DE10219866A1 - Tumorprävention und Therapie durch Modifikation von "switch"-Genen oder RNA-Polymerase II-Aktivität - Google Patents
Tumorprävention und Therapie durch Modifikation von "switch"-Genen oder RNA-Polymerase II-AktivitätInfo
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Abstract
Beschrieben wird die Verwendung einer Verbindung, die die Expression eines "switch"-Gens, die Expression eines RNA-Polymerase II kodierenden Gens oder die Aktivität eines von einem "switch"-Gen kodierten Polypeptids oder von Polymerase II modifiziert, beispielsweise alpha-Amanitin, zur Tumorprävention oder Tumortherapie. Außerdem wird ein Verfahren zur Diagnose eines Tumors bzw. einer Prädisposition für einen Tumor beschrieben, das auf der Bestimmung der Expression von "switch"-Genen und/oder eines RNA-Polymerase II kodierenden Gens beruht.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung, die die Expression eines "switch"-Gens, die Expression eines RNA-Polymerase II kodierenden Gens oder die Aktivität eines von einem "switch"-Gen kodierten Polypeptids oder von RNA-Polymerase II modifiziert, beispielsweise alpha- Amanitin, zur Tumorprävention oder Tumortherapie. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Diagnose eines Tumors bzw. einer Prädisposition für einen Tumor, das auf der Bestimmung der Expression von "switch"-Genen und/oder eines RNA Polymerase II kodierenden Gens beruht.
- Bei Krebs handelt es sich um eine Erkrankung, bei der sich Zellen unkontrolliert teilen und so die normale Funktion des Körpers zerstören. Das Krebswachstum von Zellen wird durch Mutationen in Proliferationsgenen bewirkt. Proliferationsgene wurden 1997 identifiziert (Riede 1997, Cancer Genet. Cytogenet. 97, 143-145). Deren Mutation hat folgende Auswirkungen: (a) Veränderungen in der Chromatinstruktur, was z. B. anhand einer defizienten somatischen Paarung eines bestimmten Chromosomen- Bereichs sichtbar wird (Riede, 1997), (b) Veränderungen in der Rekombinationshäufigkeit, d. h. entweder Erhöhung der Rekombinationshäufigkeit in einem bestimmten Chromosomen- Bereich oder Erniedrigung der Rekombinationshäufigkeit in einem anderen Chromosomen-Bereich (Riede, 1997), (c) Veränderungen hinsichtlich der DNA-Reparatur-Antwort, (d) Veränderungen hinsichtlich der Replikation, die z. B. anhand der Polytänisierung der DNA in Zellzyklus-restringierten Zellen sichtbar sind (Riede, 1997), (e) Fehlen einer G1-Phase, (f) Resistenz gegenüber Chemotherapie (Riede, 2000, DIS 83, 112), (g) Genom-Instabilität (Riede, 1998, Cancer Detection and Prevention 22: S61), und (h) Zelltot-Defizienzen. Die Auswirkungen von Mutationen in Proliferationsgenen können durch mutierte Oncogene oder Tumorsuppressorgene verstärkt oder gehemmt werden. In Krebszellen bestimmen die kombinierten Wirkungen von mutierten Oncogenen, Tumorsuppressorgenen und Proliferationsgenen somit das Schicksal einer Zelle und die Malignität einer Erkrankung (Riede, 2001, DIS 84, 103). Allerdings sind die bisher zur Verfügung stehenden therapeutischen Möglichkeiten, diese kombinierten Wirkungen zur Tumorprävention bzw. Therapie zu beeinflussen, z. B. durch gentherapeutische Maßnahmen oder Immuntherapie äußerst begrenzt.
- Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, das eine wirksame Krebstherapie erlaubt.
