CN112280687B - 一株蟹味菇gj5菌株及其ssr标记引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株蟹味菇GJ5菌株及其SSR标记引物和应用，所述蟹味菇GJ5菌株的保藏编号为CCTCC M 2020506；所述SSR标记引物包括5对SSR特异性标记引物组合，所述5对SSR特异性标记引物组成了指纹图谱。所述应用的检测步骤如下：提取待测菌株的菌丝或者子实体的基因组DNA；进行SSR分子标记扩增；电泳检测；将电泳条带跟指纹图谱进行比对，与该指纹图谱一致的菌株即为蟹味菇GJ5菌株。本发明与常规形态学检测、拮抗实验、出菇实验方法相比，具有检测时间短、准确度高、重复性好等优点，利用本发明构建的SSR指纹图谱能够将蟹味菇GJ5菌株跟23个真姬菇主要栽培品种区分开来。
Description
技术领域
本发明属于食用菌菌种检测的技术领域，具体涉及一株蟹味菇GJ5菌株及其SSR标记引物和应用。
背景技术
蟹味菇(Hypsizygus marmoreus)为灰色真姬菇，属于伞菌目，白蘑科，玉蕈属，菇体为淡灰色，质地细腻，口感鲜香，有独特的蟹香味，营养丰富，含有大量的多糖、蛋白质和多种微量元素，具有较高的经济价值和市场潜力。
工厂化栽培中菌种是保证其高产、稳产的关键，蟹味菇5号菌株为实验室自主研发的具有产量高，菌株性状稳定，液体菌种浓度高、活力强，出菇整齐，口味好等优点。食用菌具有无性繁殖的特点，通过对子实体进行简单的组织分离即可获得菌种。因此加强对菌种的鉴定和保护是食用菌工厂化、产业化进程的基础。
不同品种的蟹味菇，口感品质、产量、生产周期、栽培条件(培养基组成、温度、光照、pH、湿度)等在不同菌种之间差异较大，在工厂化栽培生产蟹味菇的过程中首要任务是准确、快速地确定蟹味菇的菌种信息，根据不同的蟹味菇品种设置工厂化生产的条件。因此需要发展快速、准确、高效的食用菌菌株鉴定方法，保证菌株的菌种准确。
菌株是食用菌产业发展的基础和保障，直接影响出菇的产量和品质。目前市场上蟹味菇的种类较多，菌种管理制度不健全，使得蟹味菇的品质参差不齐，加速了蟹味菇菌种的退化速度，因此急需快速、准确地蟹味菇菌种的鉴定方法和技术。
随着分子生物学技术的发展，PCR和测序技术的普及，使得应用DNA水平上的差异来进行菌株鉴定成为可能。目前已有十余种可用于菌株鉴定的分子标记方法。由于真菌中简单重复序列(SSR)分布较少，且呈现多态性，具有操作简单、快速且准确性高等优点受到广泛关注。但SSR标记技术在蟹味菇中的应用研究较少，南京农业大学的董岩等利用7对引物对27个真姬菇菌种进行多态性分析。但是由于当时并没有真姬菇的基因组序列信息，其SSR引物是参考香菇、糙皮侧耳和灰盖鬼伞的基因组序列设计的，因此引物的特异性不高，不能将蟹味菇GJ5菌株跟其他菌株区分开来。
发明内容
针对不同蟹味菇菌种栽培和生长条件存在差异，不同蟹味菇菌种的品质存在较大差异等问题，本发明的目的是提供一株蟹味菇GJ5菌株及其SSR标记引物。
本发明的第二目的在于提供所述SSR标记引物在蟹味菇GJ5菌株鉴定中的应用。
为实现该发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株蟹味菇GJ5菌株(Hypsizygus marmoreus)，其保藏编号为CCTCCM 2020506。
本发明提供了所述的蟹味菇GJ5菌株的SSR标记引物，所述SSR标记引物包括以下5对引物：
SSR-06正向引物：AGCTTGTACGACGAGGTCTCTG；
SSR-06反向引物：AAGGCGTAAAGTCATTCATCG；
SSR-69正向引物：ACGACGAGGTCAGAGGCAG；
SSR-69反向引物：GCTCAACAGTTATTCCTCAGTGC；
SSR-106正向引物：GGGTTTGCTGTTGCTGCT；
SSR-106反向引物：GTTATAATGCTGGAACCGTCG；
SSR-109正向引物：AAGGTTGGCTGGCAGTGTG；
SSR-109反向引物：TGAGAAGAAAAATAGCCAAAAGG；
SSR-139正向引物：AACAAGAAAAGAGGGTTATGCG；
SSR-139反向引物：ATCTCGCATATCCCGCCA。
本发明提供了所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用。
进一步的：所述鉴别方法包括以下步骤：
(1)提取待测菌株的菌丝或者子实体的基因组DNA；
(2)SSR分子标记检测：以提取的基因组DNA作为模板，分别用5对特异性引物进行PCR反应；
(3)电泳检测PCR产物的特异性条带；对照各SSR引物对应的等位片段的数量和相对分子量，根据等位片段组合确定蟹味菇GJ5菌株。
进一步的：所述步骤(2)中PCR的反应体系为：总体积为15μL，1μL正向引物，1μL反向引物，0.8μL基因组DNA，7.5μL2×Taq酶mix，4.7μL去离子水；
