CN108384834A - 一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害病原菌检测技术领域，特别是一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其应用。在LAMP体系中，4条引物特异性识别靶标基因的6个区域，而在PCR体系中只有2条引物识别2个区域。本发明应用LAMP设计软件设计4条引物，包括2条外引物F3、B3和2条内引物FIP、BIP，7个不同地理来源的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色阳性，2%琼脂糖凝胶电泳检测均出现梯度条带，而对照和其他病原菌均呈橘色阴性，电泳检测没有条带。应用LAMP设计4条引物，实现上述效果。同时通过电泳和显色两种方法进行比对判断，大幅提升检测准确性。

Description

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其 应用

技术领域

本发明涉及植物病害病原菌检测技术领域，特别是一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其应用。

背景技术

青稞茎基腐病发病症状：苗期田间有明显的发病中心，发病区域的植株长势弱，出现发黄或萎蔫，严重时会产生缺埂断垄及秃斑症状；苗期青稞植株感染茎基腐病后多萎蔫或发黄，严重时整株死亡，发现根及茎基部变褐缢缩或腐烂，种子根变褐发干萎缩，茎基部变褐缢缩腐烂。成株期青稞植株感染茎基腐病后多表现为穗白，粒瘪，茎杆发褐或黑红，根及茎基部部缢缩发干或腐烂。

现有研究发现青稞茎基腐病的主要病原菌为燕麦镰孢菌：在培养基上背面初期成为淡玫红色，正面的气生菌丝颜色为白色，呈绒毛形状。当在PSA培养基上生长7 d时，背面的颜色变为玫红色到深红色，略带黄棕色；正面的颜色多数在中心呈现黄棕色，而其边缘为白色，伴随玫红色产生。菌落的颜色随着生长时间的变化而发生变化，大多数燕麦镰孢菌生长到后期，菌落正面的颜色偏向黄色，背面呈现玫红色且加深，菌丝生长得像绒毡状。在CLA培养基上，燕麦镰孢菌的大型分生孢子形态呈现一致、整齐、弯曲像镰孢状；顶细胞、足细胞很明显，大多数有4~7个分隔。上述培养方法虽然可以进行燕麦镰孢菌检测，但是需要工作人员实时观测形状变化情况并进行记录才能进行判定。上述方法培养周期长、判定标准不一。尤其无法适用田间快速测试，培养周期过长检测结果确定后田间已发生大面积灾害，无法提前防控。

发明内容

本发明解决现有技术不足提供一种操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤：

A、病样采集

采集青稞茎基腐病病株及病株周围土样，病株和土样在室内环境以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；

B、菌株培养

病原菌菌株培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15-20g、自来水1000 mL，光照条件下室温25℃进行培养；

C、菌株基因组DNA提取

采用E. Z. N. A^TM HP Fungal DNA Kit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600 µL的CPL缓冲液，加10 µLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600 µL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000 r/min下离心处理5 min；

吸取上清液300 µL至新的离心管中，加150 µL CXD缓冲液，再加300 µL无水乙醇制得上清混合液，将上述750 µL上清混合液加到HiBind DNA柱中，转速12000 r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液；

沉淀物中加入650 µL SPW洗液，转速12000 r/min下离心处理1 min；再加入650 µLSPW洗液，转速12000 r/min下离心处理1 min，留取沉淀物弃掉滤液，沉淀物放入新的离心管中转速12000 r/min下离心处理1 min；

将洗涤后的沉淀物转入新的离心管中，加入预热65 ℃的Elution缓冲液100 µL，转速12000 r/min下离心处理2 min，最后转速12000 r/min下离心处理1 min制得DNA模板；

D、病原菌ITS序列的扩增及LAMP引物的设计

对青稞茎基腐病菌的溶解DNA中ITS序列进行扩增、克隆、测序，获得其病菌燕麦镰孢菌的ITS序列，采用现有LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；F3：CGCT CCCT CATT CGAA ACG、B3：TTGA AGGAACCC TTTC CGAG、FIP：AGTG GCGG GGTA AGAT ACCC CGTC CGAA AATT TTGC GGTGC、BIP：GCTT GCCC TGTT CCCA CAAA ACTT CCAG TGGT TAGT GACTGC；

