CN102925568A - 瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种瓜类果斑病菌检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表Seq1&Seq2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表Seq3所示。本发明还进一步提供了瓜类果斑病菌检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环采集荧光信号，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为保证瓜葫芦科种子健康提供了技术支撑。

Description

瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测瓜类果斑病菌的引物探针及其检测方法，属生物技术领域。
背景技术
瓜类果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害，其病原为嗜酸菌属西瓜种（Acidovorax citrulli）。瓜类果斑病菌可侵染多种葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等。自报道发生以来已在美国、澳大利亚、中国等很多国家发生，给当地的西甜瓜种植业造成了严重损失。该病菌可通过种子进行远距离传播，为我国进境植物检疫性有害生物。
健康种子是该病害防控最重要及最有效的手段，快速准确的检测技术是保证种子健康的重要措施。传统的检测技术主要包括分离培养、过敏性坏死反应、生理生化测定、免疫学检测及种植观察等。该类方法耗时长且灵敏度不高，难以满足检疫要求。分子生物学检测方法目前在该病原菌的检测中已广泛应用。Walcott等报道了利用WFB1/WFB2引物对进行PCR凝胶电泳检测的方法，该对引物扩增效率及灵敏度较高，在检测中应用比较广泛，但缺点是特异性差，不能将瓜类果斑病菌与嗜酸菌属的很多其它种区分开，容易导致假阳性结果。而且PCR电泳方法容易导致PCR产物污染，在专业的检测实验室中不太适用。胡白石等建立了该病原菌padlock探针检测技术，有效避免了PCR检测方法易受样品杂质干扰及假阳性问题，具有很高的特异性及灵敏度。实时荧光PCR技术在封闭管中进行PCR扩增及检测，具有PCR凝胶电泳技术不可比拟的优势，避免了PCR产物污染，而且具有更高的灵敏度与特异性，目前在病原菌检测中已广泛应用。在瓜类果斑病菌检测中实时荧光PCR方法报道也比较多，通过实验室实验验证比较，在特异性灵敏度及广谱性（对不同来源瓜类果斑病菌的检测）等几个指标方面难以顾全。
本研究通过比较已报道的瓜类果斑病菌的基因组与其近缘种之间的差异，找出特异性序列并设计引物探针，建立了瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测方法。本发明灵敏度高，准确性可靠，为该病害的田间监测及口岸检疫提供技术支撑。
发明内容
本发明目的在于提供用于瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测的引物探针序列及其检测方法。
本研究通过比较已报道的瓜类果斑病菌的基因组与其近缘种之间的差异，找出特异性序列并设计引物探针，筛选比较后建立了瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测方法。
所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表Seq1和Seq2所示；所述探针核苷酸序列如序列表Seq3所示，该探针一端标记有报告荧光基团。另一端标记非荧光性的淬灭基团。
本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，其以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集荧光信号，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
具体地说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，即在25μL反应体系中加入12.5μL 2×荧光PCR反应预混液，1μL引物Seq1（10μmol/L），1μL引物Seq2（10μmol/L），0.5μL TaqMan探针Seq3（10μmol/L），1μL DNA，补充超纯水至25μl
其中，上述反应条件可以是：第一个循环为95℃10min;随后40个循环,94℃15s,58℃1min。
进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
附图说明
图1是实时荧光PCR方法特异性实验结果；A:瓜类果斑病菌，B:其他对照细菌及空白对照。
图2是实时荧光PCR方法灵敏度实验结果。1：8×106CFU/μL，2：8×105CFU/μL，3：8×104CFU/μL,4：8×103CFU/μL，5：8×102CFU/μL l，6：8×101CFU/μL，7：8×100CFU/μL，8：0.8CFU/μL，9：空白对照。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1引物及探针的设计和合成
本研究通过分析已报道的瓜类果斑病菌的基因组序列，利用软件primer Express 3.0设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的引物序列为：
Seq1：5′-CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3′，
Seq2：5′-TGAGCGCATTTCTGACGAG-3′，
探针序列为：Seq3：5′-AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-3′，
该探针5′端标记报告荧光基团，3′端标记非荧光淬灭基团。
实施例2实时荧光PCR检测方法的建立
在25μL反应体系中加入12.5μL 2×荧光PCR反应预混液，1μL引物Seq1（10μmol/L），1μL引物Seq2（10μmol/L），0.5μL TaqMan探针Seq3（10μmol/L），1μL DNA，补充超纯水至25μl。将样品管放入ABI 7900荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：第一个循环为95℃10min;随后40个循环,94℃15s,58℃1min。每个循环采集荧光信号，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
实施例3实时荧光PCR方法的特异性实验
以瓜类果斑病菌及其近缘种为对象，测试该方法的特异性。所用近缘种包括了嗜酸菌属A.avenae subsp.aveane,A.avenae subsp.cattleyae,A.konjaci及其他属23株植物病原菌及10株不同来源的瓜类果斑病菌。实验中直接以浓度为106CFU/mL左右的菌液1μl为模板进行实时荧光PCR反应，结果表明所有瓜类果斑病菌株均为阳性（图1中A标识的曲线)其他的非瓜类果斑病菌（图1中B标识的曲线）均为阴性结果。证明了该方法具有较好的特异性。
实施例4实时荧光PCR方法灵敏度实验
利用平皿涂板培养计数法对液体培养至对数生长期的瓜类果斑病菌进行浓度测定，利用超纯水进行10×梯度稀释，稀释后浓度分别为8×106CFU/μl至0.8CFU/μl，分别取1μl稀释液作为模板进行实时荧光PCR灵敏度实验。检测结果如图2所示，8CFU/μl浓度以上均获得强的荧光信号（图2中1-7），故最低检测限是8CFU/μl。
实施例5对西瓜种子的检测
实验用种子为根据标准（SN/T1465-2004）检测确认的8份携带瓜类果斑病菌，4份不携带瓜类果斑病菌的西瓜种子。每份种子取100g，4℃无菌水浸泡过夜后取5ml浸泡液，10000g离心10min，取沉淀利用商业化DNA提取试剂盒提取总DNA。通过实时荧光PCR检测，携带瓜类果斑病菌的种子样品均可观察到明显的荧光信号，而不携带瓜类果斑病菌的西瓜种子及空白对照的荧光信号无明显变化，验证了该方法的可靠性，可应用到实际检测。

