CN108315469A - 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途 - Google Patents

环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108315469A
CN108315469A CN201810313041.4A CN201810313041A CN108315469A CN 108315469 A CN108315469 A CN 108315469A CN 201810313041 A CN201810313041 A CN 201810313041A CN 108315469 A CN108315469 A CN 108315469A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
bacteria
reversed
sickle
ring
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810313041.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108315469B (zh
Inventor
戴小枫
郭维
单柳颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Fuxing Gaozhao Technology Co ltd
Original Assignee
Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Food Science and Technology of CAAS filed Critical Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority to CN201810313041.4A priority Critical patent/CN108315469B/zh
Publication of CN108315469A publication Critical patent/CN108315469A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108315469B publication Critical patent/CN108315469B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的引物组合物、该引物组合物在检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌中的用途、一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌的试剂盒和一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌的方法。

Description

环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及 其用途
技术领域
本公开涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的引物组合物、该引物组合物在检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)中的用途、一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的试剂盒和一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的方法。
背景技术
镰刀菌(Fusarium)是一种世界范围内非常重要的植物病原真菌，引起玉米、小麦和水稻等多种谷类作物的病害造成严重经济损失；其中有些镰刀菌还可以产生真菌毒素,引起人畜的食物中毒甚至死亡。镰刀型玉米穗(茎)腐病是由一种或多种镰刀菌侵染引起的病害，其病原菌主要有轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)、层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)、胶胞镰刀菌(Fusarium subglutinans)和木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)等。Fusarium temperatum是2011年Scauflaire等从比利时的玉米穗(茎)腐病样品上分离鉴定的一个镰刀菌新种。Wang等2014年首次报道了该菌已在我国19个省市引起玉米穗(茎)腐病，并产生包括伏马菌素、串珠镰刀菌素和白僵菌素等在内的多种真菌毒素。玉米是重要的粮、经、饲兼用作物，因此，出于粮食安全和饲料安全的考虑，有必要开发出快速检测玉米及其加工产品中是否存在Fusarium temperatum的检测方法。
传统的镰刀菌分类鉴定主要是基于形态学特征，根据菌落形态、分生孢子、分生孢子梗和分生孢子座等进行区分与鉴定。1989年，Guader等人将分子系统学方法用于镰刀菌属中真菌“种”的鉴定。O’Donnell等也采用了分子检测技术对镰刀菌属真菌进行了系统发育学种的研究，但其检测时间仍然较长，依赖于PCR仪等精密仪器，不能满足快速检测的需求。
