CN115927728A - 用于鉴定六妹羊肚菌zjydj001菌株的ssr分子标记引物组合及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的SSR分子标记引物组合及方法，该SSR分子标记引物组合包括MSSR029，MSSR036，MSSR041，MSSR092共4对SSR分子标记引物。基于所述SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法，按以下步骤实现：首先提取待检测六妹羊肚菌菌株的菌丝体基因组DNA，再用SSR分子标记引物组合对DNA进行PCR扩增，对扩增好的PCR产物进行进行荧光毛细管电泳检测，比对荧光峰图，即可鉴定出六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株。本发明提供的基于SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法，可在菌丝阶段对其进行快速鉴别，避免经过选育的优良菌株在生产经营和市场流通过程中与其它六妹羊肚菌菌株混杂，从而有效保护知识产权，对羊肚菌生产过程中品种的真实性鉴定具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于食用菌分子生物学领域，具体涉及用于鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的SSR分子标记引物组合及方法。
背景技术
六妹羊肚菌（Morchella sextelata M. Kuo），隶属子囊菌门Ascomycota、盘菌纲Pezizomycetes、盘菌目Pezizales，羊肚菌科Morchellaceae，是一种味道鲜美的食药兼用真菌，具有极高的营养价值。其子实体肉质脆嫩，含有丰富的蛋白质，多种维生素，铁、锌等多种矿质元素，其独特的风味受到全球美食爱好者的青睐。
野生羊肚菌广泛分布于世界各地，但资源非常有限。自1882年以来，人们一直致力于培养和驯化羊肚菌，主要以模拟自然环境出菇的仿生栽培为主。2000年后，随着外源营养袋技术的面世，羊肚菌栽培进入规模化种植阶段。近几年羊肚菌的人工种植在国内迅速扩张，全国大部分地区均有栽培。目前在我国实现人工栽培的羊肚菌为黑色羊肚菌支系的梯棱羊肚菌（M. importuna）、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌（M. eximia）、头丝羊肚菌（M. exuberans）、欧式羊肚菌（M. oweri）、Mel-13（系统发育种）和Mel-21，其中主要的栽培物种为梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌。
虽然羊肚菌已经基本实现人工栽培，但是其瓶颈问题依然存在。目前市场上的羊肚菌菌种杂乱，菌种名称混乱，菌种质量参差不齐，是出菇不稳定、产量低、重复性差等问题出现的主要原因。筛选合适的分子标记对羊肚菌栽培品种的准确鉴定、知识产权保护和新品种选育具有重要意义。
简单重复序列SSR（simple sequence repeat）是一类由1-6个碱基组成的基本串联重复核苷酸序列，也称微卫星序列。SSR分子标记是基于重复序列两侧特定的保守序列设计引物，来扩增检测重复序列长短差异的DNA分子标记。SSR分子标记因其多态性高、重复性好、共显性、分布均匀、覆盖面广等优点，广泛应用于生物遗传图谱绘制、遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位和分子标记辅助育种等方面。
现有的关于羊肚菌SSR分子标记的研究大多基于不同物种的羊肚菌菌株的遗传多样性分析，针对六妹羊肚菌物种内的分子标记开发研究尚未见报道。因此，根据上述羊肚菌种业的发展现状，结合现代分子生物学技术开发精准有效的六妹羊肚菌菌株品种鉴定方法对于羊肚菌的产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供用于鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的SSR分子标记引物组合，本发明的第二目的在于提供基于所述SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法。
本发明中六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株已于2022年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；保藏编号为CGMCC NO.40183。
本发明的第一目的是这样实现的，用于鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的SSR分子标记引物组合，包括MSSR029，MSSR036，MSSR041，MSSR092共4对SSR分子标记引物，各引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-8所示。
本发明的第二目的是这样实现的，一种基于所述SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法，按以下步骤实现：
1）DNA提取：提取待检测六妹羊肚菌菌株的菌丝体基因组DNA；
2）SSR分子标记的扩增：采用所述SSR分子标记引物组合提取的DNA进行PCR扩增；
3）荧光毛细管电泳检测分析：将步骤2）扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并拍摄胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度，进行荧光毛细管电泳检测，比对荧光峰图，即可鉴定出六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次基于六妹羊肚菌转录组测序数据，开发出ZJYDJ001菌株专一性的SSR分子标记引物组合，应用该SSR分子标记引物组合对六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株进行PCR特异扩增，结合准确定量的毛细管电泳荧光检测方法，产生特异性图谱，从而可方便快捷地将ZJYDJ001菌株与其他待测六妹羊肚菌菌株区分开，具有高效快捷、结果准确、成本较低的优势，具有良好的应用前景。
