CN105713980A - 四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法 - Google Patents

四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，该方法包括以下步骤：⑴分别采用与<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增，分别得到<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因的扩增片段；⑵分别对所述<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的<i>EF1</i><i>–</i>α、751bp的<i>RPB1</i>、782bp的<i>RPB2</i>、688bp的<i>Mcm7</i>基因片段；⑶除去所述步骤⑵所得的<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因片段两头各30bp序列，在线设计引物选取得分最高的一对引物；⑷用不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株扩增测序验证所述步骤⑶中引物的专一性即可。本发明简便易行，所得引物有着优异的扩增性能。

Description

四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法
技术领域
本发明涉及真菌系统发育、谱系地理学技术领域，尤其涉及四对黄绿卷毛菌核基因（EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7）引物的设计、扩增与测序方法。
背景技术
黄绿卷毛菌（Floccularialuteovirens）隶属于伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae），是一种主要分布在青藏高原的产子实体的外生菌根真菌。由于其子实体色泽嫩黄、口味鲜美、营养丰富，长久以来一直被作为青藏高原特色美食、有着较高的经济价值。但是，近年来随着子实体贸易的不断升温，黄绿蜜环菌资源正面临过度采伐的危险，同时，其分类地位也一直存在着争议。因此很有必要利用分子标记研究该菌遗传多样性及系统发育学问题。
RNA聚合酶（RNApolymerases）在基因表达的过程中扮演着很重要的角色。目前，在真核生物中成功地分离出3种RNA聚合酶。其中，RNA聚合酶II由12个亚基组成（RPB1-RPB12）。RNA聚合酶II大亚基（RPB1）是决定真核生物信使RNA（mRNA）转录起始和延伸的最主要的功能亚基，存在多种翻译后修饰。负责转录生成hnRNA和mRNA的RPB2（Thesecondlar-gestRNApolymerasesubunit）基因负责编码RNA聚合酶II的第2大亚基，具有单拷贝和进化速率慢的特点。而EF1-α是真核生物细胞内第二大蛋白，在蛋白质合成延伸过程中起重要作用，其具有高度的种间保守性，适合进行系统发育研究。Mcm7是微小染色体维持蛋白7的缩写，它有着适宜的进化速率也是真菌系统发育学与谱系地理学研究的有效工具。目前，上述基因由于通用引物具有良好的扩增性能，因而广泛应用于真菌系统发育与系统发育学以及谱系地理学研究当中。
然而，在研究黄绿卷毛菌遗传多样性与谱系地理学过程中，利用上述基因的通用引物扩增该菌相应基因，却得不到扩增结果或者扩增出多条非特异性条带。因此，虽然上述基因有诸多有优势，但其在黄绿卷毛菌的研究上却表现出了局限性，限制了利用上述基因对于黄绿卷毛菌的相关研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便易行的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法。
为解决上述问题，本发明所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：
⑴分别采用与EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增，分别得到EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段；
⑵分别对所述EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的EF1–α、751bp的RPB1、782bp的RPB2、688bp的Mcm7基因片段；
⑶除去所述步骤⑵所得的EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因片段两头各30bp序列，在线设计引物选取得分最高的一对引物，其中：
EF1-α引物的上游引物EF-9F有18个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT；
RPB1引物的上游引物RPB1-FF1有22个碱基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB1-FR1有20个碱基TCAGGAAATCTTCGCCACG；
RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22个碱基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物RPB2-61R1有20个碱基TGGTCCGGGAAAGGTATAAT；
Mcm7引物的上游引物MC1F有21个碱基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20个碱基TCCTCATGGCCATATATCTCA；
⑷用不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株扩增测序验证所述步骤⑶中引物的专一性即可。
所述步骤⑴与EF1–α基因相匹配的通用引物是指EF-983F与EF-1567R。
所述步骤⑴与RPB1基因相匹配的通用引物是指RPB1-Ff与RPB1-G2r。
所述步骤⑴与RPB2基因相匹配的通用引物是指RPB2-6F与RPB2-7.1R。
所述步骤⑴与Mcm7基因相匹配的通用引物是指Mcm7-709for与Mcm7-1447rev。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明所得到的引物有着优异的扩增性能，50~60℃温度梯度试验均能扩增出明亮、唯一的产物条带（参见图1），有利于后续研究大规模应用该引物进行扩增。
2、应用本发明所得到的引物扩增片段对50个不同地理分布的黄绿卷毛菌菌株进行扩增，均能够得到特异性产物，说明该引物具有良好的个体间的通用性。
3、应用本发明所得到的引物扩增片段对50个不同地理分布的黄绿卷毛菌菌株进行测序均获得了理想的结果，说明该引物具有良好的测序性能。
4、本发明简便易行。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详吸的说明。
图1为本发明各片段50~60℃温度梯度做胶检测结果。
具体实施方式
四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：
⑴分别采用与EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增，分别得到EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段。
其中：
①采用通用引物983F与1567R对黄绿卷毛菌进行扩增，得到EF1–α基因的扩增片段。
扩增PCR反应体系：25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，983F（10mM）0.5μL，1567R（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL）0.5μL，0.2μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火50s，72℃延伸55s，共34个循环，最后72℃延伸10min。
②采用通用引物RPB1-Ff与RPB1-G2r对黄绿卷毛菌进行扩增，得到RPB1、基因的扩增片段。
扩增PCR反应体系：25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，RPB1-Ff（10mM）0.5μL，RPB1-G2r（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL）0.5μL，0.2μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸50s，共34个循环，最后72℃延伸10min。
③采用通用引物RPB2-6F与RPB2-7.1R对黄绿卷毛菌进行扩增，得到RPB2基因的扩增片段。
扩增PCR反应体系：25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，RPB2-6F（10mM）0.5μL，RPB2-7.1R（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL）0.5μL，0.2μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火50s，72℃延伸55s，共34个循环，最后72℃延伸10min。
④采用通用引物Mcm7-709for与Mcm7-1447rev对黄绿卷毛菌进行扩增，得到Mcm7基因的扩增片段。
扩增PCR反应体系：25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，Mcm7-709for（10mM）0.5μL，Mcm7-1447rev（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL）0.5μL，0.2μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火50s，72℃延伸55s，共34个循环，最后72℃延伸10min。
⑵分别对EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的EF1–α、751bp的RPB1、782bp的RPB2、688bp的Mcm7基因片段。
具体步骤如下：
ⅰ扩增获得片段通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。
ⅱ根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖（如胶块不足100mg则用水补充至100mg）加300~600μL的比例加入BufferB2。
ⅲ将离心管置于50℃水浴5~10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。
ⅳ加入所使用的BufferB2体积1/3的异丙醇，混匀。
ⅴ将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000×g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
ⅵ向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000×g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
ⅶ重复步骤ⅵ一次。
ⅷ将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。
ⅸ在吸附膜中央加入15~40μLElutionBuffer，室温静置1-2min，9000×g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存。
⑶除去步骤⑵所得的EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因片段两头各30bp序列，在线设计引物（http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer参数为默认参数）选取得分最高的一对引物，其中：
EF1-α引物的上游引物EF-9F有18个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT。
RPB1引物的上游引物RPB1-FF1有22个碱基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB1-FR1有20个碱基TCAGGAAATCTTCGCCACG。
RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22个碱基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物RPB2-61R1有20个碱基TGGTCCGGGAAAGGTATAAT。
Mcm7引物的上游引物MC1F有21个碱基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20个碱基TCCTCATGGCCATATATCTCA。
⑷用50个不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株（这些菌株来自青藏高原西藏、青海、四川涵盖了卷毛蜜环菌分布的大部分区域。）扩增测序验证步骤⑶中引物的专一性即可（参见表1）。
表1绿卷毛菌菌株地理分布
具体验证过程如下：
ⅰEF1-α引物：
扩增PCR反应体系为25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，EF-9F（10mM）0.5μL，EF-9R（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL），0.5μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，51℃退火45s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
测序共获得375~376bp长度的序列。
ⅱRPB1引物：
扩增PCR反应体系为25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，RPB1-FF1（10mM）0.5μL，RPB1-FR1（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL），0.5μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，51℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
扩增获得427~427bp的片段
ⅲRPB2引物：
扩增PCR反应体系为25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM），0.5μLRPB2-61F（10mM）0.5μL，RPB2-61R（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL），0.5μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，51℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
测序共获得559~560bp长度的序列。
ⅳMcm7引物：
扩增PCR反应体系为25μL内含ddH2O19.3μL，10×Buffer（+Mg2+）2.5μL，dNTP（10mM）0.5μL，MC1F（10mM）0.5μL，MC3R（10mM）0.5μL，Taqpolymerase（5U/μL），0.5μLDNA模板（15ng）1.5μL。
扩增条件为：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
测序共获得393~395bp长度的序列。