- Die Lösung dieses technischen Problems erfolgte durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. Bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten wurde überraschenderweise gefunden, dass "switch"-Gene, d. h. Gene, die Transkriptionsfaktoren für RNA- Polymerase II kodieren, an der Tumorentwicklung beteiligt sind, d. h. deren Expression ist in Tumoren verändert, d. h. meistens erhöht. Somit können "switch"-Gene bzw. Zellen oder Tiere mit mutierten "switch"-Genen zur Entwicklung einer Tumortherapie, zur Tumor-Diagnose sowie zur Therapie selbst, z. B. einer Chemotherapie oder Immuntherapie, von Nutzen sein. So kann z. B. die Bestimmung der Expression von "switch"-Genen (sowohl qualitativ als auch quantitativ) hinsichtlich der Beurteilung einer möglichen Tumorerkrankung bzw. einer Prädisposition oder der Durchführung einer geeigneten Therapie von entscheidender Bedeutung sein. Als Therapien bieten sich die Modifizierung der "switch"-Genexpression oder der Expression eines RNA-Polymerase II kodierenden Gens oder der Aktivität der entsprechenden Proteine zur Beeinflussung des Tumorwachstums einer Zelle an. So kann die Modifizierung der Wirkung der "switch"-Genproteine durch Interferenz mit der Chromatinstruktur die Replikation entweder direkt fördern oder beenden, oder den Zugang zu Replikationsstartpunkten öffnen oder schließen. Die Modifizierung der Wirkung der "switch"-Genproteine oder von RNA-Polymerase II selbst kann z. B. durch gentherapeutische Maßnahmen oder durch Vergiftung der beteiligten Enzyme erfolgen. Dies konnte am Beispiel von alpha-Amantin gezeigt werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung einer Verbindung, die die Expression eines "switch"-Gens, die Expression eines RNA-Polymerase II kodierenden Gens oder die Aktivität eines von einem "switch"-Gen kodierten Polypeptids oder von RNA-Polymerase II modifiziert, vorzugsweise hemmt, zur Tumorprävention oder Tumortherapie.
- Der hier verwendete Begriff "switch"-Gen bezieht sich auf Gene, die Transkriptionsfaktoren für RNA-Polymerase II kodieren. Switch-Gene beeinflussen die Chromatinstruktur. Beispiele für "switch-Gene" und Verfahren zur Beeinflussung deren Expression bzw. der Aktivität/Spezifität der davon kodierten Polypeptide sind dem Fachmann bekannt. Im Menschen wurden inzwischen über 100 Transkriptionsfaktoren für RNA-Polymerase II identifiziert und dazu zählen z. B. maternale Faktoren oder "gap"-Gene wie z. B. dJ29K1.2 bei 6p21.3-22.2, "Hox"-Gene wie z. B. HoxA1, HoxA3, HoxA7 (am Chromosomenbereich 7p15), HoxB3, HoxB5, HoxB6 (am Chromosomenbereich 17q21), AES, TLE1-4 (bei 19p13) oder SP- 1 (bei 12q13). "Switch"-Gene zeichnen sich vorzugsweise dadurch aus, dass sie mit Proliferationsgenen interferieren und (a) die Rekombinationshäufigkeit verändern, d. h. entweder die Rekombinationshäufigkeit an einem bestimmten Chromosomenbereich erhöhen oder diese an einem anderen Chromosomenbereich erniedrigen, (b) die DNA-Reparatur-Antwort verändern, (c) die Replikation beeinflussen, (d) eine Veränderung der Chemotherapie-Resistenz bzw. des Sensitivitätsmusters bewirken können, (e) die Genomstabilität verändern, (f) die Zelltot- Antwort verändern und/oder (g) das Tumorwachstum von Zellen erhöhen oder erniedrigen. Da "switch"-Gene mit Oncogenen und Tumorsuppressorgenen interferieren und das Differenzierungsmuster von Zellen ändern, ist offensichtlich, dass die Manipulation von "switch"-Genen zur Prävention oder Therapie von Tumoren von Nutzen ist, was sich auch aus den nachstehenden Beispielen 1 und 2 ergibt. Die Manipulation der Expression von "switch"-Genen oder der Aktivität/Spezifität der davon kodierten Proteine führt darüber hinaus zu einer Veränderung der vorstehend diskutierten Zellmerkmale und kann für eine Reihe von weiteren Anwendungen neben der Tumortherapie von Nutzen sein.
