CN112080557A - 一种基于dna条形码的冬虫夏草产地鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，包括以下步骤：广泛采集来自不同产地冬虫夏草样品；对冬虫夏草样品进行基因组DNA提取，扩增冬虫夏草ITS和寄主昆虫的COI序列并测序；比对校正后的ITS和COI序列先分别进行单倍型分析，再进行组合分析；根据单倍型分析的结果构建冬虫夏草产地鉴定数据库；将产地未知冬虫夏草样品，经DNA提取扩增测序分析后，将其单倍型输入冬虫夏草产地鉴定数据库，对冬虫夏草产地信息进行判断。本发明通过利用不同产地冬虫夏草菌和寄主的序列差异，分别对冬虫夏草真菌的ITS和寄主昆虫的COI进行单倍型分析，建立不同产地冬虫夏草的产地鉴别数据库，可快速区分冬虫夏草的产地来源。

Description

一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法
技术领域
本发明属于物种产地鉴定，具体涉及一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法。
背景技术
冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]是分布在青藏高原及其周边地区的一种重要的珍稀中药和高级滋补品，由真菌侵染鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)部分昆虫的地下幼虫形成，含有丰富的生理活性物质，其性温，味甘，具益肺肾，补精髓，止血化痰的功效。现代医学研究证实冬虫夏草的次级代谢产物如核苷类化合物、多糖、甾醇类化合物等可作用于人体免疫、心血管、呼吸、泌尿生殖、内分泌、神经等系统，具有治疗肝肾损伤和肺部炎症、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等多种药理作用。
由于滋补功效显著，冬虫夏草逐渐成为一种经济价值很高的名贵食材，近 20年其价格疯涨，2015年顶级冬虫夏草价格更是飙升到每公斤20万至38万元。采挖冬虫夏草成为产地农牧民的主要经济收入来源之一。
冬虫夏草的品质与青藏高原自然环境密切相关，真菌、昆虫、气候、土壤、植物等因素都会影响冬虫夏草的质量，不同产地的冬虫夏草品质存在较大的差异，因此价格也相差较大，核心产区西藏那曲、青海玉树等地的虫草品质较好，价格相对较高。受利益驱使，部分商家混淆冬虫夏草产地，以次充好，扰乱了正常市场秩序。但冬虫夏草的产地信息很难从外观上进行判别，开发快速、准确的冬虫夏草产地溯源方法有利规范冬虫夏草市场，维护消费者利益。
目前，农产品产地鉴定方法多采用同位素标记和多元素方法，这些方法需要充分的本底数据，且鉴定成本高，周期长。所以，亟需一种低成本，快速的产地鉴定方法。
发明内容
发明目的：针对冬虫夏草产地鉴定的困难，本发明的目的是提供一种基于 DNA条形码的冬虫夏草产地快速鉴定方法，通过利用不同产地冬虫夏草的序列中碱基差异，分别对冬虫夏草真菌和寄主昆虫进行单倍型分析，建立不同产地冬虫夏草的产地鉴定数据库，以区分不同冬虫夏草的产地来源。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，包括以下步骤：
(1)广泛采集来自不同产地的冬虫夏草样品；
(2)对冬虫夏草样品进行基因组DNA提取；
(3)以基因组DNA为模板，分别扩增真菌标准条形码ITS(核基因组核糖体DNA转录间隔区)和昆虫标准条形码COI(细胞色素C氧化酶I)序列，并进行双向测序；
(4)测序后得到的序列，比对校正后，根据序列中碱基差异分别进行ITS 和COI的单倍型(haplotype)分析，并将冬虫夏草菌和寄主的ITS和COI的单倍型进行组合；
(5)根据组合的单倍型的种类和分析结果，构建冬虫夏草产地鉴定数据库；
(6)采用步骤(2)-(5)相同的处理方法，将未知产地信息的产地冬虫夏草样品，经DNA提取、扩增测序分析后，将其ITS和COI的单倍型输入冬虫夏草产地数据库，对冬虫夏草产地进行判断。
其中，步骤(1)中采集的冬虫夏草样品来源于不同的产区，采集样品时详细记录了样品采集地点、经纬度、海拔等信息，并编号、封装备用。本发明中的样品共计228份，这些标本分别于2000年6月-2018年6月采自中国青藏高原地区，样品共涉及甘肃的玛曲、夏河、文县和民乐4个县，青海的玛沁、祁连、天峻、互助、共和等13个县，四川的小金、白玉、色达、红原、壤塘等12个县，西藏的波密、林芝、错那、比如、巴青等47个县和云南的德钦和玉龙2个县，基本涵盖了冬虫夏草主要分布区和产区。其中，步骤(2)中采用CTAB法对冬虫夏草样品进行基因组DNA提取。
其中，步骤(3)中所述真菌标准条形码ITS扩增和测序使用的引物分别为 ITS5和ITS4，其中ITS5的核苷酸序列为SEQ ID NO.1： 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，ITS4的核苷酸序列为SEQ ID NO.2： 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
