穗腐病菌、青稞禾谷镰刀菌DNA为模板的扩增曲线呈直线(图3-a)，且加入SYBRGreen I后颜色为橙色(图3–b)，表明该引物组可以特异性地检测出青稞两种黑穗病。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 青海省农林科学院

<120> 一种检测青稞黑穗病的LAMP引物及其试剂盒和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagcaaaat cgagctttcg tcttgaaata gattagcgca tcc 43

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgggtttt gatactatca ggagaagcac tccaaacagc a 41

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttttgccatt taccgtgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaaataaac tcggcatggg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatctatttc aagggagcca 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagaggttg agatgggta 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims

1.一种检测青稞黑穗病的LAMP引物，其特征在于，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB，所述的内引物FIP/BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的外引物F3/B3的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物LF/LB的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的一种检测青稞黑穗病的LAMP引物，其特征在于，所述的引物还包括将FIP/BIP、F3/B3和LF/LB序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。

3.一种检测青稞黑穗病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB。

4.根据权利要求3所述的一种检测青稞黑穗病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB的摩尔浓度比为8:1:2。

5.一种检测青稞黑穗病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提待测样品DNA；

3)反应结束后根据扩增曲线和加入SYBR Green I染料对检测结果进行双重判定。

6.根据权利要求5所述的一种检测青稞黑穗病的方法，其特征在于，反应体系为：20ng/μL DNA模板2μL、SYBR Green I 0.6×、dNTPs 1.8mM、甜菜碱0.8mM、镁离子10mM、DNA聚合酶0.32U/L、40μmol/L内引物FIP/BIP、5μmol/L外引物F3/B3，10μmol/L环引物，加无菌去离子水补足至25μL。

7.根据权利要求5所述的一种检测青稞黑穗病的方法，其特征在于，反应条件为65℃，60min，间隔1min读取荧光。

8.权利要求1所述的引物在检测青稞黑穗病中的应用。