Claims (3)

1.一种瓜类果斑病菌检测用引物，其核苷酸序列为：
Seq1：5′-CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3′，
Seq2：5′-TGAGCGCATTTCTGACGAG-3′。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为：
Seq3：5′-AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-3′，该探针5′端标记报告荧光基团，3′端标记非荧光淬灭基团。
3.一种利用权利要求1的引物及权利要求2的探针进行瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测的方法，其特征在于实时荧光PCR反应的退火温度为58℃。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108220462A (zh) * 2018-02-02 2018-06-29 北京市农林科学院 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
CN113293235A (zh) * 2021-06-24 2021-08-24 仲恺农业工程学院 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6423499B1 (en) * 1999-09-10 2002-07-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture PCR primers for detection and identification of plant pathogenic species, subspecies, and strains of acidovorax
CN102492779A (zh) * 2011-12-30 2012-06-13 湖南农业大学 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6423499B1 (en) * 1999-09-10 2002-07-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture PCR primers for detection and identification of plant pathogenic species, subspecies, and strains of acidovorax
CN102492779A (zh) * 2011-12-30 2012-06-13 湖南农业大学 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T. ZHAO: "An improved assay for detection of Acidovorax citrulli in watermelon and melon seed", 《SEED SCI. & TECHNOL》, vol. 37, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 337 - 349 *
田艳丽: "利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌", 《江苏农业学报》, vol. 26, no. 3, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 512 - 516 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108220462A (zh) * 2018-02-02 2018-06-29 北京市农林科学院 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
CN108220462B (zh) * 2018-02-02 2022-04-05 北京市农林科学院 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
CN113293235A (zh) * 2021-06-24 2021-08-24 仲恺农业工程学院 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用
CN113293235B (zh) * 2021-06-24 2023-08-15 仲恺农业工程学院 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用

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