其中，步骤(3)中所述昆虫标准条形码COI扩增和测序使用的引物分别为 BI1834和TH2928，其中BI1834的核苷酸序列为SEQ ID NO.3： 5’-TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，TH2928的核苷酸序列为SEQ ID NO.4： 5’-AATACTGCTCCTATAGATAG-3’。
其中，步骤(3)中所述扩增的PCR反应试剂选用2×Taq Plus MasterMix；扩增的PCR反应体系总体积为25μL，该反应体系包含2×Taq Plus MasterMix 12.5 μL，10μmol/L引物各0.4μL，加入DNA模板0.5μL，其余体积用双蒸水补足。
其中，步骤(3)中ITS片段的PCR扩增反应过程为：94℃预变性7min， 94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min； COI片段的PCR扩增反应过程为：94℃预变性2min，95℃变性30s，45℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环，72℃延伸10min。
其中，步骤(4)中测序后得到的序列，采用BioEdit软件比对校正，比对校正后(校正以双向测序的原始峰图为依据)，根据序列中碱基差异采用DAMBE 软件进行单倍型分析(单个碱基的差异即视为不同的单倍型)，将冬虫夏草真菌和寄主的ITS和COI单倍型进行组合。
其中，步骤(5)中将ITS得到单倍型与COI得到单倍型组合后构建产地冬虫夏草鉴定数据库。本发明数据库中ITS共得到33个单倍型，COI共得到86个单倍型，将两者组合后共得到111个单倍型。
冬虫夏草由冬虫夏草真菌和寄主昆虫组成，由于其独特的生长特性，可分别对真菌和寄主昆虫进行测序，采用DNA条形码分别对冬虫夏草真菌和寄主昆虫分别进行扩增和测序，本发明通过结合两者的单倍型进行产地鉴定，可大大提高区分度。DNA条形码通过对标准化的、长度较短的DNA片段进行序列分析，完成物种鉴定，是简单且成本效益高的物种识别方法，目前仅被应用于物种鉴定领域，本发明是第一次将DNA条形码技术应用于物种的产地识别。
本发明从冬虫夏草中同时扩增出冬虫夏草真菌ITS及其寄主的COI序列，且不同产地的冬虫夏草ITS及COI存在遗传多样性，而同一片区域序列相对保守，因此ITS和COI可用于冬虫夏草产地的区分，两者结合区分效率更高。
本发明的鉴定方法通过提取不同产地的冬虫夏草基因组DNA，分别对冬虫夏草真菌和寄主昆虫进行测序，通过不同产地的冬虫夏草序列碱基差异进行单倍型分析，结合真菌和寄主昆虫的单倍型种类建立数据库，然后提取未知产地的冬虫夏草基因组DNA进行测序，得到的单倍型通过对比数据库判定其产地。
本发明在全面取样的基础上首先建立产地鉴定数据库(所有样品产地信息明确可靠)，再采用ITS和COI单倍型分析结合的方法(不同产地ITS和COI存在差异，而同一产地序列相对保守)，提高区分度，拟鉴定的样品经ITS和COI扩增测序后与数据库比对，相同的单倍型可视为来源于共同的产地。
本发明扩增结果为每个冬虫夏草样品的真菌序列和寄主昆虫序列，其中真菌的序列用ITS片段进行的扩增，寄主昆虫序列用COI片段进行的扩增。由于生命历程的特殊性，冬虫夏草通过完成两部分的测序，准确判定其产地。本发明中只用一种比如ITS，只有33个单倍型，理论上只能区分出33个产区，用COI 只能区分86个产区，两者合用可区分111个，区分度更高。
本发明的产地鉴定方法重点在于对冬虫夏草菌和寄主昆虫分别进行扩增和双向测序后续的分析，产地鉴定是深入分析多个冬虫夏草样品的真菌和寄主昆虫序列差异，再将所有样品信息汇总到一起，通过序列校正、比对，通过序列中碱基差异实现单倍型分析。本发明实验结果可有效发现不同产地的冬虫夏草碱基确实存在差异，可划分为不同的单倍型。目前没有用DNA条形码分析各产地间冬虫夏草的差异。本发明的前期开发了大量的实验样品，所使用的样品基本涵盖了冬虫夏草的所有产区，足够大的样品量，保证了数据的正确性，这完全有别于单个样品完成的物种鉴定。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供一种全新的冬虫夏草产地快速鉴定方法，可以在一周可出鉴定出结果，低成本、周期短，并且准确可靠，克服现有技术无法准确鉴定冬虫夏草的地理来源，为维护冬虫夏草资源的健康、可持续发展和青藏高原农牧民的经济利益，具有举足轻重的作用。
附图说明
图1为冬虫夏草部分样品ITS片段扩增条带；
图2为冬虫夏草部分样品COI片段扩增条带；
图3为实施例2未知产地冬虫夏草样品测序峰图；
图4为实施例2未知产地冬虫夏草样品与数据库序列汇总的部分截图；
图5为实施例2未知产地冬虫夏草样品数据库比对结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，主要包括以下步骤：
1.选择来自不同产地的冬虫夏草代表性样品：根据冬虫夏草的主要产地分布，本实例选取从甘肃、青海、四川、西藏和云南省采集的冬虫夏草样品，产地以县级为单位进行划分，共涉及青藏高原的78个县，共计228份样品。
2.按照下述方法分别对各个样品进行基因组DNA的提取：
1)刮取约50mg冬虫夏草干标本，加入约0.2g已灭菌的石英砂，用玻璃研杵充分研磨，研磨至粉末状后装入已灭菌的1.5mL Eppendorf管中；
2)磨碎后，向Eppendorf管中加入600μL已在65℃预热的CTAB提取液，上下翻转，充分混匀后置于65℃水浴1h，期间混匀3-5次；
