CN108642209A - 一种小麦植株千粒重判断标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，提供一种小麦植株千粒重判断标记及其应用。该标记为CAPS标记，命名为JHMfeI，序列如SEQ ID NO.1所示，利用标记引物JHMfeI‑F：GGAGGAAACAAAGTGGTC，JHMfeI‑R：GAGAAGAGGAGGTCGTAG对小麦基因组进行扩增，获得扩增产物。其中携带JHMfeI‑a类型(扩增产物片段大小为399bp和90bp)的小麦植株比携带JHMfeI‑b类型(扩增产物片段大小为489bp)的小麦植株千粒重更高。本发明开发出的CAPS标记JHMfeI可以有效区分千粒重高低，用于小麦高产分子聚合育种，拓宽小麦育种材料的遗传基础。

Description

一种小麦植株千粒重判断标记及其应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，涉及小麦植株千粒重判断标记及其应用。

背景技术

小麦是全球约35-40％人口的主食，中国是全球最大的小麦生产国和消费国，常年产量约占全球总产17％。提高小麦产量对我国及全球粮食安全具有非常重要的战略意义。单位面积穗数、穗粒数和千粒重是构成小麦产量的三要素，其中，千粒重具有相对较高的遗传力，可以分解为粒长、粒宽、粒厚等基本要素。因此，鉴定千粒重相关位点，开发与其紧密连锁的分子标记将有助于小麦高产聚合育种。

千粒重属于数量性状，受主效-微效多基因共同控制，其相关QTL分布于小麦21条染色体，其中，主效QTL位于1A、3A、4B、5A、6A、7A、7B、7D，部分候选基因已被同源克隆，如位于6AS染色体的TaGW2；位于2A染色体的TaCWI等。但是，千粒重的遗传机理较复杂，不同材料，遗传背景不同，控制千粒重的主效基因也存在差异。鉴定并开发出更多千粒重相关基因及其分子标记，不仅有利于加快多基因聚合育种的进程，同时有助于进一步阐明小麦产量形成的分子机制。

发明内容

本发明提供一种小麦植株千粒重判断标记，该标记为JHMfeI，序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种小麦植株千粒重判断标记引物，该引物分别为

JHMfeI-F：GGAGGAAACAAAGTGGTC，

JHMfeI-R：GAGAAGAGGAGGTCGTAG。

本发明还提供标记在小麦千粒重判断中的应用，该基因具有JHMfeI-a类型和JHMfeI-b类型，携带有JHMfeI-a类型的小麦植株比携带JHMfeI-b类型的小麦植株千粒重更高。

本发明还提供标记引物在小麦千粒重判断中的应用，具体方法为以所述引物对小麦基因组进行扩增，当扩增产物片段大小为489bp，则该小麦属于携带有JHMfeI-a类型；当扩增片段大小为399bp和90bp，则该小麦属于携带有JHMfeI-b类型；携带有JHMfeI-a类型的小麦植株比携带JHMfeI-b类型的小麦植株千粒重更高。

上述标记引物在小麦千粒重判断中的应用，其中，(1)所述PCR扩增体系为0.8uL2.5mM dNTP,0.2uL 10uM标记引物JHMfeI-F，0.2uL 10uM标记引物JHMfeI-R 1uL 10×Buffer,0.5U Taq DNA polymerase,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10uL；本发明中使用的是EasyTap品牌。

(2)扩增过程为94℃变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s，38个循环。

本发明还提供上述判断标记的获得方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取小麦基因组DNA；

(2)随机对小麦千粒重、粒长和粒宽性状进行测定；

(3)酶切方案设计和简化基因组测序；

(4)遗传图谱构建：利用SLAF-seq方法，共得到在两个亲本之间存在多态性的SLAF标签，构建亲本遗传图谱；采用HighMap软件分析SLAF标签在染色体上的线性排列，并估算相邻标签之间的遗传距离，最终得到遗传图谱；

(5)1B染色体千粒重主效QTL检测：利用软件在小麦1B染色体检测到一个粒重主效QTL，确定物理区间；本发明中采用软件QTL IciMapping 4.1检测小麦QTL。

(6)CAPS标记获得：以两个亲本为对照，根据163个家系的千粒重表型值，选择30个高千粒重家系的籽粒和30个低千粒重家系的籽粒，分别提取这60个家系的DNA，然后等量混合构建高粒重池和低粒重池，用于660K SNP芯片检测；根据上述(5)中鉴定的粒重主效QTL物理位置，筛选该区间内在亲本以及两池间都存在一致突变的SNP，利用软件查找酶切位点以及能够识别该位点的专一性限制性内切酶，采用软件在酶切位点上下游各1000bp设计引物，获得CAPS标记JHMfeI；本发明所述的660K SNP芯片是委托北京博奥生物有限公司进行。本发明是利用Primer Premier 5软件设计引物。