环介导等温扩增技术是日本学者Notomi等于2000年建立的一种新型核酸等温扩增技术，自建立以来已广泛应用到对真菌、细菌、病毒等病原微生物的检测中。该技术针对靶基因保守的6个区域设计4条引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换功能在恒温条件下高效特异性扩增靶基因，大量合成目的片段的同时，产生乳白色的焦磷酸镁沉淀。与实验室传统的常规PCR检测方法相比，环介导等温扩增技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、不需要依赖PCR仪等昂贵设备、检测成本低和具有广泛的应用前景等优势。但是，针对具体检测对象的引物筛选是影响环介导等温扩增技术的敏感性与特异性的关键点。
发明内容
本公开的目的是提供一种操作简便、特异性强、灵敏度高的检测致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的检测方法。
为了实现上述目的，本公开提供一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的引物组合物，该引物组合物包括正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，正向环引物LF和反向环引物LB；其中，所述正向外引物F3为5’-GCTGGCAACTTGAGGTGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示；所述反向外引物B3为5’-AGAAGTTGCCTACCCTGCA-3’，如SEQ ID NO.2所示；所述正向内引物FIP为5’-CCGATCTAGTCCGCACGGGAGCGGTCTAGGGTAGGCTAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；所述反向内引物BIP为5’-ACAGGGTAGGCGGCTTAGACTCCCATCTCGTTCCGAAGC-3’，如SEQ ID NO.4所示；所述正向环引物LF为5’-GCCAATATCAAATTCGACCAAGACA-3’，如SEQ ID NO.5所示；所述正向环引物LB为5’-CTCCGGCTGACGGATCTCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。
本公开还提供了引物组合物在检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusariumtemperatum)中的用途，该引物组合物为如上所述的引物组合物。
本公开还提供了一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的试剂盒，该试剂盒包括反应液和检测液；其中，所述反应液中含有如上所述的引物组合物。
本公开还提供了一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的方法，该方法包括如下步骤：S1、提取待检测样品的DNA，并以提取的DNA为模板，使用如上所述的引物组合物或者如上所述的试剂盒进行环介导等温扩增反应，得到反应后的物料；
S2、观察反应后的物料的颜色变化，反应后的物料为黄绿色表示检测为阳性，提示待检测样品中存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)；反应后的物料为橙色表示检测为阴性，即不存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)。
通过上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：
1)特异性强：本发明根据镰刀菌Fusarium temperatum的核糖体28s序列，通过与其它镰刀菌的序列比较，选取差异性较大的一段序列设计特异性LAMP引物，对镰刀菌Fusarium temperatum进行特异性识别，其特异性强、灵敏度高，使本发明能够在“种”水平上快速准确的完成镰刀菌Fusarium temperatum的检测。
2)操作简便快捷：本发明提供的检测镰刀菌Fusarium temperatum的LAMP方法克服了镰刀菌属真菌形态学分类鉴定的困难以及现有利用特异引物进行PCR鉴定需要PCR仪、检测时间长和不适合大规模应用等问题。本发明检测方法在65℃等温条件下，45～60min内即可完成反应，快速、方便、高效、高灵敏的检测出玉米中是否带有镰刀菌Fusariumtemperatum。
3)成本低，实用性强：本方法无需昂贵的试剂、精密的仪器，仅需要恒温水浴锅或金属浴即可完成检测。LAMP反应结束后通过SYBR Green I的颜色差别，可直接判断结果，增加了其在带菌玉米及其加工产品中检测的应用价值。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是用于检测镰刀菌Fusarium temperatum的LAMP引物组合的特异性验证结果。图中第1管显示为黄绿色，呈阳性，其它为橙色，呈阴性。其中，编号1：镰孢菌F.temperatum，2：F.verticillioides，3：F.proliferatum，4：F.fujikuroi，5：F.graminearum，6：F.meridionale，7：F.boothii，8：F.asiaticum，9：F.cortaderiae，10：F.cerealis，11：F.brachygibbosum，12：F.incarnatum，13：F.equiseti，14：F.oxysporum，15：F.avenaceum，16：Pythium acanthophoron，17：Bipolaris zeicola，18：Alternaria alternata，19：Nigrospora sp.，20：Trichoderma，21：Pestalotiopsis sp.，22：Bipolaris sp.，23：Verticillium dahliae，24：阴性对照。