3)向Eppendorf管加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，上下翻转混匀，混合后在台式离心机上10000r/min离心15min，离心后吸取上清液至新的离心管中(此步骤重复一次)；
4)再往上清液中加入上清液1/10体积的3mol/L的醋酸钠水溶液和上清液 2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，上下翻转Eppendorf管，充分混合后置于-20℃沉淀30min；
5)冷冻离心机中4℃条件下10000r/min离心10min，弃上清，加入500μL 的-20℃预冷的70％的乙醇，轻轻摇晃以清洗DNA沉淀(此步骤重复一次)；
6)冷冻离心机中4℃条件下10000r/min离心10min，弃上清，加入500μL 的-20℃预冷的100％的乙醇；
7)冷冻离心机中4℃条件下10000r/min离心10min，弃上清，将装有DNA 沉淀的Eppendorf管敞口放入真空干燥仪蒸干或置于室温下自然挥发干；
8)最后加入40μL的TE缓冲液，溶解DNA，置于-20℃存放或直接PCR。
3.扩增和测序
冬虫夏草真菌PCR扩增采用ITS5和ITS4引物对，其中ITS5的核苷酸序列为：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，ITS4的核苷酸序列为： 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，扩增条件为94℃预变性7min，94℃变性 30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR 反应试剂选用2×Taq Plus MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)，含有 Taq Plus DNA Polymerase,3mM MgCl2和400μM dNTP each 10mM。PCR扩增反应体系总体积为25μL，该反应体系包含2×Taq Plus MasterMix 12.5μL，10μmol/L 引物各0.4μL，加入DNA模板0.5μL，其余体积用双蒸水补足。
冬虫夏草寄主昆虫PCR扩增采用BI1834和TH2928引物对，其中BI1834 的核苷酸序列为：5’-TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，TH2928的核苷酸序列为：5’-AATACTGCTCCTATAGATAG-3’，扩增条件为94℃预变性2min，95℃变性30s，45℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min。 PCR反应试剂选用2×Taq Plus MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)，含有Taq Plus DNA Polymerase,3mM MgCl2和400μM dNTPeach 10mM。PCR扩增反应体系总体积为25μL，该反应体系包含2×Taq Plus MasterMix12.5μL，10 μmol/L引物各0.4μL，加入DNA模板0.5μL，其余体积用双蒸水补足。
本实施例中冬虫夏草部分样品ITS片段扩增条带以及冬虫夏草部分样品COI 片段扩增条带分别如图1和图2所示，显示ITS片段和COI片段均扩增成功。
4.建立数据库
将实验获得的各个样品扩增的序列导入BioEdit软件进行比对，切除引物端后，依据双向测序的原始峰图对序列进行编辑，得到可供单倍型分析的序列集，根据序列中碱基差异采用DAMBE软件进行单倍型分析，单个碱基的差异即视为不同的单倍型，将冬虫夏草真菌和寄主的单倍型进行组合。根据单倍型分析结果显示，冬虫夏草真菌ITS有33种单倍型(F1-F33)，寄主昆虫COI有86种单倍型(H1-H86)，两者结合有111种单倍型。
将上述每个冬虫夏草样品的产地信息和单倍型都汇总到同一个数据库里，构建冬虫夏草产地鉴定数据库，以便用于完成对未知产地冬虫夏草的产地鉴定；以县级为单位，该数据库可区分出78个产地，分布最广的单倍型为真菌单倍型F1，包括西藏拉萨、那曲、昌都等地的31个县、甘肃省甘南的两个县、青海省的7 个县、四川省甘孜的7个县，本发明构建的冬虫夏草产地数据库如表1所示。
5.将未知产地的冬虫夏草样品采用上述相同的方法，经基因组DNA提取后，分别进行ITS和COI测序，序列校正后，进行单倍型分析，将样品的单倍型与数据库中的比对后，对冬虫夏草产地信息进行判断。
表1
Figure BDA0002648730150000061
Figure BDA0002648730150000071
Figure BDA0002648730150000081
Figure BDA0002648730150000091
Figure BDA0002648730150000101
Figure BDA0002648730150000111
Figure BDA0002648730150000121
Figure BDA0002648730150000131
实施例2
