CN114107541B - 一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的dna条形码 - Google Patents
一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的dna条形码 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码、引物组及应用，属于食用菌种质资源筛选技术领域。本发明与传统育种方法及其他现有DNA条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质黄绿卷毛菇原产地鉴别和遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌种质资源筛选技术领域，更具体的说是涉及一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码、引物组及应用。
背景技术
黄绿卷毛菇，色泽呈金黄色，又称为黄蘑菇、金蘑菇，是一种风味独特的优质食用菌，当前不能人工栽培。野生黄绿卷毛菇主要分布于青藏高原，主产区为西藏自治区当雄县、青海省祁连县以及四川省石渠县等，也以这三个主产区的品质最佳。评价黄绿卷毛菇营养价值风味及生物学活性的主要指标包括：总可溶性蛋白、总可溶性氨基酸、总多酚、总多糖和总脂肪含量高，抗氧化活性强。黄绿卷毛菇不同产地具有不同营养价值，不同风味，不同生物学活性，不同市场价格。以往对黄绿卷毛菇的选育主要利用形态学方法结合有益成分含量指标进行测定，但是受到特殊的青藏高气候原环境的影响，不同地区所产的黄绿卷毛菇常常出现同名异物和同物异名的现象，因此形态学鉴别法难以有效区分。更为困难的是，不能通过形态学方法来筛选出总可溶性蛋白、总可溶性氨基酸、总多酚、总多糖和总脂肪含量高，抗氧化活性强的优质菌株。此外，由于其所分布的主产区海拔较高，样本采集也存在着很大困难。
DNA条形码分子鉴定技术是基于DNA条形码(基因组中保守且稳定遗传DNA序列)来进行物种和优良品质识别鉴定的分子生物学技术。它是传统育种方法的有效补充和拓展，能够在样品形态不完整或缺乏形态结构(加工制品如粉末等)时对样品进行精准和有效地鉴定。为了实现黄绿卷毛菇的有效开发利用，利用DNA条形码分子鉴定技术辅助筛选黄绿卷毛菇菌株不同产地显得尤为重要和迫切。现有的DNA条形码技术中，ITS(核糖体RNA内转录间隔区)和线粒体体中的非编码区或保守基因序列主要用于物种物鉴定；限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)操作十分繁复，结果的可靠性和可重复性较差，随机扩增多态性DNA(random amplifiedpolymorphic DNA，RAPD)易受干扰，对操作者技术水平要求较高，在辅助育种工作中难以推广；单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)对设备要求高，成本也高。
因此针对传统育种方法选育黄绿卷毛菇菌株不够准确费时费力的缺点，如何提供一种可以准确、快捷鉴别黄绿卷毛菇的所属菌株，同时实现优质品质选育的DNA条形码，具有成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好的特点是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码、引物组，可以快速、准确筛选出黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量高的菌株，为选育优质黄绿卷毛菇提供一种有利辅助手段。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码，所述DNA条形码的核苷酸序列包括：
如SEQ ID NO：3，
和/或SEQ ID NO：4，
和/或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组合，
和/或SEQ ID NO：7,
和/或SEQ ID NO：8，
和/或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组合，
和/或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组合，
和/或SEQ ID NO：12，
和/或SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13组合中的一种或多种。
本发明基于黄绿卷毛菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequencerepeat，SSR)进行荧光PCR扩增，确立了与总可溶性氨基酸含量有效对应的DNA条形码，扩增所得片段与本发明的DNA条形码进行比对，可以快速、准确地筛选出黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量高的菌株，为黄绿卷毛菇的育种提供有利辅助。
本发明的又一目的是，提供可扩增上述筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码的引物组，所述引物组的核苷酸序列包括：
如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，
和/或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，