图2是用于检测镰刀菌Fusarium temperatum的LAMP引物组合的灵敏度试验结果。图中第1管显示为黄绿色，呈阳性，其它为橙色，呈阴性。编号1～7的基因组浓度依次为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl，8为阴性对照。从100pg/μl开始，颜色开始变化，说明检测的灵敏度为100pg/μl。
图3是玉米组织中镰刀菌Fusarium temperatum的检测结果。上图为接种玉米茎干，下图为接种玉米种子。第1管和第3～5管显示为黄绿色，呈阳性，其它为橙色，呈阴性。编号1是浓度为100ng/μl的镰刀菌Fusarium temperatum基因组DNA，编号2为无菌水对照，编号3～5为接种7d的玉米茎干或种子病部组织基因组DNA，编号6～8为接种无菌水的玉米茎干或种子植物组织基因组DNA。结果表明在接种镰刀菌Fusarium temperatum的玉米组织中均能检测出镰刀菌Fusarium temperatum的存在，而在对照组中未检测到镰刀菌Fusariumtemperatum的存在。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
为了实现上述目的，本公开提供一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的引物组合物，该引物组合物包括正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，正向环引物LF和反向环引物LB；其中，所述正向外引物F3为5’-GCTGGCAACTTGAGGTGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示；所述反向外引物B3为5’-AGAAGTTGCCTACCCTGCA-3’，如SEQ ID NO.2所示；所述正向内引物FIP为5’-CCGATCTAGTCCGCACGGGAGCGGTCTAGGGTAGGCTAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；所述反向内引物BIP为5’-ACAGGGTAGGCGGCTTAGACTCCCATCTCGTTCCGAAGC-3’，如SEQ ID NO.4所示；所述正向环引物LF为5’-GCCAATATCAAATTCGACCAAGACA-3’，如SEQ ID NO.5所示；所述正向环引物LB为5’-CTCCGGCTGACGGATCTCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。
其中，玉米穗(茎)腐病是指玉米茎基腐病和/或玉米穗腐病。
其中，可选地，以摩尔比计算，相对于1份正向外引物F3，所述反向外引物B3的含量为0.9-1.1份，所述正向内引物FIP的含量为7-9份，所述反向内引物BIP的含量为7-9份，所述正向环引物LF的含量为3-5份，所述反向环引物LB的含量为3-5份。更优选地，以摩尔比计算，相对于1份正向外引物F3，所述反向外引物B3的含量为1份，所述正向内引物FIP的含量为8份，所述反向内引物BIP的含量为8份，所述正向环引物LF的含量为4份，所述反向环引物LB的含量为4份。
本公开还提供了引物组合物在检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusariumtemperatum)中的用途，该引物组合物为如上所述的引物组合物。
本公开还提供了一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的试剂盒，该试剂盒包括反应液和检测液；其中，所述反应液中含有如上所述的引物组合物。
其中，可选地，所述反应液中，所述正向外引物F3的浓度为0.1-0.3μM，所述反向外引物B3的浓度为0.1-0.3μM，所述正向内引物FIP的浓度为1.4-1.8μM，所述反向内引物BIP的浓度为1.4-1.8μM，所述正向环引物LF的浓度为0.7-0.9μM，所述反向环引物LB的浓度为0.7-0.9μM。优选地，所述反应液中，所述正向外引物F3的浓度为0.2μM，所述反向外引物B3的浓度为0.2μM，所述正向内引物FIP的浓度为1.6μM，所述反向内引物BIP的浓度为1.6μM，所述正向环引物LF的浓度为0.8μM，所述反向环引物LB的浓度为0.8μM。
其中，可选地，所述反应液中还含有18-22mM且pH为8.6-9.0的Tris-HCl、8-12mM的KCl、8-12mM的(NH4)2SO4、0.05-0.15体积％的Triton X-100、5-7mM的MgSO4、1.2-1.6mM的dNTPs、0.6-1M的甜菜碱和300-350U/ml Bst DNA聚合酶。优选地，所述反应液中还含有20mM且pH为8.8的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、0.1体积％的Triton X-100、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTPs、0.8M的甜菜碱和320 U/ml Bst DNA聚合酶。
其中，可选地，所述检测液为含有SYBR GreenⅠ的核酸显色液体。优选地，SYBRGreenⅠ的浓度为一万倍工作浓度(10000×)。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