PCR的反应条件为：95℃180s；95℃15s，56℃20s，72℃60s，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保温。
进一步的：所述SSR-06引物对应的等位片段为4条，分子量分别为1→200bp，2→1800bp，3→2100bp，4→3000bp。
进一步的：所述SSR-69引物对应的等位片段为3条，分子量分别为1→210bp；2→1300bp；3→4500bp。
进一步的：所述SSR-106引物对应的等位片段为2条，分子量分别为1→210bp；2→5000bp。
进一步的：所述SSR-109引物对应的等位片段为3条，分子量分别为1→875bp；2→1800bp，3→2000bp。
进一步的：所述SSR-139引物对应的等位片段为2条，分子量分别为1→200bp；2→1900bp。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
1、本发明跟常规的形态学鉴定、菌丝对峙和拮抗培养实验等方法相比，具有检测时间短、检测成本低、准确性高、可重复好性等优点。
2、本发明跟其他分子标记鉴定菌株的方法相比，具有操作简单、成本低、特异性强等优点。
3、本发明所涉及的SSR序列是直接从蟹味菇基因组DNA序列中分析得到的，引物特异性好，本发明跟已有的真姬菇SSR分子标记方法相比，SSR标记的特异性引物专一性更强，所用引物仅有5对，进一步降低成本。
4、本发明针对的蟹味菇品种为市面上销售较广的工厂化栽培的蟹味菇，具有较强的针对性。本发明对于蟹味菇菌种资源鉴定、保护和开发具有重要的意义。
本发明是在蟹味菇基因组测序的基础上，在其基因组上找到了150个SSR标记序列，设计退火温度一致的特异性引物，能够对市面上常见的抗病、耐热、高产菌株共计24种进行菌种鉴定，对于蟹味菇的工厂化栽培和菌株精准追踪溯源有重要的参考价值和指导意义。
附图说明
图1为蟹味菇GJ5菌株的SSR标记指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：蟹味菇GJ5菌株的SSR标记引物的开发和应用
所述蟹味菇GJ5菌株为实验室自主研发的工厂化蟹味菇菌株，该菌株具有产量高，菌株性状稳定，液体菌种浓度高、活力强，出菇整齐，口味好等优点。
将本发明研发的所述蟹味菇GJ5菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年9月16日；Hypsizygus marmoreusGJ5菌株的保藏编号为CCTCC M 2020506。
(1)蟹味菇SSR标记序列分析及引物设计：
提取蟹味菇GJ5菌株的基因组进行全基因组测序，获得的基因组大小为45.1M，利用SSRHunter1.3软件在基因组序列中搜素SSR标记序列，搜索条件设定为：核苷酸个数为2个、3个、4个、5个、6个，重复次数大于等于5次。共搜索到符合条件的SSR标记序列150个，利用引物设计软件Primer3.0在含有SSR标记的序列信息设计引物，共设计20对引物，设计引物信息见表1。
表1 20对SSR标记引物信息列表
(2)菌丝培养：
将收集到的菌种(菌种信息见表2)转接到马铃薯葡萄糖培养基中，20-24℃培养5天后收集菌丝。
表2菌种信息
(3)基因组DNA提取：
从固体培养基平板上刮取100mg菌丝置于液氮中研磨至粉末状，迅速将粉末转移到预冷的1.5mL离心管中，并加入600μL的裂解缓冲液，剧烈混匀；
将样品置于65℃水浴锅中温浴10分钟，期间颠倒混匀2-3次；
加入140μL的FG2 buffer，剧烈混匀，12000g离心10分钟，将上清液用移液器吸出置于新的离心管中，加入等体积的异丙醇并充分涡旋使DNA沉淀出来；
10000g离心2分钟，小心弃掉上清，并晾干多余水分，加入300μL60℃预热的无菌水重悬沉淀，并加入4μLRNase混匀；
加入150μL缓冲液FG3，300μL无水乙醇，涡旋混匀后，转移至HiBind纯化柱中，10000g离心1分钟使之与DNA结合，弃掉废液；
向纯化柱中加入700μL的DNA wash buffer，10000g离心1分钟，重复该步骤2次；
13000g离心2分钟，彻底干燥DNA，向纯化柱中加入50-100μL的去离子水，室温放置2-4分钟，10000g离心1分钟收集基因组DNA。置于-20℃冰箱中保存备用。
(4)SSR分子标记的检测：
分别用上述提取的基因组DNA为模板，用20对引物分别进行PCR扩增。
PCR的反应体系为：总体积为15μL，1μL正向引物，1μL反向引物，0.8μL基因组DNA，7.5μL2×Taq酶mix，4.7μL去离子水；
PCR的反应条件为：95℃180s；95℃15s，56℃20s，72℃60s，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保温。
(5)电泳检测：