2、本发明提供的基于SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法，在菌丝阶段就可对六妹羊肚菌ZJYDJ001进行快速鉴别，避免经过选育的优良菌株在生产经营和市场流通过程中与其它六妹羊肚菌菌株混杂，从而有效保护六妹羊肚菌ZJYDJ001的知识产权，对羊肚菌生产过程中品种的真实性鉴定具有重要意义。
附图说明
图1为引物MSSR029、MSSR036、MSSR041、MSSR092在六妹羊肚菌M121（ZJYDJ001）菌株中检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图2为引物MSSR029、MSSR036、MSSR041、MSSR092在六妹羊肚菌M36菌株中检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图3为引物MSSR029、MSSR036、MSSR041、MSSR092在六妹羊肚菌M57菌株中检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图4为引物MSSR029、MSSR036、MSSR041、MSSR092在六妹羊肚菌M63菌株中检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图5为引物MSSR029、MSSR036、MSSR041、MSSR092在六妹羊肚菌M97菌株中检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图6为基于SSR分子标记引物构建的41株六妹羊肚菌的UPGMA聚类树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 六妹羊肚菌SSR分子标记引物组合的确定
将来源于不同产地的3个六妹羊肚菌菌株（M28、M43、M63）转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上，20℃培养10-14d后将长满菌丝的平板寄送至武汉天一华煜基因科技有限公司进行转录组测序。
根据六妹羊肚菌转录组数据设计96对SSR位点引物用8个样品进行初筛，荧光PCR扩增产物取2uL进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%浓度），通过PCR产物的带型来判断各SSR引物扩增的特异性，通过PCR产物条带的亮度来判断各SSR引物的扩增效率，按照样本上机检测浓度要求，对各荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物，安排上ABI 3730xl测序仪进行荧光毛细管电泳检测。从ABI 3730xl仪器上导出.fsa格式原始数据，按检测位点进行分类归档后，分别导入到GeneMarker分析软件。根据分析结果，筛选出特异性高，多态性好的4对引物，如表1所示。
表1 SSR标记引物信息列表
实施例2 利用上述SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌菌株
1、六妹羊肚菌菌株培养
将待检测六妹羊肚菌菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上，20℃培养10-14d后收集菌丝。
2、总DNA提取
使用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取样品总DNA，具体步骤如下：
2.1 取适量（10～100mg）新鲜菌丝放入干净的研钵中，加入液氮，使菌丝冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状；
2.2 加入600μL PBS缓冲液和0.9μL RNaseA贮存液，用力研磨30s；
2.3 将研磨好的匀浆转移至2mL离心管中；
2.4 加入150μL Buffer C-L和20μL Proteinase K，立即漩涡振荡1min混合均匀；短暂离心后，将离心管置于56℃水浴10min；
2.5 加入350μL Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12000×g离心10min；
2.6 将DNA制备管置于2mL离心管中，将步骤5的离心后上清液移至制备管中，12000×g离心1min；
2.7 弃滤液，将制备管置回原来的2mL离心管中，加入500μL Buffer W1，12000×g离心1min；
2.8 弃滤液，将制备管置回原来的2mL离心管中，加入700μL Buffer W2，12000×g离心1min；以同样方法，用700μL Buffer W2再洗涤一次；
2.9 弃滤液，将制备管置回原来的2mL离心管中，12000×g离心1min；
2.10 将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加100μL去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱DNA，后放置于-20℃备用。
3、SSR-PCR扩增及产物检测
3.1荧光引物合成及PCR扩增
用筛选出的4对特异引物对所有样本DNA进行SSR-PCR扩增，扩增体系及反应条件如表2所示：
表2 PCR扩增体系和反应条件
荧光引物合成、PCR产物测序由武汉天一华煜基因科技有限公司完成。
41株六妹羊肚菌菌株信息如表3所示：
表3 41株六妹羊肚菌菌株来源信息
3.2 电泳检测
为了确保荧光PCR扩增的特异性和上机检测样本的浓度均一性，荧光PCR扩增完成后，取2uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%浓度），通过PCR产物的带型来判断各SSR引物扩增的特异性，通过PCR产物条带的亮度来判断各SSR引物的扩增效率，按照样本上机检测浓度要求，对各荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物，安排上测序仪进行检测。
3.3 荧光毛细管电泳检测
将稀释为统一浓度的荧光PCR产物加至上机板中，并按表4体系分别加入上机检测试剂：
表4 上机检测试剂
