CN117385086B

CN117385086B - 节瓜种质资源ssr标记引物及指纹图谱的构建方法

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Publication number: CN117385086B
Application number: CN202311593803.8A
Authority: CN
Inventors: 王敏; 杨松光; 彭庆务; 曹振强; 刘文睿; 陈林; 江彪; 谢大森
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2023-11-27
Filing date: 2023-11-27
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2043-11-27
Also published as: CN117385086A

Abstract

本发明公开了一种节瓜种质资源SSR标记引物及指纹图谱的构建方法，所述SSR标记引物包括序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的四对引物中的至少三对。在本发明中，以24个节瓜种质资源为研究对象，筛选出可以稳定扩增、多态性好，能够明显地分辨24个节瓜品种的4对SSR标记引物，利用这4对SSR标记引物的至少三对，对节瓜种质资源进行扩增，可以扩增出可稳定扩增、差异明显、多态性好的条带，从而构建得到了节瓜种质资源的指纹图谱。本发明的SSR标记引物可以为以后品种的鉴定、遗传改良以及优质的品种推广提供一定的依据。

Description

节瓜种质资源SSR标记引物及指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种节瓜种质资源SSR标记引物、以及节瓜种质资源指纹图谱的构建方法。

背景技术

节瓜有清热解暑、解毒利尿的功效，其肉质鲜嫩、富含多种营养物质。

由于节瓜品种不断增多，品种真假性及种子纯度问题日益明显，通过传统方法(叶形，株高，瓜形，产量等)对不同节瓜品种进行鉴定，花费时间长，受环境影响大，其结果的可靠性较低，且费用高，已经无法满足育种家及市场的需求。

DNA分子标记技术(SSR、AFLP、ISSR、SRAP等)几乎不受环境因素影响，可从分子水平上可以快速、精确的鉴定品种，并进行遗传分析和分子辅助育种。现水稻、玉米、黄瓜、茄子等多种作物已经构建了DNA分子植物图谱，通过植物图谱鉴定种子纯度，对品种进行鉴别分类。目前，在葫芦科其他作物上利用SSR标记已经构建了相关的指纹图谱。苗晗等利用35对均匀分布在不同染色体上的SSR引物构建了数字化指纹图谱，且可以将116份黄瓜品种完全区分开来；王蕾等利用17对条带清晰、多态性高的SSR引物构建的指纹图谱可以有效的区分32份黄瓜品种，并且为每一份材料建立了独特的DNA图谱；在西瓜上，李超汉等人利用16对西瓜核心SSR荧光标记引物，采用毛细管电泳，构建了16份西瓜种质资源的DNA指纹图谱冬瓜品种；2012年宋海斌等人建立了甜瓜品种的DNA指纹数据库，其筛选出18对引物对105份材料形成了多态性指纹图谱，实现了对甜瓜品种快速、准确的鉴定。

节瓜遗传基础比较薄弱，变异狭窄，SSR分子标记技术在节瓜上的应用较少，李兆龙等利用分子标记对节瓜抗枯萎病基因研究；朱冬冬等利用ISSR标记对节瓜果皮颜色的相关基因分析。目前关于节瓜种质资源指纹图谱的构建尚未见报道。为了快速准确鉴定不同的节瓜种质资源，构建节瓜种质资源指纹图谱非常有必要。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种节瓜种质资源SSR标记引物及节瓜种质资源指纹图谱的构建方法。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种节瓜种质资源SSR标记引物，所述SSR标记引物包括序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的四对引物的至少三对引物。

本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，包括上述节瓜种质资源SSR标记引物。

本发明的第三方面，提供了上述节瓜种质资源SSR标记引物或试剂盒在构建节瓜种质资源指纹图谱中、在鉴定节瓜种质资源中或在节瓜种质资源遗传育种中的应用。

本发明的第四方面，提供了一种节瓜种质资源指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：利用上述节瓜种质资源SSR标记引物，对节瓜种质资源的DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增条带进行归类标记，即为节瓜种质资源指纹图谱。

本发明的第五方面，提供了上述方法构建得到的节瓜种质资源指纹图谱。

本发明的第六方面，提供了上述节瓜种质资源指纹图谱在鉴定节瓜种质资源中的应用。

本发明的第七方面，提供了一种鉴定节瓜种质资源的方法，包括以下步骤：利用上述节瓜种质资源SSR标记引物，对待测节瓜种质资源DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增条带与构建得到的节瓜种质资源指纹图谱进行比对，鉴定节瓜种质资源的种类。