本公开还提供了一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的方法，该方法包括如下步骤：S1、提取待检测样品的DNA，并以提取的DNA为模板，使用如上所述的引物组合物或者如上所述的试剂盒进行环介导等温扩增反应，得到反应后的物料；S2、观察反应后的物料的颜色变化，反应后的物料为黄绿色表示检测为阳性，提示待检测样品中存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)；反应后的物料为橙色表示检测为阴性，即不存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)。
可选地，其中，所述环介导等温扩增反应的温度为63-67℃，时间为45-60min。
进一步优选地，该方法详细地包括：取1-3μl样品DNA溶液，加入20-25μl的反应液进行环介导等温扩增反应，反应程序为63-67℃，时间为45-60min，反应结束后加入检测液，对扩增产物进行颜色变化的观察。
当发生环介导等温扩增反应时，反应后的物料中产生一些具有不同茎长度茎环结构的DNA和带有许多环的类似花椰莱结构的DNA的混合物。通过SYBR Green I的显色反应结果所示，致病镰刀菌(Fusarium temperatum)的反应管里均为黄绿色，且紫外灯下有明显荧光，为阳性结果，而其它的镰刀菌、非镰刀菌和阴性对照反应管均为橙色，无荧光，为阴性结果。
当用于检测植物样本中是否存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)时，可以采用植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根)参照其说明书提取DNA。
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
用于检测致病镰刀菌Fusarium temperatum的LAMP引物组合的特异性实验。
为了验证LAMP方法的特异性，以23种真菌作为参试对象，其中1种为Fusariumtemperatum，14种为其它镰刀菌，8种为非镰孢菌(表1)。
表1用于检测镰孢菌Fusarium temperatum特异性的真菌菌株
编号 拉丁名 寄主 来源 LAMP反应结果
1 F.temperatum 玉米 云南 +
2 F.verticillioides 玉米 河南 -
3 F.proliferatum 玉米 辽宁 -
4 F.fujikuroi 玉米 河南 -
5 F.graminearum 玉米 河南 -
6 F.meridionale 玉米 河南 -
7 F.boothii 玉米 云南 -
8 F.asiaticum 玉米 云南 -
9 F.cortaderiae 玉米 云南 -
10 F.cerealis 玉米 云南 -
11 F.brachygibbosum 玉米 云南 -
12 F.incarnatum 玉米 河南 -
13 F.equiseti 玉米 云南 -
14 F.oxysporum 玉米 云南 -
15 F.avenaceum 玉米 云南 -
16 Pythium acanthophoron 玉米 云南 -
17 Bipolaris zeicola 玉米 云南 -
18 Alternaria alternata 玉米 云南 -
19 Nigrospora sp. 玉米 云南 -
20 Trichoderma 玉米 云南 -
21 Pestalotiopsis sp. 玉米 云南 -
22 Bipolaris sp. 玉米 云南 -
23 Verticillium dahliae 棉花 新疆 -
模板DNA提取：刮取PDA平板上的菌丝，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根)提取DNA。步骤参见试剂盒说明书。取2μl DNA溶液作为LAMP扩增的模板。
制备LAMP反应液，其含有：SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3 0.2μM，SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3 0.2μM，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP 1.6μM，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP 1.6μM，SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF 0.8μM和SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB 0.8 μM；20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Triton X-100，6mM MgSO4，1.4mM dNTPs，0.8M Betain，320 U/ml Bst DNA Polymerase LargeFragment，以下相同。
LAMP反应：取23μl LAMP反应液，加入2μl DNA溶液，65℃反应60min，最后加入0.25μl 10000×SYBR GreenⅠ观察颜色变化，结果如图1和表1所示。
LAMP检测结果显示，只有加入致病镰刀菌Fusarium temperatum基因组DNA的反应管观察到黄绿色的阳性反应，其余反应皆为阴性。
实施例2
用于检测镰刀菌Fusarium temperatum的LAMP引物组合的灵敏度实验。