3.4 从ABI 3730xl仪器上导出.fsa格式原始数据，按检测位点进行分类归档后，分别导入到GeneMarker分析软件中，进行基因型数据的读取，并按位点名称分别导出Excel基因型原始数据和PDF分型峰图文件，见图1-5（注：附图中除ZJYDJ001菌株的峰图外，另随机选取4株菌株的峰图）。
结果：分析比较峰图，可以看到41株六妹羊肚菌菌株的每个荧光标记出现的峰均不重叠，有些菌株有2个峰值，清晰可辩，且具有特异性。不同群体的样品有明显差别。说明本发明提供的4对SSR分子标记引物能够准确地将六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株与其他商业化栽培的六妹羊肚菌菌株区分开。
4、基于SSR分子标记位点的聚类分析
在powermarker中对样品间的遗传距离进行计算。采用基于Nei遗传距离的非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，并绘制聚类图，见图2。
结果：由图6可知，本发明提供的4对SSR分子标记引物的UPGMA聚类能够将六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株聚类为单独的一支，完全与其他商业化栽培的六妹羊肚菌菌株区分开。由此可见，本发明提供的六妹羊肚菌SSR分子标记引物组合可以应用于六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的鉴定。
Claims (3)
1.用于鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述SSR分子标记引物组合包括MSSR029，MSSR036，MSSR041，MSSR092共4对SSR分子标记引物，各引物对的核苷酸序列分别为：
MSSR029-F：AAGCCCGTGAGTTGACCTAA，
MSSR029-R：CATGCCATGTCCATTCTCAG；
MSSR036-F：ATCTGTGTCCCAACTACCGC，
MSSR036-R：AGTCCTGAGGATGCATGGAC；
MSSR041-F：TTTGTAGCACCCACCTCACA，
MSSR041-R：TATCTGGCTGTCGCTGTCAC；
MSSR092-F：TGGTGAGGTAGGTTTGGAGC，
MSSR092-R：AGGTGGTGATCAATGAAGGC。
2.一种基于权利要求1所述SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法，其特征在于，按以下步骤实现：
1）DNA提取：提取待检测六妹羊肚菌菌株的菌丝体基因组DNA；
2）SSR分子标记的扩增：采用权利要求1的SSR分子标记引物组合提取的DNA进行PCR扩增；
3）荧光毛细管电泳检测分析：将步骤2）扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并拍摄胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度，进行荧光毛细管电泳检测，比对荧光峰图，即可鉴定出六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株。
3.根据权利要求2所述SSR分子标记引物组合鉴定六妹羊肚菌ZJYDJ001菌株的方法，其特征在于，菌丝体基因组DNA提取的方法如下：
A、将待检测六妹羊肚菌菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，20℃培养10-14d后收集菌丝；
B、使用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和质量即可。
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| CN (1) | CN115927728A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116334298A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-06-27 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种六妹羊肚菌ssr分子标记、引物组及其应用 |
| CN116640871A (zh) * | 2023-04-25 | 2023-08-25 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种梯棱羊肚菌ssr分子标记及其引物和应用 |
| CN116751879A (zh) * | 2023-04-25 | 2023-09-15 | 中国科学院昆明植物研究所 | 七妹羊肚菌的ssr微卫星分子标记及其引物组和应用 |
-
2022
- 2022-11-22 CN CN202211465723.XA patent/CN115927728A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116640871A (zh) * | 2023-04-25 | 2023-08-25 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种梯棱羊肚菌ssr分子标记及其引物和应用 |
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| CN116640871B (zh) * | 2023-04-25 | 2024-08-27 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种梯棱羊肚菌ssr分子标记及其引物和应用 |
| CN116334298A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-06-27 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种六妹羊肚菌ssr分子标记、引物组及其应用 |
| CN116334298B (zh) * | 2023-05-23 | 2023-09-19 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种六妹羊肚菌ssr分子标记、引物组及其应用 |
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