- Die Möglichkeit der Modifizierung, vorzugsweise Inaktivierung, eines "switch"-Gens oder RNA-Pol.II-Gens bzw. des entsprechenden Proteins ist bei der Therapie oder Prävention von Tumoren sinnvoll, die mit einer veränderten, vorzugsweise zu hohen Aktivität eines "switch"-Gen-Transkriptionsfaktors oder einer zu hohen Expression der von diesem kontrollierten Gene einhergehen. Eine solche Modifizierung kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen, beispielsweise auf genetischer Ebene (Einschleusen eines Wildtyp-Gens (oder der entsprechenden mRNA) oder eines Gens, das einen modifizierten Transkriptionsfaktor kodiert, "Knock out", Veränderung einer Homeobox-Aktivität oder Spezifität, Veränderung der Promotorverwendung oder Promotoraktivität, Veränderung der transkriptionellen Aktivität, Veränderung der translationalen Aktivität, z. B. Hemmung der Translation durch Antisense-RNAs oder Ribozyme, Veränderung des Spleiß-Musters, Veränderung der Termination der mRNA-Transkription, Veränderung des entwicklungsabhängigen Profils der Expression, Manipulation von stromaufwärts gelegenen Genen, die mit Transkriptionsfaktoren für RNA-Polymerase II interagieren, z. B. mittels homöopathischer oder isopathischer Wirkstoffe, etc) oder auf Proteinebene (z. B. über Veränderung der Proteinaktivität oder Spezifitität, z. B. über geeignete Liganden, beispielsweise Antikörper oder Antagonisten, Veränderung der Bindung der Transkriptionsfaktoren an Pol II, z. B. mittels Liganden oder Hitzeschock oder Kälteschock etc.).
- Für die Modifizierung der Aktivität des "switch"-Genproteins geeignete Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und diese umfassen beispielsweise hemmende, aktivierende oder neutralisierende Antikörper, die an das Protein binden, oder hemmende, aktivierende bzw. neutralisierende Peptide. Die Modulatoren der "switch"-Genproteine etc. können auch mittels Verfahren, die in der Pharmazie gut bekannt sind, entworfen oder hergestellt werden, dazu gehören kombinatorische Verfahren und "rational drug design"-Verfahren.
- Die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise von Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167. Die Methodik der kombinatorischen Chemie kann dazu verwendet werden, eine riesige Anzahl von Oligonukleotiden oder Peptiden zu erzeugen, die hinsichtlich spezifischer Oligonukleotide oder Peptide, die geeignete Bindungsaffinitäten besitzen, sehr schnell gescreent werden können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die "switch"-Genproteine, können dabei genutzt werden (siehe für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581-13584).
- "Rational drug design" beinhaltet einen integrierten Satz an Methoden, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen, synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren, beispielsweise Antagonisten/Inhibitoren, besteht das Ziel von "rational drug design" in einem Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie eines Moleküls.
- "Rational drug design" wird unterstützt von Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR bestimmt werden können. Hilfreich sind auch Berechnungen hinsichtlich elektrostatischer Eigenschaften, Hydrophobizitäten und der Lösungsmittelzugänglichkeit. Siehe beispielsweise Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6635-6640.
- Ein besonders nützliches Verfahren zur Bestimmung von Protein/Protein-Interaktionen und zur Identifizierung von Modulatoren der Aktivität von "switch"-Genproteinen ist außerdem das "two hybrid screen"-Verfahren von Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 9578; siehe auch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Berger und Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. (1987); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997)). Durch dieses Screenen können Protein/Protein-Interaktionen in vivo durch Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators, dem Hefe- Gal4-Transkriptionsprotein identifiziert werden (siehe Fields und Song, Nature 340 (1989), 245). Dieses Verfahren basiert auf den Eigenschaften des Hefe-Gal4-Proteins, das aus trennbaren Domänen besteht, die für die DNA-Bindung und transkriptionelle Aktivierung verantwortlich sind.
- Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann auch die Expression eines "switch"-Gens modifiziert, vorzugsweise verringert werden. In diesem Zusammenhang umfaßt der Begriff "Verbindung, die die Expression eines "switch"-Gens modifiziert" auch ein modifiziertes "switch"-Gen selbst, das z. B. nach Einbringen in einen Patienten, z. B. als Insertion auf einem für eine Gentherapie geeigneten Vektor, nach Rekombination mit dem "switch"-Gen des Patienten zu einer veränderten Expression führt. Der Fachmann kennt weitere geeignete Techniken zur Beeinflussung der Expression eines "switch"-Gens wie z. B. die Verabreichung von spezifischen "antisense"-Oligonukleotiden, PNAs ("antisense"-Peptidnukleinsäuren), Triplex-bildenden Oligonukleotiden etc. Vorzugsweise sind diese antisense-RNAs und Ribozyme zu einer kodierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den bekannten "switch"-Gen-Sequenzen, geeignete antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB-B1 0 223 399 oder EP-A1 0 458 beschrieben.
- Die vorstehend diskutierten "switch"-Gen-Sequenzen bzw. die antisense-RNAs, Ribozyme etc. kodierenden DNAs können direkt appliziert werden oder auch mittels eines Vektors, vorzugsweise eines Expressionsvektors. Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die diese DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.
- Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Vaccinia-Virus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für die Gentherapie geeignete Vektoren sind außerdem in WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 und WO 92/06180 offenbart. Für Zwecke der Gentherapie können die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Diese Gentherapie kann sowohl für die Erhöhung der Aktivität eines "switch"-Gen- Transkriptionsfaktors (beispielsweise mit einem Expressionsvektor, der das "switch"-Gen enthält) als auch für eine Verringerung der Aktivität (mit einem Vektor, der ein Gen für ein Ribozym, eine antisense-RNA oder eine inaktive Form des Transkriptionsfaktors ("knock-out") enthält) Anwendung finden.
- Die vorstehenden Maßnahmen hinsichtlich der Tumorprävention bzw. Tumortherapie auf molekularem Niveau können sich aber auch auf RNA-Polymerase II selbst, d. h. die Beeinflussung deren Expression bzw. Aktivität beziehen, da alle "switch"-Gene in dem Prozess der Tumorbildung über das Enzym RNA-Polymerase II wirken. Die Aktivität von RNA-Polymerase II kann z. B. auch durch chemotherapeutische Wirkstoffe, z. B. alpha-Amanitin oder homöopathische Wirkstoffe, z. B. Agaricus phallidum, verändert, z. B. gehemmt werden.
- Für die erfindungsgemäße Verwendung sind "switch"-Gene bevorzugt, die einen TATAA-bindenden Transkriptionsfaktor kodieren, und dazu zählen z. B. Antennapedia und Ultrabithorax- Homologe humane Gene wie gi: 233573 (Baier et al., Blood 78, 1991 (1047)) HoxA7 und andere Hox-Gene (Scott, Cell 71 (1992) 551, Bucan et al. EMBO J. 5 (1986) 2899, Rabin et al. PNAS 83 (1986) 9104, Ferguson-Smith et al. Genomics 5 (1989) 250)
- Schließlich kann eine Tumorprävention oder Therapie mittels einer Isotherapie erfolgen. In einem Organismus kommunizieren Zellen, darunter auch Tumorzellen, miteinander. Bei einem fortgeschrittenen malignen Prozess haben die Tumorzellen ihre Fähigkeit auf solche Signale reagieren zu können, verloren. Somit handelt es sich bei der Tumorbildung um einen sehr komplexen Prozess, der nicht nur einige Tumorzellen betrifft, sondern den gesamten Organismus. Bei homöopathischen Therapieansätzen, insbesondere bei einer Isotherapie, wird dem Organismus ein Signal gegeben und diese Information führt in einem regulatorischen Prozess zu einer Reaktion des Organismus hinsichtlich einer Gegensteuerung zu dem malignen Krankheitsprozess. In der klassischen Medizin wir dieser Prozess Immunisierung genannt, wobei allerdings festzuhalten ist, dass das isotherapeutische Konzept auch Prozesse umfaßt, die nicht anhand von Antikörperreaktionen bestimmt werden können.
- Somit betrifft eine weitere besonders bevorzugte Verwendung die Verwendung eines homöopathischen oder isopathischen Wirkstoffs zur Tumorprävention bzw. Tumortherapie.