为了验证LAMP方法的灵敏度，提取致病镰刀菌Fusarium temperatum基因组DNA，并采用NanoDrop 2000测定DNA浓度，超纯水进行10倍梯度稀释为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl，-20℃保存。
LAMP反应：取23μl LAMP反应液，加入2μl DNA溶液，65℃反应60min，最后加入0.25μl 10000×SYBR Green Ⅰ观察颜色变化，结果如图2所示。
LAMP检测结果显示，从100pg/μl开始，颜色开始变化，说明检测的灵敏度为100pg/μl。
实施例3
玉米组织中检测致病镰刀菌Fusarium temperatum的特异性实验。
模板DNA的提取：待测样品为B73玉米幼苗和B73玉米种子，1为阳性对照，2为阴性对照，3～5为接种致病镰刀菌Fusarium temperatum的玉米幼苗和种子，6～8为未接种的玉米幼苗和种子。待测玉米样品采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根)提取DNA。步骤参见试剂盒说明书。取2μl提好的基因组DNA溶液作为LAMP扩增的模板。
LAMP反应：取23μl LAMP反应液，加入2μl DNA溶液，65℃反应60min，最后加入0.25μl 10000×SYBR GreenⅠ观察颜色变化，结果如图3所示。
LAMP检测结果显示，接种致病镰刀菌Fusarium temperatum的玉米种子和幼苗样品均呈阳性结果，表明本发明提供的方法能够快速准确的检测出镰刀菌Fusariumtemperatum，而未接种致病镰刀菌Fusarium temperatum的玉米种子和幼苗样品呈阴性，表明组织内没有致病镰刀菌Fusarium temperatum。
对比例1
按照实施例1和2相同的方法进行检测，所不同的是，LAMP反应液中的引物更换为SEQ ID NO.7所示的正向外引物F3 0.2μM，SEQ ID NO.8所示的反向外引物B3 0.2μM，SEQID NO.9所示的正向内引物FIP 1.6μM，SEQ ID NO.10所示的反向内引物BIP 1.6μM，SEQ IDNO.11所示的正向环引物LF 0.8μM。
SEQ ID NO.7为F3：GGTACAGGGTAGGCAGACTT；
SEQ ID NO.8为B3：TGCTCCCTCTCATATGTCCA；
SEQ ID NO.9为FIP：AATCGACTCACGCCCACCAGTTCCTCCTGCCAGTACTTGT；
SEQ ID NO.10为BIP：TTGCGGGAAATCAAAAGTGGCCCCGACAATGTTCCAGTCAGA；
SEQ ID NO.11为LF：CACAAAACCATTTTGCACGCACAA。
结果显示，无论是加入致病镰刀菌Fusarium temperatum基因组DNA的反应管，还是Fusarium verticillioides等其他基因组DNA的反应管，都没有产生颜色变化，即未能从中检测出镰刀菌Fusarium temperatum，因此特异性不佳。
本公开的试剂盒及其检测方法具有特异性强、准确性高、操作简单、不需要PCR仪等昂贵设备的特点，为快速检测玉米种子是否携带致病镰刀菌(Fusarium temperatum)提供了一个新的检测技术方案，易于大规模推广应用。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途
<130> 9269CAAS_F
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctggcaact tgaggtgta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaagttgcc taccctgca 19
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgatctagt ccgcacggga gcggtctagg gtaggctag 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acagggtagg cggcttagac tcccatctcg ttccgaagc 39
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccaatatca aattcgacca agaca 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccggctga cggatctca 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtacagggt aggcagactt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctccctct catatgtcca 20
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatcgactca cgcccaccag ttcctcctgc cagtacttgt 40
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgcgggaaa tcaaaagtgg ccccgacaat gttccagtca ga 42
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacaaaacca ttttgcacgc acaa 24