在本发明中，以24个节瓜种质资源为研究对象，筛选出可以稳定扩增、多态性好，能够明显地分辨24个节瓜品种的4对SSR标记引物，利用这4对SSR标记引物的至少三对引物，对节瓜种质资源进行扩增，可以扩增出可稳定扩增、差异明显、多态性好的条带，从而可构建得到节瓜种质资源的指纹图谱。本发明的SSR标记引物可以为以后品种的鉴定、遗传改良以及优质的品种推广提供一定的依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用20对SSR引物对24个节瓜品种进行PCR扩增的图谱；其中，M表示Marker；每对SSR引物对应的图谱，从左到右依次为1-24，对应表1中的24个节瓜品种。

图2为本发明实施例2中利用3对SSR引物对15个节瓜品种进行PCR扩增的图谱；其中，从左到右依次为M、1～15，1～15对应表4中的15个节瓜品种。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

在本发明中，首先从节瓜近缘种冬瓜引物中初步筛选出20对冬瓜引物，作为节瓜种质资源SSR标记引物的候选引物，再使用这20对冬瓜引物，对24个节瓜种质资源进行扩增，发现这20对冬瓜引物中有4对引物，在24个节瓜品种中可以稳定扩增、多态性好，能够明显地分辨24个节瓜品种，因此，这4对引物可以作为构建节瓜种质资源指纹图谱的SSR标记引物，分别命名为：SSR2c077、SSR6c052、SSR6c084、SSR1c020。再进一步地，利用这4对SSR标记引物，共扩增出96条可稳定扩增、差异明显、多态性好的条带，可以构建得到了24个节瓜种质资源的指纹图谱，有效区分24种节瓜品种。此外，本发明以这4对SSR标记引物的其中三对，对15种节瓜材料进行了进一步的验证，发现也可以扩增出可稳定扩增、差异明显、多态性好的条带，因此，4对SSR标记引物的至少三种的组合，均可以用于鉴定节瓜品种。本发明筛选得到的4对SSR标记引物，使分子数据与传统形态学信息相结合，成为更加高效、便捷的品种鉴定、选育等技术支撑，构建得到的24个节瓜品种的指纹图谱，可以为以后品种的鉴定、遗传改良以及优质的品种推广提供一定的依据。

在本发明的其中一些实施例中，公开了一种节瓜种质资源SSR标记引物，所述SSR标记引物包括序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的四对引物的至少三对引物。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述节瓜种质资源SSR标记引物。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述节瓜种质资源SSR标记引物或所述试剂盒在构建节瓜种质资源指纹图谱中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述节瓜种质资源SSR标记引物或所述试剂盒在鉴定节瓜种质资源中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述节瓜种质资源SSR标记引物或所述试剂盒在节瓜种质资源遗传育种中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种节瓜种质资源指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：利用上述节瓜种质资源SSR标记引物，对节瓜种质资源的DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增条带进行归类标记，即为节瓜种质资源指纹图谱。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系：TaqMasterMix 5±1μL、模板DNA1±0.1μL、正向引物1±0.1μL、反向引物1±0.1μL、超纯水加至10μL。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述方法构建得到的节瓜种质资源指纹图谱。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述节瓜种质资源指纹图谱在鉴定节瓜种质资源中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种鉴定节瓜种质资源的方法，包括以下步骤：利用上述节瓜种质资源SSR标记引物，对待测节瓜种质资源DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增条带与上述节瓜种质资源指纹图谱进行比对，鉴定节瓜种质资源的种类。

在以下实施例中，EDTA-Na₂、CTAB、Tris、聚丙烯胺均由GENVIEW公司生产；甲叉双丙烯酰胺由广州华奇盛生物技术有限公司生产；2xEsTaqMaster Mix(CW0690L)由康维世纪生产公司生产；引物由上海生工生物技术服务有限公司合成；低温高速离心机Eppendorf(5417R)；组织破碎机为MPBIO(FastPrep^R-24)；电热恒温水浴锅购自上海仪表供销公司(HWS-12)；PCR仪Bio-RadLaboratoriesf(T100^TMThermalCycler)；电泳槽购自北京鸿涛基业科技有限公司(HT-Scz04B)；脱色摇床购自常州丹瑞实验设备有限公司(TS-1)。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1节瓜种质资源SSR标记引物的筛选

1、试验材料

选用24份节瓜材料(由广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究一室提供，表1)，于2018-2019年广东省农业科学院白云试验基地进行育苗，在节瓜长出2片真叶时，以每个品种种植30株移入田间进行常规的栽培管理标号挂牌，随机挑选10株且用挂牌标记编号，用于SSR标记引物筛选。

表1

序号	品种名称	序号	品种名称	序号	品种名称
						1	e-9-14-2	9	2013-4-2-1-2(1)-1	17	AF202
2	yB2Xg1-4(2)	10	g(1)-4-2-3	18	山水节瓜
						3	g1(4)	11	e-9-7	19	大绿-5-1-1
4	新秀2号	12	长宝玉-2	20	美丽高产
						5	冠华5号	13	P440683007	21	小籽黄毛-1-2
6	冠玉1号	14	75--1-1	22	润丰1号
						7	b-2-4-1	15	21-1-1-2-2	23	GVD09B-36
8	11号-1-B	16	A39FA	24	GDV09B0044