将上述PCR产物(10μL)加入1μL的10×buffer，将混合后的样本加到电泳胶中，电泳缓冲液为1×TBE，电压100V，电流50mA，功率为50W，电泳时间为20分钟，EB染色观察。
(6)菌种鉴定：比较PCR扩增条带，对照marker确定各SSR引物对应的等位片段的数量和相对分子量，获得如表3所示的等位片段信息，符合该等位片段组合的菌种即可确定为蟹味菇GJ5菌株。为保证鉴定的准确性，建议重复三次。
表3 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
实施例2：蟹味菇5号不同部位子实体的SSR标记指纹图谱
本发明中的SSR标记是基于蟹味菇全基因组测序后利用SSRhunter1.3软件在基因组DNA上找到的150个简单重复序列(SSR)，并根据其上下游基因序列设计特异性引物，通过收集的蟹味菇菌种进行PCR扩增后跑电泳获得多态性标记片段。SSR标记具有检测方法简单、对样品量的要求少、对取样位置没有要求、重复性好、检测时间短等优点。本发明对大量的SSR引物进行筛选，最终得到5对多态性高、特异性好的引物，利用这5对引物获得的片段组合能够对目前市售的24种白玉菇和蟹味菇及实验室筛选的高产、耐热、抗病菌株进行菌株鉴定。
本发明提供的所述蟹味菇GJ5菌株的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由下述5对SSR标记引物组成，是基于蟹味菇基因组简单重复序列(SSR)开发的特异性引物，扩增带型清晰，特异性好，重复性高，标记引物详细信息如表4。
表4 SSR详细信息列表
(1)基因组DNA提取；
分别取不同部位的子实体(菌柄和菌盖)100mg置于液氮中冷冻后，研磨至粉末状，迅速将粉末转移到预冷的1.5mL离心管中，并加入600μL的裂解缓冲液，剧烈混匀；
将样品置于65℃水浴锅中温浴10分钟，期间颠倒混匀2-3次；
加入140μL的FG2 buffer，剧烈混匀，12000g离心10分钟，将上清液用移液器吸出置于新的离心管中，加入等体积的异丙醇并充分涡旋使DNA沉淀出来；
10000g离心2分钟，小心弃掉上清，并晾干多余水分，加入300μL60℃预热的无菌水重悬沉淀，并加入4μLRNase混匀；
加入150μL缓冲液FG3，300μL无水乙醇，涡旋混匀后，转移至HiBind纯化柱中，10000g离心1分钟使之与DNA结合，弃掉废液；
向纯化柱中加入700μL的DNA wash buffer，10000g离心1分钟，重复该步骤2次；
13000g离心2分钟，彻底干燥DNA，向纯化柱中加入50-100μL的去离子水，室温放置2-4分钟，10000g离心1分钟收集基因组DNA。置于-20℃冰箱中保存备用。
(2)SSR分子标记检测：以提取的基因组DNA作为模板，分别用5对特异性引物进行PCR反应，特异性引物序列见表4；
PCR的反应体系为：总体积为15μL，1μL正向引物，1μL反向引物，0.8μL基因组DNA，7.5μL2×Taq酶mix，4.7μL去离子水；
PCR的反应条件为：95℃180s；95℃15s，56℃20s，72℃60s，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保温。
(3)电泳检测PCR产物的特异性条带：比较PCR扩增条带，对照marker确定各SSR引物对应的等位片段的数量和相对分子量，获得如表3所示的等位片段信息：(1+2+3+4)(1+2+3)(1+2)(1+2+3)(1+2)，符合该等位片段组合的菌种即可确定为蟹味菇GJ5菌种。为保证鉴定的准确性，建议重复三次。
本发明还提供了蟹味菇GJ5菌株的SSR标记指纹图谱的应用，是利用蟹味菇基因组简单重复序列片段开发的5对SSR引物，通过对收集的24份白玉菇和蟹味菇栽培品种的SSR引物带型分析，本发明确定了5对SSR引物在蟹味菇GJ5菌株中扩增出的等位片段数量并编号(表3)，通过不同SSR等位片段的编号组合可有效识别蟹味菇GJ5菌株(图1)，确定菌种的等位片段编号组合为：(1+2+3+4)(1+2+3)(1+2)(1+2+3)(1+2)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 东营市菇健生物科技有限公司
<120> 一株蟹味菇GJ5菌株及其SSR标记引物和应用
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gggttttgct gttgctgct 19
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gttataatgc tggaaccgtc g 21
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
aaggttggct ggcagtgtg 19
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