F、LAMP反应体系的建立

在60～80℃范围内进行LAMP反应，反应时间20min-1h，LAMP反应体系为10×Isothermal Amplification Buffe 1～3 µL、100mmol/L MgSO₄ 0.5～2µL、内引物FIP0.5～1.5µL、内引物BIP 0.5～1.5 µL、外引物F3 0.5～1.5µL、外引物B3 0.5～1.5µL、100mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNTP 2.0～4 .0µL、DNA模板2.0～4.0µL，浓度8 000 U/mL的Bst 2.0DNA聚合酶0.5～1.5 µL、加双蒸水ddH₂O 8.0～11.0µL至总体系25 µL；

G、扩增结果判断方法

反应结束后取3 µL产物，用质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现连续阶梯状条带，则判定为阳性，检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌；未出现条带，则判定为阴性，未检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

所述步骤G中加入0.5 µL荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌，阴性反应为橘色，未检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

所述步骤F中65℃进行LAMP反应，反应时间1h。

所述步骤F中80℃进行LAMP反应，反应时间20min。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的特异性验证方法，包括如下步骤：

H、燕麦镰孢菌LAMP检测体系的特异性验证

选取多个不同地区的青稞茎基腐病菌制备DNA模板，以ddH₂O替代目标菌的DNA模板为阴性对照，以燕麦镰孢菌相近种尖孢镰孢菌Fusarium oxysporium和其他3个非镰孢菌Phytophthora infestans、Botrytis cinerea、Rhizoctonia solani的基因组DNA作为对照组，分别进行LAMP反应，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

所述选取多个不同地区的青稞茎基腐病菌制备DNA模板，多个不同地区包括甘肃省甘南州临潭县古战乡包家寺村、甘肃省甘南州合作市多河乡更治地村、甘肃省甘南州卓尼县木耳镇七车村、甘肃省甘南州临潭县城关镇上高崖村、甘肃省甘南州卓尼县申藏乡申藏村、青海省海东市互助土族自治县南门峡镇北沟脑村、青海省海北州刚察县城等。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的灵敏度验证方法，包括如下步骤：

I、燕麦镰孢菌LAMP检测体系的灵敏度验证

采用10倍浓度系列稀释法将提取的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌的DNA模板进行梯度稀释，使其DNA模板质量浓度梯度分别为100 ng/µL、10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL和10 pg/µL，分别取2 µL作为模板进行LAMP反应，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的田间验证方法，包括如下步骤：

J、田间发病组织中燕麦镰孢菌的检测

田间随机选取样品200 mg病组织制备DNA将其作为模板进行LAMP扩增，观察反应管颜色变化。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的土壤病菌验证方法，包括如下步骤：

k、土壤中燕麦镰孢菌检测的灵敏度

取步骤B中病原菌菌株燕麦镰孢菌的孢子制备孢子悬浮液，取不含燕麦镰孢菌的土样每份0.25 g，放入2 mL的EP管中，EP管中分别添加不同数量的孢子10 000、1 000、100、10、1个，按照E. Z. N. A^TM. HP Fungal DNA Kit提取试剂盒说明书提取土壤样品总DNA，将其作为模板进行LAMP扩增，并以燕麦镰孢菌纯DNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

本发明的有益效果为：

1、引物特异性强

在LAMP体系中，4条引物特异性识别靶标基因的6个区域，而在PCR体系中只有2条引物识别2个区域。本发明专利应用LAMP设计软件设计4条引物，包括2条外引物F3、B3和2条内引物FIP、BIP，7个不同地理来源的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色（阳性），2%琼脂糖凝胶电泳检测均出现梯度条带，而对照和其他病原菌均呈橘色（阴性），电泳检测没有条带。应用LAMP设计4条引物，实现上述效果。同时通过电泳和显色两种方法进行比对判断，大幅提升检测准确性。

2、检测灵敏度高

LAMP技术检测灵敏度比普通PCR技术高10～1000倍。本发明专利灵敏度验证结果表明，LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10 pg，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测显示，100 ng～10pg的模板DNA均出现梯度条带。