- Bei Verabreichung der vorstehend diskutierten Verbindungen an einen Patienten werden diese gegebenenfalls mit einen pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium des Tumors, der Art der Verabreichung etc.
- Die Quantifizierung der Genexpression oder Bestimmung qualitativer Unterschiede hinsichtlich der Expression der "switch"-Gene bzw. der RNA-Polymerase II selbst kodierenden Gene ist für die Diagnose eines Tumors oder einer entsprechenden Prädisposition von Nutzen, aber auch für die Entwicklung von Therapiekonzepten und die Überwachung der Wirkung von Wirkstoffen. "Switch"-Gene werden üblicherweise in unterschiedlicher Quantität oder Qualität transkribiert, und von verschiedenen Promotoren exprimiert, häufig zeigen sie auch Spleiß-Variationen und gelegentlich auch unterschiedliche Terminationsmöglichkeiten. Somit ist die Bestimmung von Unterschieden hinsichtlich eines oder mehrerer der vorstehenden Parameter für eine Diagnose hinsichtlich eines Tumors oder einer Prädisposition für einen Tumor von Nutzen.
- Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose eines Tumors oder einer Prädisposition für einen Tumor, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Entnahme einer Probe von dem Patienten; und
- b) Bestimmung der Expression oder Aktivität eines oder mehrerer "switch"-Gene und/oder eines RNA-Polymerase II kodierenden Gens in der Probe,
- Die Quantifizierung der Genexpression oder die Bestimmung qualitativer Unterschiede der Genexpression, z. B. hinsichtlich Spleiß- oder Promotor-Variationen, Verwendung unterschiedlicher Terminationssignale etc. kann mittels molekularbiologischer Routineverfahren auf verschiedenen Ebenen erfolgen, z. B. auf Nukleinsäure-Ebene. Durch Verwendung entsprechender DNA-Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, z. B. festgestellt werden, ob sie ein verändertes Gen enthalten, das zu einer mutierten Form des Proteins führt, die nicht länger biologisch aktiv ist, oder ob beispielsweise der Transkriptionsfaktor oder RNA-Polymerase II zu gering oder zu stark exprimiert werden. Geeignete, z. B. auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt, z. B. Southern Blot oder Northern Blot. Geeignete Markierungen für die Sonden sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkern, Metallchelaten, Enzymen etc.. Darüber hinaus kann ein Nachweis auch durch eine PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder "Ligase chain reaction" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, S. 24-29 (1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen, wobei die Primer von "switch"-Gen- oder RNA- Pol. II-Gensequenzen abgeleitet sind und wobei geeignete Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matrize, dem zu amplifizierenden Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden können. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Amplifikationsprodukte von DNA oder RNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich hinsichtlich des Auftretens von spezifischen Banden von den Amplifikationsprodukten von DNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.
- Bei den oben genannte Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispielsweise über Southern-Blot oder in-situ Hybridisierung, angewandt werden.
- Alternativ kann eine Diagnose auch auf Protein-Ebene erfolgen, z. B. mittels eines Verfahrens, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
- b) Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit einem spezifischen Liganden, vorzugsweise einem Antikörper, als Sonde unter Bedingungen, die die Bindung des Liganden erlauben.
- Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlauben, dass dieses mit dem Liganden, z. B. Antikörper, in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis eines gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispielsweise Western-Blot, ELISA, FACS oder RIA oder immunhistochemische Verfahren. Weiter eignen sich die Antikörper auch dafür, um in Tumoren überexprimiertes "switch"- Genprotein abzufangen und so das Tumorwachstum zu hemmen.
- Schließlich kann für das erfindungsgemäße diagnostische verfahren auch die funktionelle Aktivität eines Genprodukts, d. h. eines "switch"-Genproteins oder von RNA-Polymerase II bestimmt werden, z. B. mittels eines enzymatischen Tests.
- Die Vorstehenden Diagnoseverfahren eignen sich nicht nur zur Diagnose eines Tumors oder Frühdiagnose eine präkanzerösen Ereignisses sondern darüber hinaus auch zur Differentialdiagnose eines Tumors, zur Auswahl einer optimalen Therapie und zur Überwachung der Wirkung verabreichter Arzneimittel.
