CN105969862A - 十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，该方法包括以下步骤：⑴使用改良的CTAB法提取三个相互之间地理间隔超过300 km的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA；⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA混合，检测总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序；⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计；⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃的SSR引物；⑸利用SSR引物对三个居群的黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序、验证，获得具有多态性的12对引物；⑹计算等位基因数N _a、单倍型多样性H _d遗传分化系数F _ST、核苷酸多样性P _i 、G _ST以及π值。本发明有利于大规模的研究。

Description

十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法

技术领域

本发明涉及真菌小尺度范围群落结构、遗传多样性技术领域，尤其涉及十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法。

背景技术

黄绿卷毛菌（Floccularia luteovirens）隶属于伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae），是一种主要分布在青藏高原的产子实体的外生菌根真菌。由于其子实体色泽嫩黄、口味鲜美、营养丰富，长久以来一直被作为青藏高原特色美食、有着较高的经济价值。

目前，人类对青藏高原广泛分布的、在高寒草甸脆弱生态系统中发挥重要作用的该菌缺乏必要的了解，比如其生殖方式、分布情况和小尺度空间遗传结构等。

基株（genet）是指在一定空间范围内一组在遗传学上一致的个体的集合，对于菌根真菌来说通常是指由同一菌丝体发展而成的子实体的集合。研究ECM基株，有助于了解其分布模型、生殖状况以及在特定环境中的生态策略。关于ECM基株的研究一直受到基因型辨认尤其是同种真菌基因型辨认困难问题的困扰。传统的方法是利用同工酶以及营养体不亲和性（SI）进行研究：遗传背景相似的菌丝能够相互融合，而遗传距离较远者接触后会形成反应区域。但是，这种方法要求在实验之前从子实体上分离组织进行菌丝培养，很有可能会造成实验材料的损失，并且它反映出的差异主要是和拮抗反应相关的位点而不是整个基因组的差异，所以遗传多样性很有可能会被低估。

近20年来兴起的研究DNA多态性的方法能够快速准确的判定大量同种不同个体ECM的基因型，为大规模研究ECM种群结构及基株分布做出了重要的贡献。微卫星标记（SSR）包含1~6个核苷酸的重复序列，它存在于大多数真核生物的基因组中的蛋白质编码与非编码区，有着丰富的数量以及较高的个体间的多态性（每一代每个位点的变异数为10^-2-10^-6个碱基）。而如此高的变异率主要来自DNA重组时发生的错误、不等交换和在复制或者修复过程中产生的聚合酶滑动造成的。由于SSR具有突变速率快、多态性高、共显性且引物具有一定的种间的通用性，因此近年来广泛的应用于ECM基株的相关研究当中。但是，目前广泛使用的微卫星数据分析方法（分析电泳条带）极有可能会受到无效等位基因（Nullalleles）的干扰从而降低杂合度，而利用微卫星PCR扩增结果直接测序是一种很好的解决方案。虽然，之前的研究已经开发了该物种的EST-SSR引物，但是编码区的SSR序列多态性较低，不足以完成小尺度空间遗传结构研究。因此，有必要重新开发适于测序分析的核基因SSR引物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利于大规模研究的十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法。

为解决上述问题，本发明所述的十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：

⑴使用改良的CTAB法提取三个相互之间地理间隔超过300 km的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA；

⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA进行混合后，检测所述总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序；

⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测所述总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计；

⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃并产生唯一、明亮条带的SSR引物；

⑸利用所述SSR引物对三个居群的所述黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序及多态性验证，获得具有多态性的12对引物：

GSSR3L引物的上游引物有20个碱基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20个碱基GAGCGCAACCCCTGTATATC；

GSSR6L引物的上游引物有20个碱基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20个碱基CACTGCACCAAATAGCCAAG；

GSSR7L引物的上游引物有20个碱基 AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20个碱基CGACACTCGTTTGTGCTGTT；

GSSR9L引物的上游引物有21个碱基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20个碱基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT；

GSSR11L引物的上游引物有20个碱基 TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20个碱基TGCCGTTGGACATTTCTATG；

GSSR26L引物的上游引物有20个碱基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21个碱基GACGGAGCTTGAGAAGTTGG；

GSSR33L引物的上游引物有23个碱基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22个碱基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC；

GSSR36L引物的上游引物有20个碱基GCACGATCAATATGTTGGAC，其下游引物有21个碱基AGACACAGCCGCTACTCGTGA；

GSSR45L引物的上游引物有20个碱基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；

GSSR46L引物的上游引物有21个碱基 TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；

GSSR47L引物的上游引物有21个碱基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21个碱基TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT；

GSSR49L引物的上游引物有20个碱基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20个碱基TTGGACCCTCTTTTCCATCA；