Claims (10)

1.一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusariumtemperatum)的引物组合物，其特征在于，该引物组合物包括正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，正向环引物LF和反向环引物LB；
其中，所述正向外引物F3为5’-GCTGGCAACTTGAGGTGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示；
所述反向外引物B3为5’-AGAAGTTGCCTACCCTGCA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
所述正向内引物FIP为5’-CCGATCTAGTCCGCACGGGAGCGGTCTAG GGTAGGCTAG-3’，如SEQID NO.3所示；
所述反向内引物BIP为5’-ACAGGGTAGGCGGCTTAGACTCCCATCTC GTTCCGAAGC-3’，如SEQID NO.4所示；
所述正向环引物LF为5’-GCCAATATCAAATTCGACCAAGACA-3’，如SEQ ID NO.5所示；
所述正向环引物LB为5’-CTCCGGCTGACGGATCTCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其中，以摩尔比计算，相对于1份正向外引物F3，所述反向外引物B3的含量为0.9-1.1份，所述正向内引物FIP的含量为7-9份，所述反向内引物BIP的含量为7-9份，所述正向环引物LF的含量为3-5份，所述反向环引物LB的含量为3-5份。
3.根据权利要求2所述的引物组合物，其中，以摩尔比计算，相对于1份正向外引物F3，所述反向外引物B3的含量为1份，所述正向内引物FIP的含量为8份，所述反向内引物BIP的含量为8份，所述正向环引物LF的含量为4份，所述反向环引物LB的含量为4份。
4.引物组合物在检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusarium temperatum)中的用途，其特征在于，该引物组合物为权利要求1-3中任意一项所述的引物组合物。
5.一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusariumtemperatum)的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括反应液和检测液；其中，所述反应液中含有权利要求1-3中任意一项所述的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述反应液中，所述正向外引物F3的浓度为0.1-0.3μM，所述反向外引物B3的浓度为0.1-0.3μM，所述正向内引物FIP的浓度为1.4-1.8μM，所述反向内引物BIP的浓度为1.4-1.8μM，所述正向环引物LF的浓度为0.7-0.9μM，所述反向环引物LB的浓度为0.7-0.9μM。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述反应液中，所述正向外引物F3的浓度为0.2μM，所述反向外引物B3的浓度为0.2μM，所述正向内引物FIP的浓度为1.6μM，所述反向内引物BIP的浓度为1.6μM，所述正向环引物LF的浓度为0.8μM，所述反向环引物LB的浓度为0.8μM。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的试剂盒，其中，所述反应液中还含有18-22mM且pH为8.6-9.0的Tris-HCl、8-12mM的KCl、8-12mM的(NH4)2SO4、0.05-0.15体积％的Triton X-100、5-7mM的MgSO4、1.2-1.6mM的dNTPs、0.6-1M的甜菜碱和300-350U/ml Bst DNA聚合酶；所述检测液为含有SYBR GreenⅠ的核酸显色液体；所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照含有镰刀菌(Fusarium temperatum)的基因组DNA，所述阴性对照为空白的反应液。
9.一种环介导等温扩增法检测引起玉米穗(茎)腐病的致病镰刀菌(Fusariumtemperatum)的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、提取待检测样品的DNA，并以提取的DNA为模板，使用权利要求1-3中任意一项所述的引物组合物或者权利要求5-8中任意一项所述的试剂盒进行环介导等温扩增反应，得到反应后的物料；
S2、观察反应后的物料的颜色变化，反应后的物料为黄绿色表示检测为阳性，提示待检测样品中存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)；反应后的物料为橙色表示检测为阴性，即不存在致病镰刀菌(Fusarium temperatum)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述环介导等温扩增反应的温度为63-67℃，时间为45-60min。
CN201810313041.4A 2018-04-09 2018-04-09 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途 Active CN108315469B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810313041.4A CN108315469B (zh) 2018-04-09 2018-04-09 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810313041.4A CN108315469B (zh) 2018-04-09 2018-04-09 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108315469A true CN108315469A (zh) 2018-07-24
CN108315469B CN108315469B (zh) 2021-10-22