和/或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中的一组或多组。
作为本发明优选的技术方案，所述引物组的核苷酸序列包括：
如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，
和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，
和SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
本发明不同的引物组可以单独或组合使用筛选黄绿卷毛菇的总可溶性氨基酸含量，当所有引物组共同使用时，筛选的准确率最高。
本发明的再一目的是，提供一种以总可溶性氨基酸含量指标筛选黄绿卷毛菇的方法，包括如下步骤：
S1、提取待测样品基因组DNA；
S2、以S1基因组DNA为模板，上述的一组或多组引物分别进行荧光PCR扩增反应，得扩增产物；
S3、S2所述扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤S3的判定标准为：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物组扩增得到含5次TGG重复元件的277bp片段和含6次TGG重复元件的280bp片段；
和/或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6引物组扩增得到含6次TA重复元件的219bp片段；
和/或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10引物组扩增得到含6次TCA重复元件的239bp片段和含7次TCA重复元件的242bp片段时，判定该黄绿卷毛菇为总可溶性氨基酸含量高的黄绿卷毛菇。
作为本发明优选的技术方案，步骤S2所述荧光PCR扩增反应的反应体系为：
2×Taq PCRMasterMix 5μL，基因组DNA 1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL，带荧光的M13引物0.4μL，用无菌去离子水定容至10μL。
更优选的，所述上游引物、下游引物和带荧光的M13引物浓度均为10uM。
作为本发明优选的技术方案，，步骤S2所述荧光PCR扩增反应程序为：
95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落PCR退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h后用于荧光毛细管电泳检测。
本发明的再一目的是，提供上述DNA条形码和/或上述引物组在制备以总可溶性氨基酸含量指标筛选优质黄绿卷毛菇的产品中的应用。
本发明的再一目的是，提供一种以总可溶性氨基酸含量指标筛选优质黄绿卷毛菇的产品，含有上述的一组或多组引物组，且符合标准：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物组扩增得到含5次TGG重复元件的277bp片段和含6次TGG重复元件的280bp片段；
和/或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6引物组扩增得到含6次TA重复元件的219bp片段；
和/或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10引物组扩增得到含6次TCA重复元件的239bp片段和含7次TCA重复元件的242bp片段。
作为本发明优选的技术方案，所述产品为试剂盒。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种筛选总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码、引物组，可以利用黄绿卷毛菇野生样品及少量组织或菌丝进行优良菌株性状选育；可以在黄绿卷毛菇的菌丝体、原基、子实体、孢子等不同生长阶段鉴别；检测周期短，操作简便，且不会造成浪费，结果稳定可靠性重复性好，克服了传统育种方法选育黄绿卷毛菇菌株不够准确费时费力的缺点。
本发明与传统育种方法及其他现有DNA条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质黄绿卷毛菇性状筛选和遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明试验例、对比例1和对比例2的总可溶性氨基酸含量对比结果图；
图2附图为本发明利用引物1荧光PCR扩增对比例1、2和试验例结果图；
图3附图为本发明利用引物2荧光PCR扩增对比例1、2和试验例结果图；
图4附图为本发明利用引物3荧光PCR扩增对比例1、2和试验例结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码、引物组及应用。所用试剂均为市售可得，对其来源不做具体限定，所用到的试验方法如无特别提及，均为常规方法。
实施例1黄绿卷毛菇DNA条形码的构建
采集西藏自治区当雄县、青海省祁连县、四川省石渠县的黄绿卷毛菇样品进行基因组测序，使用MISA程序对基因组序列中的SSR位点进行分析。
设计引物对这些SSR位点进行PCR扩增，保留能扩增出对应片段的引物，舍弃无效引物。
选取西藏自治区当雄县、青海省祁连县、四川省石渠县的黄绿卷毛菇样品测定总可溶性氨基酸的含量。
利用有效引物对上述三个产地样品分别扩增并通过毛细管电泳检测。经分析建立总可溶性氨基酸含量对应的简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)位点。最终获得3对引物(见表1)，利用这3对引物对样品基因组进行扩增所得片段多态性可辅助筛选总可溶性氨基酸含量高的黄绿卷毛菇。