(7)标记与植株千粒重相关性分析：利用连锁群亲本品种和自然群体进行主效位点与千粒重的相关性分析，验证了JHMfeI对粒重具有显著的效应，为调控粒重的主效QTL，可以作为小麦植株千粒重标记。

上述判断标记获得方法，其中，连锁群体为京411/红芒春21，自然群体由369份小麦品种所组成。因此，步骤(4)共得到6718个SLAF标签，获得的遗传图谱总图距为1310.38cM。步骤(5)所述的QTL位于Marker24473338-Marker236689383之间，物理区间为647895499bp-651868580bp。

上述判断标记获得方法，其中，步骤(3)所述酶切方案设计包括如下过程：利用酶切预测软件对参考基因组进行电子酶切预测，最终确定使用RsaI酶，酶切片段长度选择在414-544bp的序列范围；其中，选择最适酶切原则：①位于重复序列的酶切片段比例尽可能低；②酶切片段在基因组上尽量均匀分布。

上述判断标记获得方法，其中，步骤(3)所述简化基因组测序包括如下步骤：将b过程获得的酶切大片段和dATP在37℃条件下进行3’端加A处理；连接测序接头；PCR扩增；纯化；混样；切胶选取目的片段，测序；同时选用拟南芥(Arabidopsis thalianae cotypeColumbia)作为对照进行测序。

上述判断标记获得方法，其中，步骤(3)还包括确定参考基因组方法，具体步骤如下：根据小麦的基因组大小以及GC含量等信息，最终选取小麦(Triticum aestivum Linn.)A组基因组作为参考基因组进行酶切预测；其中，A组基因组为3.92Gb，GC含量45.38％。

有益效果：

发明人利用千粒重差异较大的两个品种京411(千粒重42.54g)和红芒春21(千粒重18.73g)为亲本构建了RIL群体(F10代)，两个亲本在千粒重上差异较大，有利于寻找控制千粒重的主效QTL，采用SLAF-seq技术对两个亲本以及163个家系成员进行简化基因组测序，在全基因组水平上共开发出6718个多态性SNP标记，且结合多年千粒重表型数据，在1B染色体上检测到控制千粒重的主效QTL，并获得与其紧密连锁的分子标记(Marker24473338-Marker24708085)，位于647-651Mb之间。为进一步缩短该区间，继续以两个亲本为对照，根据163个家系成员的千粒重表型值，选择30个高千粒重家系和30个低千粒重的家系，分别提取各自基因组DNA后等量混合，构建高低混合池，进行660K芯片扫描分型(委托北京博奥晶典有限公司完成)，获得在亲本以及两池间差异一致的SNP标记用于加密目标区段。

本发明通过的简化基因组测序(Specific-Locus Amplified FragmentSequencing，SLAF-seq)，即利用生物信息学方法寻找合适的酶对基因组进行酶切，构建一定大小的插入片段文库，对其进行高通量测序，在全基因组范围内鉴定多态性标记(SNPs)。鉴定出来的大量多态性SNPs标记用于构建高密度遗传图谱以及定位控制千粒重的主效QTL。对于已经鉴定到的目标主效QTL，进一步利用小麦660K芯片分型上述两个亲本(京411和红芒春21)，以及所构建的高低混合池，寻找目标区间内(647-651Mb)在两个亲本以及高低混合池间差异一致的SNP标记，并将其转化成CAPS标记，用于针对性加密该目标区间，达到主效QTL精细定位目的。最终，确定了小麦植株千粒重判断标记，获得该标记的等位基因位点，不同基因类型与小麦千粒重存在显著相关性。根据标记基因获得的标记引物，使得规模化获得高千粒重小麦生产获得可能。本发明所述标记和标记引物尤其在小麦千粒重判断中为首次公开。

附图说明

图1CAPS标记JHMfeI在京411和红芒春21中的酶切扩增产物电泳检测图谱。其中，a：京411和红芒春21扩增产物酶切前电泳检测图谱；b：京411和红芒春21扩增产物酶切后电泳检测图谱；1：京411，2：红芒春21

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

(一)小麦基因组DNA提取

用于小麦基因组DNA提取的试验材料为亲本京411和红芒春21、京411/红芒春21群体(F₁₀)163份家系材料、分别由来自京411/红芒春21群体的30份千粒重高和30份千粒重低的家系组成的两个高低混池、以及369份小麦品种。其中，京411/红芒春21群体163份家系材料用于构建高密度连锁图谱以及主效QTL定位；亲本京411和红芒春21，以及分别由来自京411/红芒春21群体的30份千粒重高和30份千粒重低的家系组成的高低混池用于660K芯片的扫描，主效QTL区间内差异SNP的鉴定；369份小麦品种用于验证CAPS标记与千粒重的关系。369份小麦品种为市场所购，任意选择即可。