3、反应速度快

PCR一般需要3～6 h,本发明专利优化的LAMP反应体系最佳反应程序为65℃ 1 h，80℃20 min。

4、直接用肉眼观察结果

本发明专利LAMP技术在反应完成后加入荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，阴性反应为橘色。

5、准确性高

本发明专利中，扩增产物的阴阳性，加入荧光染料SYBR Green I颜色变化检测的结果和凝胶电泳是否出现梯度条带完全吻合。

6、不易污染

荧光染料SYBR Green I可以在LAMP反应前加入到反应液中，可以有效避免反应后开盖加入荧光染料造成的污染问题。

7、对疑似病害样本直接检测

本发明专利LAMP技术对疑似病害样本提取的DNA进行检测，只需要提取青稞发病部位的总DNA就可以检测到燕麦镰孢菌的有无，该技术能够检测出青稞发病组织中的燕麦镰孢菌，排除了病害样本上含有多种微生物，手工不易分离纯化到目标菌的人为因素影响。

8、土壤中检测的灵敏度高

本发明专利LAMP技术在土壤中检测的灵敏度为10个燕麦镰孢菌孢子/ 0.25 g土壤，土壤检测灵敏度很高。

综上所述本发明专利在燕麦镰孢菌ITS特异序列基础上，建立了燕麦镰孢病菌LAMP简便、灵敏、快速和准确的方法，LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10 pg/µL，100ng/µL～10 pg/µL的模板DNA均出现梯度条带，土壤中检测的灵敏度为10个燕麦镰孢菌孢子/ 0.25 g土壤。该发明专利为生产上青稞茎基腐病燕麦镰孢菌的诊断和防治提供重要的实用价值。

附图说明

图1 为燕麦镰孢菌LAMP反应的电泳检测扩增产物示意图；

图2为燕麦镰孢菌LAMP反应的荧光染料变色示意图；

图3为燕麦镰孢菌LAMP特异性检测示意图；

图4为燕麦镰孢菌LAMP灵敏度检测示意图；

图5为田间土壤中燕麦镰孢菌的检测灵敏度检测示意图；

图6为田间发病组织中燕麦镰孢菌的浓度检测示意图。

具体实施方法

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤：

A、病样采集

采集青稞茎基腐病病株及病株周围土样，病株和土样在室内环境以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；

B、菌株培养

病原菌菌株培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15-20g、自来水1000 mL，光照条件下室温25℃进行培养；

C、菌株基因组DNA提取

采用E. Z. N. A^TM HP Fungal DNA Kit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600 µL的CPL缓冲液，加10 µLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600 µL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000 r/min下离心处理5 min；

吸取上清液300 µL至新的离心管中，加150 µL CXD缓冲液，再加300 µL无水乙醇制得上清混合液，将上述750 µL上清混合液加到HiBind DNA柱中，转速12000 r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液；

沉淀物中加入650 µL SPW洗液，转速12000 r/min下离心处理1 min；再加入650 µLSPW洗液，转速12000 r/min下离心处理1 min，留取沉淀物弃掉滤液，沉淀物放入新的离心管中转速12000 r/min下离心处理1 min；

将洗涤后的沉淀物转入新的离心管中，加入预热65 ℃的Elution缓冲液100 µL，转速12000 r/min下离心处理2 min，最后转速12000 r/min下离心处理1 min制得DNA模板；

D、病原菌ITS序列的扩增及LAMP引物的设计

对青稞茎基腐病菌的溶解DNA中ITS序列进行扩增、克隆、测序，获得其病菌燕麦镰孢菌的ITS序列，采用现有LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；F3：CGCT CCCT CATT CGAA ACG、B3：TTGA AGGAACCC TTTC CGAG、FIP：AGTG GCGG GGTA AGAT ACCC CGTC CGAA AATT TTGC GGTGC、BIP：GCTT GCCC TGTT CCCA CAAA ACTT CCAG TGGT TAGT GACTGC；