Claims (5)

1.四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：
⑴分别采用与EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因相匹配的通用引物对黄绿卷毛菌进行扩增，分别得到EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段；
⑵分别对所述EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因的扩增片段做胶检测，割取目的条带，经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后进行测序，分别得到521bp的EF1–α、751bp的RPB1、782bp的RPB2、688bp的Mcm7基因片段；
⑶除去所述步骤⑵所得的EF1–α、RPB1、RPB2、Mcm7基因片段两头各30bp序列，在线设计引物选取得分最高的一对引物，其中：
EF1-α引物的上游引物EF-9F有18个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21个碱基AGCACGCTCTCCTTGCTT；
RPB1引物的上游引物RPB1-FF1有22个碱基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB1-FR1有20个碱基TCAGGAAATCTTCGCCACG；
RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22个碱基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物RPB2-61R1有20个碱基TGGTCCGGGAAAGGTATAAT；
Mcm7引物的上游引物MC1F有21个碱基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20个碱基TCCTCATGGCCATATATCTCA；
⑷用不同地理分布来源的黄绿卷毛菌菌株扩增测序验证所述步骤⑶中引物的专一性即可。
2.如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在于：所述步骤⑴与EF1–α基因相匹配的通用引物是指EF-983F与EF-1567R。
3.如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在于：所述步骤⑴与RPB1基因相匹配的通用引物是指RPB1-Ff与RPB1-G2r。
4.如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在于：所述步骤⑴与RPB2基因相匹配的通用引物是指RPB2-6F与RPB2-7.1R。
5.如权利要求1所述的四对黄绿卷毛菌核基因引物的设计、扩增与测序方法，其特征在于：所述步骤⑴与Mcm7基因相匹配的通用引物是指Mcm7-709for与Mcm7-1447rev。
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