2、实验方法

(1)、采样

采集授粉前的节瓜嫩叶，用封口袋装好放入液氮冷冻保存。之后将适量叶片加入有钢珠的离心管(2.0ml)中，并进行标记，置于-20℃冰箱保存。

(2)、DNA提取

将准备好的24份材料用机磨法在组织破碎机中打碎，研磨后的粉末状材料用CTAB提取法提取基因组DNA，提取DNA用50A的超纯水置于4℃冰箱溶解一天，之后用NanoDrop2000核酸蛋白分析仪分别测定DNA的浓度。根据实际情况，稀释到适当的工作液保存。

(3)、节瓜种质资源SSR标记引物的筛选

使用前期筛选的扩增条带带型清晰稳定，主带明显，差异性较大的20对SSR引物(由上海生工生物技术服务有限公司合成)，作为SSR标记引物的候选引物，分别在节瓜种质资源中进行PCR扩增及电泳检测。SSR引物如表2所示。

表2

反应体系：2xES Taq MasterMix 5μL，模板DNA 1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、超纯水2μL，总共10μL。

扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min，4℃保存。

电泳检测：PCR产物采用6％的非变性聚丙酰胺凝胶，在180V电泳240min后，进行银染显色，获得扩增条带。

20对冬瓜引物对节瓜种质资源的扩增结果如图1所示。从图1可知，20对引物中有4对引物SSR2c077、SSR6c052、SSR6c084和SSR1c020，在24个节瓜品种中稳定扩增、多态性好，可以明显地分辨24个节瓜品种。这4对引物可以作为构建节瓜种质资源指纹图谱的SSR标记引物，其核苷酸序列分别如下：

SSR2c077：

TAGGAGGTGGGTGGGTTCAA(SEQ ID NO.1)

TCTCCCACACAATCTGTTGAA(SEQ ID NO.2)

SSR6c052：

GTGACGTTGGATGGGACTCC(SEQ ID NO.3)

GGAAAGGAGCGAACCCATCA(SEQ ID NO.4)

SSR6c084：

GGTGCTCGTGATTTTCGCTT(SEQ ID NO.5)

TCCTCCTTCATTTCTCGCTCT(SEQ ID NO.6)

SSR1c020：

AACTTTTGCCGGATTGGGGA(SEQ ID NO.7)

ACCTAGACCTTTGATTTTGAAGGGT(SEQ ID NO.8)

图1共扩增出96条可稳定扩增、差异明显、多态性好的条带，可以有效区分24种节瓜品种。

为了有效地区分SSR标记引物扩增的各个带型，将有无条带分别标记为1和0，根据带型差异性将各品种归类标记，利用表格工具整理记录，构建指纹图谱(表3)。

表3

注:1、2、3、4表示多态性位点编号。

实施例2利用节瓜种质资源SSR标记引物鉴定节瓜种类的准确性

为了进一步验证本发明筛选的节瓜种质资源SSR标记引物鉴定节瓜种类的准确性，随机挑选了3对引物(SSR6c052和SSR6c084，SSR1c020)，对15份节瓜材料(由广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究一室提供)进行扩增。扩增反应体系和扩增程序同实施例1。结果如图2和表4所示。

表4

结果显示，不同材料间的扩增条带不同，可以区分出不同的节瓜材料。因此，利用本发明筛选的节瓜种质资源SSR标记引物，来鉴定不同的节瓜种类，具有很高的准确性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种节瓜种质资源SSR标记引物，其特征在于，所述SSR标记引物包括序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示的四对引物的至少三对引物。

2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的节瓜种质资源SSR标记引物。

3.权利要求1所述的节瓜种质资源SSR标记引物或权利要求2所述的试剂盒在构建节瓜种质资源指纹图谱中的应用。

4.权利要求1所述的节瓜种质资源SSR标记引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定节瓜种质资源中的应用。

5.一种节瓜种质资源指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1所述的节瓜种质资源SSR标记引物，对节瓜种质资源的DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增条带进行归类标记，即为节瓜种质资源指纹图谱。

6.根据权利要求5所述的节瓜种质资源指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系：TaqMasterMix 5±1μL、模板DNA 1±0.1μL、正向引物1±0.1μL、反向引物1±0.1μL、超纯水加至10μL；和/或所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。

7.权利要求5或6所述的构建方法在鉴定节瓜种质资源中的应用。

8.一种鉴定节瓜种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1所述的节瓜种质资源SSR标记引物，对待测节瓜种质资源DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增条带与权利要求5或6所述的构建方法构建得到的节瓜种质资源指纹图谱进行比对，鉴定节瓜种质资源的种类。