F、LAMP反应体系的建立

在60～80℃范围内进行LAMP反应，反应时间20min-1h，LAMP反应体系为10×Isothermal Amplification Buffe 1～3 µL、100mmol/L MgSO₄ 0.5～2µL、内引物FIP0.5～1.5µL、内引物BIP 0.5～1.5 µL、外引物F3 0.5～1.5µL、外引物B3 0.5～1.5µL、100mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNTP 2.0～4 .0µL、DNA模板2.0～4.0µL，浓度8 000 U/mL的Bst 2.0DNA聚合酶0.5～1.5 µL、加双蒸水ddH₂O 8.0～11.0µL至总体系25 µL；

G、扩增结果判断方法

反应结束后取3 µL产物，用质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现连续阶梯状条带，则判定为阳性，检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌；未出现条带，则判定为阴性，未检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

所述步骤G中加入0.5 µL荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌，阴性反应为橘色，未检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

所述步骤F中65℃进行LAMP反应，反应时间1h。

所述步骤F中80℃进行LAMP反应，反应时间20min。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的特异性验证方法，包括如下步骤：

H、燕麦镰孢菌LAMP检测体系的特异性验证

选取多个不同地区的青稞茎基腐病菌制备DNA模板，以ddH₂O替代目标菌的DNA模板为阴性对照，以燕麦镰孢菌相近种尖孢镰孢菌Fusarium oxysporium和其他3个非镰孢菌Phytophthora infestans、Botrytis cinerea、Rhizoctonia solani的基因组DNA作为对照组，分别进行LAMP反应，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

所述选取多个不同地区的青稞茎基腐病菌制备DNA模板，多个不同地区包括甘肃省甘南州临潭县古战乡包家寺村、甘肃省甘南州合作市多河乡更治地村、甘肃省甘南州卓尼县木耳镇七车村、甘肃省甘南州临潭县城关镇上高崖村、甘肃省甘南州卓尼县申藏乡申藏村、青海省海东市互助土族自治县南门峡镇北沟脑村、青海省海北州刚察县城等。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的灵敏度验证方法，包括如下步骤：

I、燕麦镰孢菌LAMP检测体系的灵敏度验证

采用10倍浓度系列稀释法将提取的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌的DNA模板进行梯度稀释，使其DNA模板质量浓度梯度分别为100 ng/µL、10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL和10 pg/µL，分别取2 µL作为模板进行LAMP反应，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的田间验证方法，包括如下步骤：

J、田间发病组织中燕麦镰孢菌的检测

田间随机选取样品200 mg病组织制备DNA将其作为模板进行LAMP扩增，观察反应管颜色变化。

一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的土壤病菌验证方法，包括如下步骤：

k、土壤中燕麦镰孢菌检测的灵敏度

取步骤B中病原菌菌株燕麦镰孢菌的孢子制备孢子悬浮液。取不含燕麦镰孢菌的土样每份0.25 g，放入2 mL的EP管中，EP管中分别添加不同数量的孢子10 000、1 000、100、10、1个，按照E. Z. N. A^TM. HP Fungal DNA Kit提取试剂盒说明书提取土壤样品总DNA，将其作为模板进行LAMP扩增，并以燕麦镰孢菌纯DNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

LAMP检测具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点，广泛应用于真菌、细菌、病毒、线虫等病原微生物的检测。

LAMP反应的原理，利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环，扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

LAMP反应的特点是，（1）灵敏度高：LAMP的检测灵敏度通常比PCR高10~1000倍，与real-time PCR灵敏度相近。（2）高特异性：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。（3）快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，比PCR反应更快完成。在LAMP扩增体系中增加1条环引物可加速扩增反应，缩短反应时间，使扩增反应能在30min内完成，提高了 LAMP检测的效率。（4）产物检测直观：LAMP扩增产生大量的双链DNA，向反应管中加入焚光染料SYBR Green I，根据颜色变化判断扩增是否发生。

LAMP引物设计及序列

应用LAMP设计软件进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP。检测青稞茎基腐病燕麦镰孢菌的LAMP最佳反应体系25 µL：10×Isothermal AmplificationBuffe 2.5 µL，100 mM MgSO₄ 1.5 µL，FIP Primer 1 µL，BIP Primer 1 µL，F3 Primer 1µL，B3 Primer 1 µL，10 mM dNTP 3.5 µL，模板DNA 2.5 µL，8 000 U/mL的Bst 2.0 DNA聚合酶1 µL，ddH₂O 10 µL。质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳显示，阳性出现连续阶梯状条带，而阴性对比M未出现条带如图1所示。为验证效果肉眼观察燕麦镰孢菌LAMP反应液阳性为黄绿色，而对照产物为橘色，呈阴性如图2所示。通过反应温度进行优化，确定LAMP引物最佳反应温度为65℃1 h，黄绿显色更佳准确。