采用实施例1的方法，对在青海省果洛州购买的冬虫夏草进行基因组DNA 的提取，分别进行ITS和CO1测序，序列校正后，将其输入实施例1中构建的冬虫夏草产地鉴定数据库进行单倍型分析，本实施例取样的冬虫夏草样品测序峰图如图3所示。
本实施例中冬虫夏草样品与数据库序列汇总如图4所示，将样品的单倍型与数据库中的比对后，对冬虫夏草产地信息进行判断，发现该样品ITS单倍型为 F1，COI单倍型为H2，得到该样品的单倍型为F1H2，比对发现与数据库中CS583 和CS584的单倍型一致，最终鉴定购买的冬虫夏草产地为青海省果洛州甘德县。图5为本实施例冬虫夏草样品数据库比对结果。本实施例鉴定整体不超过一周时间包括从DNA提取、扩增、测序，一直到数据库比对、结果分析的时间。综上所述，本发明提供一种低成本、周期短，并且准确可靠的基于DNA条形码的冬虫夏草产地快速鉴定方法，通过本发明构建的数据库取样宽，基本涵盖了冬虫夏草主要分布区和产区，基本可以鉴定市场上所有冬虫夏草的产地，同时本发明的涉及的数据库可进一步扩展，补充可能未包括的产地的样品。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaacaaatc ataaagatat tgg 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatactgctc ctatagatag 20

Claims (9)

1.一种基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)广泛采集来自不同产地的冬虫夏草样品；
(2)对冬虫夏草样品进行基因组DNA提取；
(3)以基因组DNA为模板，扩增真菌ITS和寄主昆虫的COI序列，并双向测序；
(4)测序后得到的序列，比对校正后，根据序列的碱基差异分别进行ITS和COI的单倍型分析，并将ITS和COI单倍型进行组合；
(5)根据组合的单倍型种类，构建冬虫夏草产地鉴定数据库；
(6)将未知产地信息的冬虫夏草样品，经DNA提取，扩增测序分析后，将获得的ITS和COI单倍型输入冬虫夏草产地鉴定数据库，对冬虫夏草的产地进行判断。
2.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中广泛采集来自不同产地的冬虫夏草样品，产地来源基本覆盖所有冬虫夏草产区，采集样品时详细记录了样品采集地点、经纬度、海拔等信息，并编号、干燥备用。
3.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中采用CTAB法对冬虫夏草样品进行基因组DNA提取。
4.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中所述真菌标准条形码ITS扩增和测序使用的引物分别为ITS5和ITS4，其中ITS5的核苷酸序列为：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，ITS4的核苷酸序列为：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
5.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中所述昆虫标准条形码COI扩增和测序使用的引物分别为BI1834和TH2928，其中BI1834的核苷酸序列为：5’-TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，TH2928的核苷酸序列为：5’-AATACTGCTCCTATAGATAG-3’。
6.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中所述扩增的PCR反应试剂选用2×Taq Plus MasterMix；扩增的PCR反应体系总体积为25μL，该反应体系包含2×Taq Plus MasterMix 12.5μL，10μmol/L引物各0.4μL，加入DNA模板0.5μL，其余体积用双蒸水补足。
7.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中ITS片段的PCR扩增反应过程优选为：94℃预变性7min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min；COI片段的PCR扩增反应过程为：94℃预变性2min，95℃变性30s，45℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环，72℃延伸10min。
8.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中测序后得到的序列，采用BioEdit软件进行比对校正，校正以双向测序的原始峰图为依据，比对校正后，根据序列中碱基差异采用DAMBE软件进行单倍型分析，单个碱基有差异即可视为不同的单倍型，将冬虫夏草真菌和寄主的单倍型组合分析。
9.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的冬虫夏草产地鉴定方法，其特征在于：步骤(5)中将ITS单倍型与COI单倍型进行组合后构建冬虫夏草产地鉴定数据库。
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