- Tiere oder Zellen, die mutierte "switch"-Gene und/oder RNA- Polymerase II-Gene enthalten oder mutierte Gene, die das Expressionsmuster von "switch"-Genen verändern, können zur Entwicklung von Tumordiagnoseverfahren und/oder Verfahren/Wirkstoffen für eine Tumortherapie verwendet werden.
- Nachstehend werden einige Beispiele im Drosophila-Modell beschrieben, die u. a. zeigen, dass bestimmte Mutationen bzw. bestimmte Kombinationen von Mutationen zur Tumorbildung führen, somit z. B. Drosophila zur Untersuchung des Wirkungsspektrums von "switch"-Genen für RNA-Polymerase II-Transkriptionsfaktoren bzw. RNA-Polymerase II selbst geeignet ist.
- Antp[Aus9] ist unter Hitzeschockbedingungen hinsichtlich eines malignen Hirntumors lethal, d. h. modifiziertes Antp führt zum Tod von Tumorzellen. Mit einem malignen Hirntumor gekreuztes Antp[Aus9] ist bei 29°C lethal. Drosophila-Antp ist homolog zu humanem HoxA7 und HoxB5 an den Chromosomenbereichen 7p15 bzw. 17q21. Die Mutation von Antp stellt ein präkanzeröses Ereignis dar. Eine zusätzliche Mutation in einer spontan mutierten Antp- Zelle (entweder eine Oncogen-Mutation, eine Tumorsuppressorgen- Mutation oder eine zusätzliche Mutation in einem Proliferationsgen) führt zur Tumorbildung. Eine Mutation in Antp ist gelegentlich proliferativ und hemmt die Paarung und Rekombination in Chromosomenbereichen. Die Modifikation der Antp-Transkription, des Spleißens etc. kann die Befähigung zur Replikation in Tumorzellen durch unterschiedliches Chromatin- "Imprinting" beeinflussen.
- Modifiziertes gro führt zum Tod von Tumorzellen. gro[E75] ist in Verbindung mit malignem Hirntumor lethal, d. h. modifiziertes gro bewirkt den Tod von Tumorzellen, gro ist homolog zu humanem AES, TLE1-4 bei dem Chromosomenbereich 19p13.3.
- Modifiziertes Ubx (ein RNA-Polymerase II-Transkriptionsfaktor) ist für präkanzeröse und kanzeröse Stadien lethal. Ubx[C1] ist lethal in Kombination mit srn[88], wobei srn ein weiterer RNA- Polymerase II-Transkriptionsfaktor ist. srn- und Ubx-Mutationen sind gelegentlich proliferativ. Beide Gene können Mutationen tragen, die zu einer modifizierten Chromatin-Struktur führen. Eine modifizierte Chromatin-Struktur führt wiederum zu einer modifizierten Fähigkeit des Chromosoms zur Paarung oder Rekombination. Eine modifizierte Chromatinstruktur beeinflußt die Replikation und den Tod von Tumorzellen. UbxC1 ist lethal in Kombination mit Antp[Aus9], wobei Antp ein weiterer RNA- Polymerase II-Transkriptionsfaktor ist. srn[88] ist lethal in Kombination mit weiteren Proliferationsgenen. Ubx ist homolog zu humanem HoxA7, HoxB5, HoxB6 und HoxA9 bei den Chromosomenbereichen 7p15 und 17q21. Die modifizierte Wirkung von Ubx kann zur Hemmung des Tumorwachstums von Zellen führen.
- Modifiziertes srn blockiert die Wirkung von Tumorsuppressorgenen und Oncogenen. tld konnte in Fliegen als Tumorsuppressorgen identifiziert werden. srn[88] ist in Kombination mit tld[6P41] lethal. TI konnte in Fliegen als Oncogen identifiziert werden. srn[88] ist lethal in Kombination mit TI[r444]. Die modifizierte Wirkung von srn blockiert Oncogene und Mutationen in Tumorsuppressorgenen in Tumorzellen und kann das Tumorwachstum von Zellen hemmen.