Family

ID=62897035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810313041.4A Active CN108315469B (zh) 2018-04-09 2018-04-09 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108315469B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114045358A (zh) * 2021-10-15 2022-02-15 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法
CN114164293A (zh) * 2021-12-03 2022-03-11 陕西师范大学 一种根茎类中药材lamp组合检测引物、检测试剂盒及检测方法
CN115896332A (zh) * 2022-11-21 2023-04-04 吉林大学 一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009284832A (ja) * 2008-05-29 2009-12-10 Kao Corp 耐熱性菌類の検出方法
CN102251055A (zh) * 2011-08-22 2011-11-23 山东省眼科研究所 基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒
CN102690887A (zh) * 2012-06-14 2012-09-26 福建省农业科学院植物保护研究所 香蕉枯萎病菌4号小种的lamp检测引物及其应用
CN103352078A (zh) * 2013-07-11 2013-10-16 南京农业大学 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物
CN103773854A (zh) * 2013-12-30 2014-05-07 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的lamp方法
CN104195254A (zh) * 2014-09-09 2014-12-10 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物
CN106893763A (zh) * 2015-12-17 2017-06-27 中国农业科学院植物保护研究所 一种梨孢镰刀菌的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009284832A (ja) * 2008-05-29 2009-12-10 Kao Corp 耐熱性菌類の検出方法
CN102251055A (zh) * 2011-08-22 2011-11-23 山东省眼科研究所 基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒
CN102690887A (zh) * 2012-06-14 2012-09-26 福建省农业科学院植物保护研究所 香蕉枯萎病菌4号小种的lamp检测引物及其应用
CN103352078A (zh) * 2013-07-11 2013-10-16 南京农业大学 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物
CN103773854A (zh) * 2013-12-30 2014-05-07 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的lamp方法
CN104195254A (zh) * 2014-09-09 2014-12-10 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物
CN106893763A (zh) * 2015-12-17 2017-06-27 中国农业科学院植物保护研究所 一种梨孢镰刀菌的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. MULÈ等: "Clustering of Trichothecene-Producing Fusarium Strains Determined from 28S Ribosomal DNA Sequences", 《APPL. ENVIRON. MICROBIOL》 *
J. SCAUFLAIRE等: "A multiplex real-time PCR method using hybridization probes for the detection and the quantification of Fusarium proliferatum, F. subglutinans, F. temperatum, and F. verticillioides", 《FUNGAL BIOLOGY》 *
卢维宏等: "玉米穗腐病中层出镰刀菌的分离与鉴定", 《植物保护学报》 *
谭贵良等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114045358A (zh) * 2021-10-15 2022-02-15 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法
CN114045358B (zh) * 2021-10-15 2023-08-18 南京农业大学 基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法
CN114164293A (zh) * 2021-12-03 2022-03-11 陕西师范大学 一种根茎类中药材lamp组合检测引物、检测试剂盒及检测方法
CN115896332A (zh) * 2022-11-21 2023-04-04 吉林大学 一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108315469B (zh) 2021-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103352078B (zh) 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物
CN106987653B (zh) 一种马铃薯晚疫病菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN108676910A (zh) 一种层出镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN108220474A (zh) 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN108315469A (zh) 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途
CN110982922B (zh) 基于lamp快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的引物组合物及方法
CN104774955B (zh) 一种葡萄座腔菌的检测方法
CN106893787A (zh) 鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光rt‑lamp检测引物组、试剂盒及其应用
CN108060257A (zh) 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法
CN114032331B (zh) 一种层出镰孢菌的特异性检测靶标fpro_09882及其应用
CN105441543B (zh) 一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用
CN109504799A (zh) 一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法
CN116516058A (zh) 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒
Buddhachat et al. One-step colorimetric LAMP (cLAMP) assay for visual detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice
CN106754911A (zh) 用于鉴定牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用
CN108384834A (zh) 一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其应用
Gupta et al. Molecular detection of Fusarium graminearum causing head blight of wheat by loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay
Yang et al. Development of loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of pomegranate twig blight and crown rot disease caused by Coniella granati
CN104195254B (zh) 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物
CN108531639A (zh) 一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法
CN108411017A (zh) 检测丁香假单胞菌番茄致病变种的lamp引物及方法
CN104328205A (zh) 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立
CN105219879B (zh) 用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN106244702B (zh) 定量检测荷花腐败病菌的实时荧光等温扩增引物组、反应体系及检测方法
CN104328220B (zh) 柑桔黄脉病毒的rt-lamp引物组、检测方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230703

Address after: Room 118, building 20, no.1-42, Lane 83, Hongxiang North Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai, 2013 13

Patentee after: Shanghai Fuxing Gaozhao Technology Co.,Ltd.

Address before: 100193 No. 2 Old Summer Palace West Road, Beijing, Haidian District

Patentee before: INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: Room 118, building 20, no.1-42, Lane 83, Hongxiang North Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai, 2013 13

Patentee after: Shanghai Fuxing Gaozhao Technology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: Room 118, building 20, no.1-42, Lane 83, Hongxiang North Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai, 2013 13

Patentee before: Shanghai Fuxing Gaozhao Technology Co.,Ltd.

Country or region before: China