tgagaagaaa aatagccaaa agg 23
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
ctggcagatt ttgaacaagt gg 22
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
tccgattttg ggcattttg 19
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
ctcctgtctc tattcccatt ctg 23
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
aggtagagaa caagcagagg agag 24
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
aacaagaaaa gagggttatg cg 22
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
atctcgcata tcccgcca 18
Claims (9)
1.蟹味菇GJ5菌株的SSR标记引物，其特征在于：所述SSR标记引物包括以下5对引物：
SSR-06正向引物：AGCTTGTACGACGAGGTCTCTG；
SSR-06反向引物：AAGGCGTAAAGTCATTCATCG；
SSR-69正向引物：ACGACGAGGTCAGAGGCAG；
SSR-69反向引物：GCTCAACAGTTATTCCTCAGTGC；
SSR-106正向引物：GGGTTTGCTGTTGCTGCT；
SSR-106反向引物：GTTATAATGCTGGAACCGTCG；
SSR-109正向引物：AAGGTTGGCTGGCAGTGTG；
SSR-109反向引物：TGAGAAGAAAAATAGCCAAAAGG；
SSR-139正向引物：AACAAGAAAAGAGGGTTATGCG；
SSR-139反向引物：ATCTCGCATATCCCGCCA；
所述蟹味菇GJ5菌株的保藏编号为CCTCC M 2020506。
2.权利要求1所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用。
3.根据权利要求2所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述鉴别蟹味菇GJ5菌株的方法包括以下步骤：
（1）提取待测菌株的菌丝或者子实体的基因组DNA；
（2）SSR分子标记检测：以提取的基因组DNA作为模板，分别用5对特异性引物进行PCR反应；
（3）电泳检测PCR产物的特异性条带；对照各SSR引物对应的等位片段的数量和相对分子量，根据等位片段组合确定蟹味菇GJ5菌株。
4.根据权利要求3所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述步骤（2）中PCR的反应体系为：总体积为15 μL，1 μL正向引物，1 μL反向引物，0.8 μL基因组DNA，7.5 μL2×Taq酶mix，4.7 μL去离子水；
PCR的反应条件为：95℃180 s；95℃15 s，56℃20 s，72℃60s ，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保温。
5.根据权利要求3所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述SSR-06引物对应的等位片段为4条，分子量分别为1→200 bp，2→1800 bp，3→2100bp，4→3000 bp。
6.根据权利要求3所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述SSR-69引物对应的等位片段为3条，分子量分别为1→210 bp；2→1300 bp；3→4500bp。
7.根据权利要求3所述的SSR标记引物在用于鉴别白蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述SSR-106引物对应的等位片段为2条，分子量分别为1→210 bp；2→5000 bp。
8.根据权利要求3所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述SSR-109引物对应的等位片段为3条，分子量分别为1→875 bp；2→1800 bp，3→2000 bp。
9.根据权利要求3所述的SSR标记引物在用于鉴别蟹味菇GJ5菌株中的应用，其特征在于：所述SSR-139引物对应的等位片段为2条，分子量分别为1→200 bp；2→1900 bp。
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