- Modifiziertes srn hemmt die Proliferation. srn[88] ist lethal in Kombination mit Antp[Aus9]. Die modifizierte Wirkung von srn kann das Tumorwachstum von Zellen hemmen.
- Modifiziertes Antp hemmt die Proliferation. Antp[Aus9] ist lethal in Kombination mit srn[88]. Die modifizierte Wirkung von Antp kann das Tumorwachstum von Zellen hemmen.
- bcd ist ebenfalls ein RNA-Polymerase II-Transkriptionsfaktor. Modifiziertes bcd unterdrückt Tumorwachstum. Die bcd-Mutation in Kombination mit der dlg-Mutation unterdrückt Tumorwachstum. Eine Mutation von bcd kann gelegentlich die Chromatinstruktur so modulieren, dass die Befähigung der Chromosomen zur Paarung und/oder Rekombination verändert wird. Die Modifikation der bcd-Expression kann Tumorwachstum von Zellen unterdrücken. Modifiziertes bcd hemmt die Proliferation. Die bcd-Mutation ist in Kombination mit srn[88] lethal.
- Somit betrifft die vorliegende Erfindung schließlich auch Zellen und mutierte bzw. transgene Tiere, vorzugsweise Säuger, die bezüglich eines modifizierten "switch"-Gens, RNA-Polymerase II kodierenden Gens oder eines Gens, das das Expressionsmuster von "switch"-Genen und/oder RNA-Polymerase II-Genen verändert, mutiert bzw. transgen sind, sowie die Verwendung dieser Zellen/Tiere zur Entwicklung von Tumortherapieverfahren oder Wirkstoffen zur Tumortherapie. Verfahren zur Herstellung transgener Tiere sind beispielsweise in WO 91/08216 beschrieben.
- Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
- Für diese Studien wurden Drosophila melanogaster verwendet, die durch bestimmte Mutationen charakterisiert waren, die Tumorwachstum auslösen. Dabei wurden Tiere mit folgenden Mutationen verwendet:
- a) fat[GD]/fat[GD]; homozygot für Mutation in fat, 2. Chromosom, Ausbildung eines Gehirntumors, Lethalität als L3 (= larvales Stadium 3), "Tumor"-Zustand.
- b) fat[GD]/SM1; heterozygot für Mutation in fat über Balancer für 2. Chromosom, lebensfähig als Adulte, "Disposition zu Tumor"-Zustand.
- c) efe[89]e/efe[89]e; homozygot für proliferative Mutation in efe auf dem dritten Chromosom, Ausbildung von melanotischen Tumoren, Lethalität als L3, "Tumor"-Zustand.
- d) efe[89]e/TM3; heterozygot für Mutation in efe über Balancer für das 3. Chromosom, lebensfähig als Adulte, "Disposition zu Tumor"-Zustand.
- e) e/e; Wildtyp in Bezug auf "Tumor"-Zustand, lebensfähig als Adulte.
- Die Mutagenese zur Erzeugung der Tiere erfolgte wie in Riede, 1997, beschrieben.
- An diesen Tieren wurde alpha-Amanitin, ein Hemmstoff für RNA- Polymerase II getestet, das im grünen Knollenblätterpilz (Amanita phalloides) enthalten ist. Es wurde ein Extrakt dieses Pilzes in einer Verdünnung von 1 : 10.000 verwendet [Agaricus phalloides D4 der DHU Karlsruhe, Ch.-B. 0201250334]. Diese Verdünnung wurde im Verhältnis 1 : 100 in das Drosophila- Standardmedium verbracht, was einer Konzentration von 1010 Molekülen pro ml Medium entspricht. Die Elterngeneration wurde für vier Tage auf Standardmedium mit oder ohne alpha-Amanitin belassen. Die hinsichtlich der F1-Generation erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Es zeigte sich, dass alpha-Amanitin das Wachstum von "Tumor"-Zustand und von "Disposition zu Tumor"-Zustand im lebenden System beeinflussen kann: Die Proliferation von Tumorzellen wird stark gehemmt. Tabelle 1
- Es wurden wie in Beispiel 1 beschrieben verschiedene genetische Zustände erzeugt, die Tumorwachstum hervorrufen. Es wurden Mutationen verwendet:
- a) Antp[Aus9]; Mutation in Antennapedia.