特异性检测

7个不同地理来源的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌LAMP检测均显示黄绿色，而阴性对照（M）和其它 4个病原菌LAMP检测均显示橘色如图3所示。1、包家寺村；2、Phytophthora infestans；3、Botrytis cinerea；4、Rhizoctonia solani；5、更治地村；6、七车村；7、Fusarium oxysporium；8、上高崖村；9、阴性对照；10、申藏村；11、北沟脑村；12、刚察县城；M、ddH₂O。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，阳性均出现梯度条带，阴性对照和其它4个病原菌则没有出现任何条带。以上结果表明，该 LAMP引物能够特异性的检测不同地理来源的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

灵敏度验证

以10 pg为模板时，反应产物仍然可显示黄绿色如图4所示，1～5：浓度依次为100 ng/µL、10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL、10 pg/µL；6：阴性对照。说明该LAMP反应体系可以检测到10 pg 的燕麦镰孢菌DNA。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，100 ng～10 pg模板DNA均可出现梯度条带，而对照ddH₂O模板未出现条带。

田间发病组织中燕麦镰孢菌的检测

随机预先选取12份样品，田间样品10份、燕麦镰孢菌标准阳性样品1份、ddH₂O标准阴性样品1份，其中田间样品中发病5份、未发病5份。具体测试如图5所示，附图结果表明样品信息与检测结果一致，可以快速在田间进行发病检测。该技术能够排除寄主植物及其他非目标菌的干扰，快速、准确地从青稞发病组织中检测出燕麦镰孢菌。LAMP检测技术用于燕麦镰孢菌的检测和青稞茎基腐病的快速诊断。

土壤中燕麦镰孢菌的浓度检测灵敏度

1号阳性对照，2～5号燕麦镰孢菌10 000、1 000、100、10个孢子悬浮液LAMP检测均呈黄绿色的阳性反应，如图6表明LAMP技术在土壤中检测的灵敏度为10个燕麦镰孢菌孢子/0.25 g土壤。1号：燕麦镰孢菌标准阳性样品1份；2～6号：10 000、1 000、100、10、1个孢子悬浮液；7号：阴性对照。6号燕麦镰孢菌1个孢子悬浮液LAMP检测呈橘色的阴性反应，表明LAMP检测对土壤中1个燕麦镰孢菌孢子悬浮液未检测到，6号阴性对照呈现橘色。本方法可用于土壤中携带燕麦镰孢菌的高灵敏度检测。

Claims (9)

1.一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于包括如下步骤：

A、病样采集

采集青稞茎基腐病病株及病株周围土样，病株和土样在室内环境以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；

B、菌株培养

病原菌菌株培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15-20g、自来水1000 mL，光照条件下室温25℃进行培养；

C、菌株基因组DNA提取

采用E. Z. N. A^TM HP Fungal DNA Kit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600 µL的CPL缓冲液，加10 µLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600 µL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000 r/min下离心处理5 min；

吸取上清液300 µL至新的离心管中，加150 µL CXD缓冲液，再加300 µL无水乙醇制得上清混合液，将上述750 µL上清混合液加到HiBind DNA柱中，转速12000 r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液；

沉淀物中加入650 µL SPW洗液，转速12000 r/min下离心处理1 min；再加入650 µLSPW洗液，转速12000 r/min下离心处理1 min，留取沉淀物弃掉滤液，沉淀物放入新的离心管中转速12000 r/min下离心处理1 min；

将洗涤后的沉淀物转入新的离心管中，加入预热65 ℃的Elution缓冲液100 µL，转速12000 r/min下离心处理2 min，最后转速12000 r/min下离心处理1 min制得DNA模板；