表1黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量高的优质菌株筛选特异引物
实施例2黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量菌株SSR特异引物扩增
(1)总可溶性氨基酸的提取
采集西藏自治区当雄县、青海省祁连县、四川省石渠县的黄绿卷毛菇子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加10mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000r/min离心30min后取上清液制备成总可溶性氨基酸提取液。总可溶性氨基酸含量采用茚三酮比色法进行测定，具体参照刘长姣等的方法(刘长姣,杨越越,王妮,余平.茚三酮比色法测定秋葵中氨基酸含量条件的优化[J].中国食品添加剂,2018,1:187-193.)，并换算为毫克每克。其中青海省祁连县黄绿卷毛菇中总可溶性氨基酸含量为76.46(±1.21)毫克每克，确定为试验例，西藏自治区当雄县黄绿卷毛菇中总可溶性氨基酸含量为43.18(±0.58)毫克每克确定为对比例1、四川省石渠县黄绿卷毛菇中总可溶性氨基酸含量为61.03(±0.51)毫克每克确定为对比例2(参见附图1)。
(2)利用生工生物工程(上海)有限公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(货号B518259)提取黄绿卷毛菇样品基因组，稀释至20ng/μL用于荧光PCR扩增。
(3)利用表1中引物进行荧光PCR扩增SSR DNA条形码。
荧光PCR扩增反应体系(10μL)：2×Taq PCR MasterMix 5μL，模板(基因组DNA)1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL(上下游引物浓度均为10uM)，带荧光的M13引物(浓度10uM)0.4μL，用无菌的去离子水定容至10μL；
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落PCR退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h后用于荧光毛细管电泳检测。
(4)将PCR产物进行定量稀释后，取1μL PCR稀释产物加9μL甲酰胺(含1％内标)变性后上DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测。内标为LIZ-500分子量内标(又称分子量内对照，internal lane standards)由16条带有LIZ荧光素(橙色)标记的双链DNA片段组成，分子量分别是：35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500bp。扩增结果电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物(约18bp，误差1-2bp)，扩增毛细管电泳峰结合测序结果，峰数量表示该基因杂合子扩增片段数量。
(5)采用以上方法对试验例、对比例1和对比例2的黄绿卷毛菇进行鉴定。
引物1扩增结果如附图2所示，当使用引物1进行荧光PCR扩增时，扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TGG。其中试验例所得扩增片段的特征分别含5和6次重复的277bp片段和280bp的片段。
引物1扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括M13荧光引物，具体序列展示去掉了该M13荧光引物序列(17bp)，误差为1bp，下划线部分为SSR重复元件。)
277bp扩增片段序列：
TGACGTTGGTGGAGATTCCGAAGATATTGGCGCTCTTGTAAAATTTGCTGATGATGAGACTCATGGTGTTGCGGCTGTTGCTGTTGCTGCAAATGAAGTTGGTGGTGGTGGTGGTACAACTGCTCATCCTGTAACATCTGTTCGTGTTGACGCTGGCGAGTCTGCATCTGTCGTTGTAGCTGCTCTTCTTCAAAACGAGAACGGGGAGAAGAAAGAGGGAGAATATAAGGGAGGGAGACGGGCGCTGAGAAAATGAATCAACTGGACTGAGACGCAC(如SEQ ID NO：3所示)
280bp扩增片段序列：
TGACGTTGGTGGAGATTCCGAAGATATTGGCGCTCTTGTAAAATTTGCTGATGATGAGACTCATGGTGTTGCGGCTGTTGCTGTTGCTGCAAATGAAGTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTACAACTGCTCATCCTGTAACATCTGTTCGTGTTGACGCTGGCGAGTCTGCATCTGTCGTTGTAGCTGCTCTTCTTCAAAACGAGAACGGGGAGAAGAAAGAGGGAGAATATAAGGGAGGGAGACGGGCGCTGAGAAAATGAATCAACTGGACTGAGACGCAC(如SEQ ID NO：4所示)
引物2扩增结果如附图3所示，当使用引物2进行荧光PCR扩增时，扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TA。其中试验例所得扩增片段的特征为含6次重复的219bp片段。附图3中，225bp的扩增片段属于非特异扩增，并不含SSR重复元件。