- b) MBT-III; multigen mutiertes 3. Chromosom, Gehirntumor im homozygoten Zustand, lethal.
- c) fat[GD]; Tumormutation in fat, 2. Chromosom, Gehirntumor im homozygoten Zustand, lethal.
- d) dlg[1]; Tumormutation in dlg, 1. Chromosom, Gehirntumor im homozygoten Zustand, lethal.
- e) +; Wildtyp.
- Die Mutationen wurden übereinandergekreuzt wie in Riede, 1997, beschrieben und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
- Die Ergebnisse zeigen, dass sich mit dem "switch"-Gen Antennapedia in trans Tumormutationen beeinflussen lassen. Durch Hinzufügen einer Kopie eines defekten Antennapedia-Gens kann ein genetisch bedingter Tumor verhindert werden. Die dargestellte Lethalität der Genkombinationen sagt aus, daß die Beeinflussung des Tumorwachstums dominant erfolgt, daß es also genügend ist, die Quantität von Antennapedia zu verändern.
- Die im Experiment eingesetzte Mutation von Antennapedia [Aus 9] beeinflußt die Chromosomenstruktur, die somatische Paarung und die Rekombinationshäufigkeit von Chromosomenabschnitten.
- Die vorstehend aufgeführten Mutationen hinsichtlich DLG, MBT, FAT und deren Erzeugung sind beschrieben in Gateffet al., Mech. Develop. 41 81993), 15-31; Woods und Bryant, Develop. Biol. 134 (1989), 222-235; Woods und Bryant, Cell 66 (1991), 451-464; Mahoney et al., Cell 65 (1991), 853-868; Gateff, Int. J. Dev. Biol. 38 (1994), 565-590; Riede, Cancer Genet. Cytogenet. 90 (1996), 135-141. (Riede 1997, Riede 2001)
Claims (10)
1. Verwendung einer Verbindung, die die Expression eines
"switch"-Gens, die Expression eines RNA-Polymerase II
kodierenden Gens oder die Aktivität eines von einem "switch"-
Gen kodierten Polypeptids oder von RNA-Polymerase II
modifiziert, zur Tumorprävention oder Tumortherapie.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Modifikation eine
Hemmung ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das "switch"-Gen
einen TATAA-bindenden Transkriptionsfaktor kodiert das humane
Homologe zu Antennapedia, Ultrabithorax oder Stern ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Transkriptionsfaktor
das humane Homologe zu Antennapedia, Ultrabithorax oder Stern
ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die
Verbindung alpha-Aminitin ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
Verbindung ein homöopathischer oder isopathischer Wirkstoff ist.
7. Verfahren zur Diagnose eines Tumors oder einer
Prädisposition für einen Tumor, das folgende Schritte umfaßt:
wobei eine veränderte Expression oder Aktivität im Vergleich zu
einer Kontrollprobe ein Anzeichen für einen Tumor oder eine
Prädisposition für einen Tumor ist.
a) Entnahme einer Probe von dem Patienten; und
b) Bestimmung der Expression oder Aktivität eines oder
mehrerer "switch"-Gene und/oder eines RNA-Polymerase II
kodierenden Gens oder Proteins in der Probe,
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Bestimmung der
Expression mittels PCR oder Northern-Blotting erfolgt.
9. Zelle oder mutiertes bzw. transgenes Tier, die (das)
bezüglich eines modifizierten "switch"-Gens, RNA-Polymerase II
kodierenden Gens oder eines Gens, das das Expressionsmuster
eines "switch"-Gens und/oder RNA-Polymerase II-Gens verändert,
mutiert bzw. transgen ist.
10. Verwendung der Zelle oder des mutierten bzw. transgenen
Tiers gemäß Anspruch 9 zur Entwicklung von
Tumortherapieverfahren oder Wirkstoffen zur Tumortherapie.
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| DE (1) | DE10219866A1 (de) |
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