具体方法为：1、将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mL SDS提取液(0.1M Tris-HCl(PH＝8.5)，0.1M NaCl，0.05M EDTA(PH＝8.0)，2％SDS)在60℃恒温下裂解45min，间歇震荡。

2、在4℃12000rpm条件下，离心10min。

3、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒，避免分层。

4、在4℃12000rpm条件下，离心10min。

5、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次。

6、在4℃12000rpm条件下，离心10min。

7、取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min。

8、在4℃12000rpm条件下，离心10min。

9、用70％的乙醇洗涤两次。

10、在4℃12000rpm条件下，离心10min。

11、沉淀自然风干，4℃存，备用。

(二)千粒重测定

利用万深种子分析仪对随机数取的小麦种子进行千粒重、粒长和粒宽性状测定，重复3次，计算平均值。

(三)简化基因组测序和酶切方案设计

1、参考基因组确定：选取中国春小麦基因组作为参考基因组进行酶切预测。

2、酶切方案确定：利用酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切方案。

3、实验流程：根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA用限制性内切酶HaeIII(New England Biolabs,NEB)，进行酶切。对得到的酶切片段(SLAF标签)用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增(PCR扩增引物：F AATGATACGGCGACCACCGA R CAAGCAGAAGACGGCATACG)、纯化(Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,High Wycombe,UK))、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。为评估酶切实验的准确性，选用拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)作为对照(Control)进行测序。

4、信息分析流程：利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的reads。过滤测序reads的接头后，进行测序质量和数据量的评估。通过Control数据评估酶切效率，以此判断实验过程的准确性和有效性。

(四)CAPS标记开发

1、引物设计：采用Primer Premier 5软件设计CAPS引物，由上海生物工程有限公司合成。

CAPS引物命名为JHMfeI，分别为JHMfeI-F：GGAGGAAACAAAGTGGTC，

JHMfeI-R：GAGAAGAGGAGGTCGTAG。

2、PCR反应体系：0.8uL 2.5mM dNTP,0.4uL 10uM引物，1uL 10*EasyTap Buffer,0.5U EasyTap,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10uL。

3、PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s(退火温度视引物而定)；72℃延伸30s，38个循环。

4、PCR产物检测：酶切产物利用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，GelStain荧光染料染色，BIO-RAD凝胶成像系统扫描拍照(图1)。

获得CAPS标记，具体序列如SEQ ID NO.1所示，在90位置具有c/t突变，90位置具有c突变为JHMfeI-a类型；90位置具有t突变为JHMfeI-b类型；

(五)CAPS标记与粒重的关系

同时利用京411/红芒春21群体和369份小麦品种组成的自然群体验证CAPS标记JHMfeI与千粒重TGW(thousand-grain weight，TGW))的关系(表1和2)，结果表明，在6年环境下(2011、2012、2014、2015、2016、2017)，携带JHMfeI-a类型的品种千粒重与携带JHMfeI-b类型的品种的千粒重差异达到极显著水平(P<0.01)，且在京411/红芒春21群体中，该标记能够解释5.7-16.1％的表型变异(表2)。在自然群体中，携带JHMfeI-a类型的品种的千粒重与携带JHMfeI-b类型的品种的千粒重差异也达到极显著水平(P<0.01)，JHMfeI-a的小麦植株比携带JHMfeI-b类型的小麦植株千粒重更高。说明JHMfeI对粒重影响较显著，为调控粒重的主效QTL。

表1 CAPS标记JHMfeI在RIL群体和自然群体中与粒重的关系

表2 CAPS标记JHMfeI对千粒重的效应

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种小麦植株千粒重判断标记及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L)

<220>

<221> misc_feature

<222> (90)

<223> n is c or t

<400> 1

ggaggaaaca aagtggtctc tctagtctac tgccactcca cttggtttgg ctgtctgttc 60

gtttgctata cttaaagcgt gtaaaactgn aattggttat tggttgttgt ttagtcaggt 120

accctcagta gtagtatatc ccgtcatctg ttttactgta attcccacag caataagttg 180

tttttagaac gaaggctcaa gtcgacccct gctttcaata aaaaagctat caaccgacca 240

ggattacagc atcaaccaca aaaacaaaaa gacaaacctg ctaagagata catagtgctc 300

tgcagctagc aagcttcata tggtctacaa gcaaagatga agaaaaacta aatcacagga 360

acaacttgaa ggcgatgaat ccctccacca agcgcactcc accacttagt gacaccaact 420

agcaaattaa gagtaacaca ttgtcatctc catgggctcc ggcaaattca gctacgacct 480

cctcttctc 489

Claims (10)