引物2扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括M13荧光引物，具体序列展示去掉了该M13荧光引物序列(18bp)，下划线部分为SSR重复元件。)
219bp扩增片段序列：
GTGACACAGCAACTCGGAGAACTGTTGTACAAGTAAATGTTACACGAAGCACAACAGGAGAACTATAT ATATATAATTATGGACTGACGTGAAAATGCAGGCGATTACTAGTCCCGTTAAGAGGTTGTTATGAAAGGAGGTAAGGAATAACTTGGAGAAAACGGAAGGTCCATCCCGACCAGAGTGCACGCATCAATAATACGCTGCCGTAAGACATCG(如SEQ ID NO：7所示)
221bp扩增片段序列：
GTGACACAGCAACTCGGAGAACTGTTGTACAAGTAAATGTTACACGAAGCACAACAGGAGAACTATAT ATATATATAATTATGGACTGACGTGAAAATGCAGGCGATTACTAGTCCCGTTAAGAGGTTGTTATGAAAGGAGGTAAGGAATAACTTGGAGAAAACGGAAGGTCCATCCCGACCAGAGTGCACGCATCAATAATACGCTGCCGTAAGACATCG(如SEQ ID NO：8所示)
引物3扩增结果如附图4所示，当使用引物3进行荧光PCR扩增时，扩增得到三个片段(三个峰)，含有3个SSR位点，SSR重复元件为TCA。其中试验例所得扩增片段的特征为分别含6和7次重复的239bp片段和242bp片段。
引物3扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括M13荧光引物，具体序列展示去掉了该M13荧光引物序列(18bp)，下划线部分为SSR重复元件。)
239bp扩增片段序列：
CGGTCGAGCTTCAGGAGTTTTGGGTTCGACGACCTCTTCTTCTTCCACAACATCAGTCTTGGATTCCACATCATTGTGCAGGAAGGATCGTTCCTTCTTCCTCTTCTACGCTTCCTTCCTCAGAATAATTGGTGTCCTCGTCTT CATCATCATCATCATCATCGAGAATGACAGAATGACGACCTTTAAATGAGTAACCATCGAATACGTCAACGGTATCATCTTCTGGCTGACGTGGT(如SEQ ID NO：11所示)
242bp扩增片段序列：
CGGTCGAGCTTCAGGAGTTTTGGGTTCGACGACCTCTTCTTCTTCCACAACATCAGTCTTGGATTCCACATCATTGTGCAGGAAGGATCGTTCCTTCTTCCTCTTCTACGCTTCCTTCCTCAGAATAATTGGTGTCCTCGTCTT CATCATCATCATCATCATCATCGAGAATGACAGAATGACGACCTTTAAATGAGTAACCATCGAATACGTCAACGGTATCATCTTCTGGCTGACGTGGT(如SEQ ID NO：12所示)
245bp扩增片段序列：
CGGTCGAGCTTCAGGAGTTTTGGGTTCGACGACCTCTTCTTCTTCCACAACATCAGTCTTGGATTCCACATCATTGTGCAGGAAGGATCGTTCCTTCTTCCTCTTCTACGCTTCCTTCCTCAGAATAATTGGTGTCCTCGTCTT CATCATCATCATCATCATCATCATCGAGAATGACAGAATGACGACCTTTAAATGAGTAACCATCGAATACGTCAACGGTATCATCTTCTGGCTGACGTGGT(如SEQ ID NO：13所示)
通过对试验例、对比例1和对比例2图谱和测序结果综合分析，获得总可溶性氨基酸含量高的黄绿卷毛菇的DNA条形码特征信息如表2所示。引物1扩增出含5次TGG重复元件的277bp片段(如SEQ ID NO：3所示)和含6次TGG重复元件的280bp片段(如SEQ ID NO：4所示)；引物2扩增出含6次TA重复元件的219bp片段(如SEQ ID NO：7所示)；引物3扩增出含6次TCA重复元件的239bp片段(如SEQ ID NO：11所示)和含7次TCA重复元件的242bp片段(如SEQID NO：12所示)。分别使用引物1、2、3或任意引物组合均可进行综合检测判断，当引物1、2、3共同使用时，对黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标筛选的准确性最好。
表2总可溶性氨基酸含量高的黄绿卷毛菇的DNA条形码特征
实施例3黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标筛选验证
通过盲试试验验证黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量的DNA条形码。
第一步盲试，以总可溶性氨基酸含量高于或等于76.46毫克每克的青海省祁连县样品为试验组，以低于76.46毫克每克(显著性p<0.05)的西藏自治区当雄县和四川省石渠县样品为对比1组和对比2组，各取16份共48份样品进行盲试；
第二步测试，利用引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)扩增并进行毛细管电泳。引物组可使用一对或多对组合扩增并以总可溶性氨基酸含量DNA条形码特征区分盲试样品；