⑹利用软件Genalex 6.5计算等位基因数N _a、单倍型多样性H _d遗传分化系数F _ST、核苷酸多样性P _i 、G _ST以及π值。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过开发用于测序分析的SSR引物，不但能够消除传统分析方法存在的无效等位基因的干扰，而且免除了做PAGE胶分析的繁琐步骤，更有利于大规模的研究。

2、本发明所得的SSR引物各个条带的研究精度能够精确到1 bp，极大地提高了研究的准确性。

3、应用本发明所得到的引物扩增来自3个居群63个个体的黄绿卷毛菌，均具有较高的多态性。同时，发现有5对具有多态性的引物其多态性不仅是微卫星重复单元数量的变化造成的，并且各个微卫星重复单元也存在碱基的碱基置换（图1）。这一发现，能够使相关的研究结果更加的精确。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明涉及到重复序列突变的测序峰图（引物GSSR47L）。

图2为总DNA提取电泳图。

具体实施方式

十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：

⑴使用改良的CTAB法提取三个相互之间地理间隔超过300 km的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA。

⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA进行混合后，检测总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序。

⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计。

其中：SR search 软件分为3个模块：第一个模块是用于检测DNA序列所有简单重复序列，第二个模块是对第一个模块的结果进行过滤去掉距离过近的简单重复序列，第三个模块是运用primer3进行引物设计。

⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃并产生唯一、明亮条带的SSR引物。

⑸利用SSR引物对三个居群的黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序及多态性验证，获得具有多态性的12对引物：

GSSR3L引物的上游引物有20个碱基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20个碱基GAGCGCAACCCCTGTATATC；

GSSR6L引物的上游引物有20个碱基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20个碱基CACTGCACCAAATAGCCAAG；

GSSR7L引物的上游引物有20个碱基 AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20个碱基CGACACTCGTTTGTGCTGTT；

GSSR9L引物的上游引物有21个碱基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20个碱基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT；

GSSR11L引物的上游引物有20个碱基 TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20个碱基TGCCGTTGGACATTTCTATG；

GSSR26L引物的上游引物有20个碱基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21个碱基GACGGAGCTTGAGAAGTTGG；

GSSR33L引物的上游引物有23个碱基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22个碱基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC；

GSSR36L引物的上游引物有20个碱基GCACGATCAATATGTTGGAC，其下游引物有21个碱基AGACACAGCCGCTACTCGTGA；

GSSR45L引物的上游引物有20个碱基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；

GSSR46L引物的上游引物有21个碱基 TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；

GSSR47L引物的上游引物有21个碱基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21个碱基TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT；

GSSR49L引物的上游引物有20个碱基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20个碱基TTGGACCCTCTTTTCCATCA。

⑹利用软件Genalex 6.5计算等位基因数N _a、单倍型多样性H _d遗传分化系数F _ST、核苷酸多样性P _i 、G _ST以及π值。

实施例 十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：

⑴使用改良的CTAB法提取下述三个菌群的63个个体的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA（参见表1）。

表1黄绿卷毛菌（F. luteovirens）样品采集信息

具体步骤如下：

①称取0.5 g硅胶干燥并经烘箱45℃烘干后的子实体菌柄与菌盖交界处的内部组织，在研钵中加入液氮预冷，加入0.2 g PVP粉，将材料放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末；

②转入1.5 ml离心管中，加入600 μL 65℃预热的BI溶液，65℃水浴震荡10 min，4℃、10000 rmin离心10 min，弃上清液A；

③加入1 ml 65℃预热的CTAB提取缓冲液和12 μLβ-巯基乙醇，放入65℃恒温水浴锅中60 min，期间10 min将离心管取出摇匀；

④加入8 μL β-巯基乙醇和1000 μL 3×CTAB，轻弹使沉淀悬浮，放入65℃水浴恒温震荡箱中摇60 min，期间每隔10 min将离心管取出摇匀；

⑤加入600 μL的CI，缓慢摇晃10 min，使内含物充分混匀形成乳浊液，4℃、10000 rmin低温高速离心10 min使其分层，取上清液B到另一个1.5 ml离心管中；

⑥重复上一步2遍；

⑦在上清液B中加入600 μL在-20℃预冷的异丙醇，摇匀，放到-20℃冰箱中沉淀1~2 h；

⑧4℃、10000 rmin低温高速离心10 min，弃上清液C，收集沉淀；

⑨重复上一步2~3遍，然后将沉淀放入37℃恒温箱干燥或室温自然风干；

⑩用100 μL三蒸水溶解沉淀，4 ℃过夜，再用1%琼脂糖凝胶检测DNA的产量与质量，见图2。

⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA进行混合后，检测总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序。

⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计。

其中：

SR search 软件分为3个模块：第一个模块是用于检测DNA序列所有简单重复序列，第二个模块是对第一个模块的结果进行过滤去掉距离过近的简单重复序列，第三个模块是运用primer3进行引物设计。

SSR检测标准如下：

①SSR重复单元的最小长度为2。

②SSR重复单元的最大长度为6。

③SSR序列的最小长度为12。

④SSR上下游序列长度为100 bp。

⑤两个SSR的最小距离为12 bp。

⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃并产生唯一、明亮条带的SSR引物。具体如下：

PCR扩增体系：

扩增PCR反应体系：25 μL 内含ddH₂O 19.3 μL，10×Buffer（+Mg²⁺）2.5 μL，dNTP（10mM）0.5 μL，前引物（10mM）0.5 μL，后引物（10 mM）0.5 μL，Taq polymerase（5U/μL）0.5 μL，0.2μL DNA模板（15 ng）1.5 μL。

扩增条件：95℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，50~60℃退火40 s，72℃延伸55s，共34个循环，最后72℃延伸10 min。

该体系反应完成之后用凝胶成像电泳检测所的产物，看是否有良好条带，对于有良好条带的SSR引物，即为符合筛选要求的SSR引物，选择其中较亮条带对应的退火温度进行下一步操作。

⑸利用能够产生唯一、明亮条带的SSR引物对三个居群的黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序及多态性验证，获得具有多态性的12对引物。具体步骤如下：

利用所得符合条件的SSR引物用3个居群的63个DNA样本（表1）分别在最适退火温度下进行PCR扩增。

扩增PCR反应体系：25 μL 内含ddH₂O 19.3 μL，10×Buffer（+Mg²⁺）2.5 μL，dNTP（10mM）0.5 μL，前引物（10 mM）0.5 μL，后引物（10 mM）0.5 μL，Taq polymerase（5U/μL）0.5μL，0.2 μL DNA模板（15 ng）1.5 μL。

扩增条件：95℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，最适退火温度40 s，72℃延伸55s，共34个循环，最后72℃延伸10 min。

PCR完成后，样品经纯化后在中国科学院西北高原生物研究所适应与进化重点实验室测序，得到12对具有多态性的SSR引物（表2）之后上传至GenBank 获得GenBankaccession numbers 。

表2 12对SSR引物序列及多增片段长度

⑹利用软件Genalex 6.5计算等位基因数N _a、单倍型多样性H _d遗传分化系数F _ST、核苷酸多样性P _i 、G _ST以及π值。

PCR扩增、测序后用Chromas和MEGA 5.1等软件进行校正和比对。用Genalex 6.5计算等位基因数N _a、单倍型多样性H _d遗传分化系数F _ST、核苷酸多样性P _i 、G _ST以及π值。结果显示，所有筛选得到的12对SSR引物在三个居群中均具有较高的多态性，能够满足进一步研究的要求。（表3、表4）。

表3 各引物多态性参数计算

表4 利用三个居群的黄绿卷毛菌验证微卫星引物的多态性

Claims (1)

1.十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：

⑴使用改良的CTAB法提取三个相互之间地理间隔超过300 km的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA；

⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA进行混合后，检测所述总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序；

⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测所述总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计；

⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃并产生唯一、明亮条带的SSR引物；

⑸利用所述SSR引物对三个居群的所述黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序及多态性验证，获得具有多态性的12对引物：

GSSR3L引物的上游引物有20个碱基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20个碱基GAGCGCAACCCCTGTATATC；

GSSR6L引物的上游引物有20个碱基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20个碱基CACTGCACCAAATAGCCAAG；

GSSR7L引物的上游引物有20个碱基 AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20个碱基CGACACTCGTTTGTGCTGTT；

GSSR9L引物的上游引物有21个碱基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20个碱基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT；

GSSR11L引物的上游引物有20个碱基 TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20个碱基TGCCGTTGGACATTTCTATG；

GSSR26L引物的上游引物有20个碱基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21个碱基GACGGAGCTTGAGAAGTTGG；

GSSR33L引物的上游引物有23个碱基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22个碱基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC；

GSSR36L引物的上游引物有20个碱基GCACGATCAATATGTTGGAC，其下游引物有21个碱基AGACACAGCCGCTACTCGTGA；

GSSR45L引物的上游引物有20个碱基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；

GSSR46L引物的上游引物有21个碱基 TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；

GSSR47L引物的上游引物有21个碱基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21个碱基TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT；

GSSR49L引物的上游引物有20个碱基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20个碱基TTGGACCCTCTTTTCCATCA；

⑹利用软件Genalex 6.5计算等位基因数N _a、单倍型多样性H _d遗传分化系数F _ST、核苷酸多样性P _i 、G _ST以及π值。