1.一种小麦植株千粒重判断标记，其特征在于：该标记为JHMfeI，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种小麦植株千粒重判断标记引物，其特征在于：该引物分别为

JHMfeI-F：GGAGGAAACAAAGTGGTC，

JHMfeI-R：GAGAAGAGGAGGTCGTAG。

3.权利要求1所述标记在小麦千粒重判断中的应用，其特征在于：该基因具有JHMfeI-a类型和JHMfeI-b类型，JHMfeI-a能够被限制性内切酶MfeI切开，酶切位点C/AATTG，扩增产物长度为399bp和90bp，JHMfeI-b类型不能被限制性内切酶MfeI切开，扩增产物长度为489bp；其中，携带有JHMfeI-a类型的小麦植株比携带JHMfeI-b类型的小麦植株千粒重更高。

4.权利要求2所述标记引物在小麦千粒重判断中的应用，其特征在于：以所述引物对小麦基因组进行扩增，当扩增产物片段大小为489bp，则该小麦属于携带有JHMfeI-a类型；当扩增片段大小为399bp和90bp，则该小麦属于携带有JHMfeI-b类型；携带有JHMfeI-a类型的小麦植株比携带JHMfeI-b类型的小麦植株千粒重更高。

5.权利要求4所述标记引物在小麦千粒重判断中的应用，其特征在于：(1)所述PCR扩增体系为0.8uL 2.5mM dNTP,0.2uL 10uM标记引物JHMfeI-F，0.2uL 10uM标记引物JHMfeI-R1uL 10×Buffer,0.5U Taq DNA polymerase,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10uL；

(2)扩增过程为94℃变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s，38个循环。

6.权利要求1所述判断标记的获得方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)提取小麦基因组DNA；

(2)随机对小麦千粒重、粒长和粒宽性状进行测定；

(3)酶切方案设计和简化基因组测序；

(4)遗传图谱构建：利用SLAF-seq方法，共得到在两个亲本之间存在多态性的SLAF标签，构建亲本遗传图谱；采用HighMap软件分析SLAF标签在染色体上的线性排列，并估算相邻标签之间的遗传距离，最终得到遗传图谱；

(5)1B染色体千粒重主效QTL检测：利用软件在小麦1B染色体检测到一个粒重主效QTL，确定物理区间；

(6)CAPS标记获得：以两个亲本为对照，根据163个家系的千粒重表型值，选择30个高千粒重家系的籽粒和30个低千粒重家系的籽粒，分别提取这60个家系的DNA，然后等量混合构建高粒重池和低粒重池，用于660K SNP芯片检测；根据上述(5)中鉴定的粒重主效QTL物理位置，筛选该区间内在亲本以及两池间都存在一致突变的SNP，利用软件查找酶切位点以及能够识别该位点的专一性限制性内切酶，采用软件在酶切位点上下游各1000bp设计引物，获得CAPS标记JHMfeI；

(7)标记与植株千粒重相关性分析：利用连锁群亲本品种和自然群体进行主效位点与千粒重的相关性分析，验证了JHMfeI对粒重具有显著的效应，为调控粒重的主效QTL，可以作为小麦植株千粒重标记。

7.权利要求6所述的判断标记获得方法，其特征在于：连锁群体为京411/红芒春21，自然群体由369份小麦品种所组成。

8.权利要求6所述的判断标记获得方法，其特征在于，步骤(3)所述酶切方案设计包括如下过程：利用酶切预测软件对参考基因组进行电子酶切预测，最终确定使用RsaI酶，酶切片段长度选择在414-544bp的序列范围；其中，选择最适酶切原则：①位于重复序列的酶切片段比例尽可能低；②酶切片段在基因组上尽量均匀分布。

9.权利要求6所述的判断标记获得方法，其特征在于，简化基因组测序包括如下步骤：将b过程获得的酶切大片段和dATP在37℃条件下进行3’端加A处理；连接测序接头；PCR扩增；纯化；混样；切胶选取目的片段，测序；同时选用拟南芥作为对照进行测序。

10.权利要求6所述的判断标记获得方法，其特征在于，步骤(3)还包括确定参考基因组方法，具体步骤如下：根据小麦的基因组大小以及GC含量等信息，最终选取小麦A组基因组作为参考基因组进行酶切预测；其中，A组基因组为3.92Gb，GC含量45.38％。