第三步揭盲，结果如表3所示，以总可溶性氨基酸含量DNA条形码特征区分总可溶性氨基酸含量高和低的各16份样品揭盲结果全部正确。由此说明总可溶性氨基酸含量的DNA条形码适用于总可溶性氨基酸含量性状的筛选。
表3总可溶性氨基酸含量DNA条形码特征揭盲鉴定结果
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 杨满军
<120> 一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagttg acgttggtgg agattccg 38
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgcgtctca gtccagttga 20
<210> 3
<211> 277
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacgttggt ggagattccg aagatattgg cgctcttgta aaatttgctg atgatgagac 60
tcatggtgtt gcggctgttg ctgttgctgc aaatgaagtt ggtggtggtg gtggtacaac 120
tgctcatcct gtaacatctg ttcgtgttga cgctggcgag tctgcatctg tcgttgtagc 180
tgctcttctt caaaacgaga acggggagaa gaaagaggga gaatataagg gagggagacg 240
ggcgctgaga aaatgaatca actggactga gacgcac 277
<210> 4
<211> 280
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgacgttggt ggagattccg aagatattgg cgctcttgta aaatttgctg atgatgagac 60
tcatggtgtt gcggctgttg ctgttgctgc aaatgaagtt ggtggtggtg gtggtggtac 120
aactgctcat cctgtaacat ctgttcgtgt tgacgctggc gagtctgcat ctgtcgttgt 180
agctgctctt cttcaaaacg agaacgggga gaagaaagag ggagaatata agggagggag 240
acgggcgctg agaaaatgaa tcaactggac tgagacgcac 280
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtgt gacacagcaa ctcggaga 38
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgatgtctta cggcagcgta 20
<210> 7
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgacacagc aactcggaga actgttgtac aagtaaatgt tacacgaagc acaacaggag 60
aactatatat atataattat ggactgacgt gaaaatgcag gcgattacta gtcccgttaa 120
gaggttgtta tgaaaggagg taaggaataa cttggagaaa acggaaggtc catcccgacc 180
agagtgcacg catcaataat acgctgccgt aagacatcg 219
<210> 8
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgacacagc aactcggaga actgttgtac aagtaaatgt tacacgaagc acaacaggag 60
aactatatat atatataatt atggactgac gtgaaaatgc aggcgattac tagtcccgtt 120
aagaggttgt tatgaaagga ggtaaggaat aacttggaga aaacggaagg tccatcccga 180
ccagagtgca cgcatcaata atacgctgcc gtaagacatc g 221
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtcg gtcgagcttc aggagttt 38
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accacgtcag ccagaagatg 20
<210> 11
<211> 239
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggtcgagct tcaggagttt tgggttcgac gacctcttct tcttccacaa catcagtctt 60
ggattccaca tcattgtgca ggaaggatcg ttccttcttc ctcttctacg cttccttcct 120
cagaataatt ggtgtcctcg tcttcatcat catcatcatc atcgagaatg acagaatgac 180
gacctttaaa tgagtaacca tcgaatacgt caacggtatc atcttctggc tgacgtggt 239
<210> 12