D、病原菌ITS序列的扩增及LAMP引物的设计

对青稞茎基腐病菌的溶解DNA中ITS序列进行扩增、克隆、测序，获得其病菌燕麦镰孢菌的ITS序列，采用现有LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；F3：CGCT CCCT CATT CGAA ACG、B3：TTGA AGGAACCC TTTC CGAG、FIP：AGTG GCGG GGTA AGAT ACCC CGTC CGAA AATT TTGC GGTGC、BIP：GCTT GCCC TGTT CCCA CAAA ACTT CCAG TGGT TAGT GACTGC；

F、LAMP反应体系的建立

在60～80℃范围内进行LAMP反应，反应时间20min-1h，LAMP反应体系为10×Isothermal Amplification Buffe 1～3 µL、100mmol/L MgSO₄ 0.5～2µL、内引物FIP0.5～1.5µL、内引物BIP 0.5～1.5 µL、外引物F3 0.5～1.5µL、外引物B3 0.5～1.5µL、100mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNTP 2.0～4 .0µL、DNA模板2.0～4.0µL，浓度8 000 U/mL的Bst 2.0DNA聚合酶0.5～1.5 µL、加双蒸水ddH₂O 8.0～11.0µL至总体系25 µL；

G、扩增结果判断方法

反应结束后取3 µL产物，用质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现连续阶梯状条带，则判定为阳性，检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌；未出现条带，则判定为阴性，未检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

2.根据权利要求1所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述步骤G中加入0.5 µL荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌，阴性反应为橘色，未检出青稞茎基腐病燕麦镰孢菌。

3.根据权利要求1所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述步骤F中65℃进行LAMP反应，反应时间1h。

4.根据权利要求1所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述步骤F中80℃进行LAMP反应，反应时间20min。

5.根据权利要求1 、2 、3或4所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的特异性验证方法，其特征在于包括如下步骤：

H、燕麦镰孢菌LAMP检测体系的特异性验证

选取多个不同地区的青稞茎基腐病菌制备DNA模板，以ddH₂O替代目标菌的DNA模板为阴性对照，以燕麦镰孢菌相近种尖孢镰孢菌Fusarium oxysporium和其他3个非镰孢菌Phytophthora infestans、Botrytis cinerea、Rhizoctonia solani的基因组DNA作为对照组，分别进行LAMP反应，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

6.根据权利要求5所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的特异性验证方法，其特征在于所述选取多个不同地区的青稞茎基腐病菌制备DNA模板，多个不同地区包括甘肃省甘南州临潭县古战乡包家寺村、甘肃省甘南州合作市多河乡更治地村、甘肃省甘南州卓尼县木耳镇七车村、甘肃省甘南州临潭县城关镇上高崖村、甘肃省甘南州卓尼县申藏乡申藏村、青海省海东市互助土族自治县南门峡镇北沟脑村、青海省海北州刚察县城等。

7.根据权利要求1 、2 、3或4所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的灵敏度验证方法，其特征在于包括如下步骤：

I、燕麦镰孢菌LAMP检测体系的灵敏度验证

采用10倍浓度系列稀释法将提取的青稞茎基腐病燕麦镰孢菌的DNA模板进行梯度稀释，使其DNA模板质量浓度梯度分别为100 ng/µL、10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL和10 pg/µL，分别取2 µL作为模板进行LAMP反应，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。

8.根据权利要求1 、2 、3或4所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的田间验证方法，其特征在于包括如下步骤：

J、田间发病组织中燕麦镰孢菌的检测

田间随机选取样品200 mg病组织制备DNA将其作为模板进行LAMP扩增，观察反应管颜色变化。

9.根据权利要求1 、2 、3或4所述的一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测的土壤病菌验证方法，其特征在于包括如下步骤：

k、土壤中燕麦镰孢菌检测的灵敏度

取步骤B中病原菌菌株燕麦镰孢菌的孢子制备孢子悬浮液，取不含燕麦镰孢菌的土样每份0.25 g，放入2 mL的EP管中，EP管中分别添加不同数量的孢子10 000、1 000、100、10、1个，按照E. Z. N. A^TM. HP Fungal DNA Kit提取试剂盒说明书提取土壤样品总DNA，将其作为模板进行LAMP扩增，并以燕麦镰孢菌纯DNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照，以质量浓度2%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现阶梯状条带来判定结果或观察反应管颜色变化。