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggtcgagct tcaggagttt tgggttcgac gacctcttct tcttccacaa catcagtctt 60
ggattccaca tcattgtgca ggaaggatcg ttccttcttc ctcttctacg cttccttcct 120
cagaataatt ggtgtcctcg tcttcatcat catcatcatc atcatcgaga atgacagaat 180
gacgaccttt aaatgagtaa ccatcgaata cgtcaacggt atcatcttct ggctgacgtg 240
gt 242
<210> 13
<211> 245
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggtcgagct tcaggagttt tgggttcgac gacctcttct tcttccacaa catcagtctt 60
ggattccaca tcattgtgca ggaaggatcg ttccttcttc ctcttctacg cttccttcct 120
cagaataatt ggtgtcctcg tcttcatcat catcatcatc atcatcatcg agaatgacag 180
aatgacgacc tttaaatgag taaccatcga atacgtcaac ggtatcatct tctggctgac 240
gtggt 245
Claims (9)
1.一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码，其特征在于，所述DNA条形码的核苷酸序列为：
SEQ ID NO：3-4的组合、SEQ ID NO：7-8的组合、和SEQ ID NO：11-13的组合中的一组或多组；
所述黄绿卷毛菇来源地为青海省祁连县、四川省石渠县和西藏自治区当雄县。
2.一种扩增如权利要求1所述筛选黄绿卷毛菇总可溶性氨基酸含量指标的DNA条形码的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10中的一组或多组。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，
和SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，
和SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
4.一种以总可溶性氨基酸含量指标筛选黄绿卷毛菇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取待测样品基因组DNA；
S2、以S1基因组DNA为模板，选择权利要求2所述的一组或多组引物分别进行荧光PCR扩增反应，得扩增产物；
S3、S2所述扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定；
判定标准为：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物组扩增得到的产物去掉M13荧光引物后为含5次TGG重复元件的277bp片段和含6次TGG重复元件的280bp片段；
和/或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6引物组扩增得到的产物去掉M13荧光引物后为含6次TA重复元件的219bp片段；
和/或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10引物组扩增得到的产物去掉M13荧光引物后为含6次TCA重复元件的239bp片段和含7次TCA重复元件的242bp片段时，判定该黄绿卷毛菇为总可溶性氨基酸含量高的黄绿卷毛菇，
所述黄绿卷毛菇来源地为青海省祁连县、四川省石渠县和西藏自治区当雄县。
5.根据权利要求4所述的以总可溶性氨基酸含量指标筛选黄绿卷毛菇的方法，其特征在于，步骤S2所述荧光PCR扩增反应的反应体系为：
2×Taq PCR Master Mix 5μL，基因组DNA 1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL，带荧光的M13引物0.4 μL，用无菌去离子水定容至10μL。
6.根据权利要求5所述的以总可溶性氨基酸含量指标筛选黄绿卷毛菇的方法，其特征在于，所述上游引物、下游引物和带荧光的M13引物浓度均为10 uM。
7.根据权利要求4所述的以总可溶性氨基酸含量指标筛选黄绿卷毛菇的方法，其特征在于，步骤S2所述荧光PCR扩增反应程序为：
95℃预变性3 min；95℃变性30 s，62至55℃降落PCR退火30 s，72℃延伸30 s，共10个循环；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环；72℃ 终延伸20 min；4℃保温6 h后用于荧光毛细管电泳检测。
8.权利要求1所述DNA条形码和/或权利要求2所述引物组在制备以总可溶性氨基酸含量指标筛选黄绿卷毛菇的产品中的应用，其特征在于，所述黄绿卷毛菇来源地为青海省祁连县、四川省石渠县和西藏自治区当雄县。
9.一种以总可溶性氨基酸含量指标筛选优质黄绿卷毛菇的产品，其特征在于，含有权利要求2所述的引物组，所述黄绿卷毛菇来源地为青海省祁连县、四川省石渠县和西藏自治区当雄县。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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