CN104774852B - 控制小麦千粒重的主效基因TaTGW‑2A及其CAPS标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了涉及控制小麦千粒重的主效基因TaTGW‑2A，并且本发明还公开了涉及控制小麦千粒重的主效基因TaTGW‑2A的CAPS标记方法。本发明的有益效果在于，利用简化基因组测序技术，鉴定出与小麦粒重紧密关联的候选区域，并克隆了该区域的候选基因，经人工群体和自然群体联合验证，该基因是一种对粒重影响显著的新的主效基因，并开发了较SNP标记更易于检测的CAPS标记(TaTGW‑2A)。本发明为小麦高产育种提供了新的基因资源，同时进一步阐明了产量形成的分子机制。
Description
技术领域
本发明涉及控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A及其CAPS标记方法，属于作物遗传育种的技术领域。
背景技术
小麦(Triticum aestivumL.)是世界上总产量位居第二的粮食作物，提高小麦产量对国家粮食安全以及增加农业生产效益都具有非常重要的战略意义。千粒重是小麦产量构成三要素之一，具有较高的遗传力(Giura和Saulescu，1996)，因此，小麦的育种过程在很大程度上就是不断提高粒重。然而，粒重的分子调控机理仍不清晰。
总结前人报道，千粒重属于数量性状，受主效加微效多基因共同控制。目前，粒重相关QTL位点报道较多，广泛分布在小麦21条染色体上(Araki等，1999；Shah等，1999；Kato等，2000；Groos等，2003；Huang等，2003；Breseghello等，2006；Huang等，2006；Sun等，2009；Marta等，2013；Simmonds等，2014)。其中主效QTL位点位于1A、2A、3A、4B、5A、6A 7A、7B、7D(Campbell等，2003；Huang等，2003；Vasilis等，2010)。小麦中，调控粒重的部分功能基因已经被克隆。如Su等(2011)同源克隆了水稻中控制粒宽和粒重的主效基因TaGW2-6A。Ma等(2012)克隆了小麦2A染色体上与粒重相关的细胞壁转化酶基因TaCWI。综合上述可知，千粒重的遗传机理较复杂，不同材料，遗传背景不同，控制粒重的主效基因也有所差异。鉴定出更多粒重相关基因，不仅有利于加快多基因聚合育种的进程，同时有助于进一步阐明产量形成的分子机制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A及其CAPS标记方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A，品种为京411，其序列如序列表。
控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A，品种为红芒春21，其序列如序列表。
控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，步骤包括：
(1)小麦基因组DNA提取；
(2)对基因组DNA用限制性内切酶HaeIII进行酶切，对得到的酶切片段用KlenowFragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序，PCR扩增引物：F：AATGATACGGCGACCACCGA，R：CAAGCAGAAGACGGCATACG)；
(3)设计引物
TaTGW-2A基因全长克隆拼接引物：上游G2-27F：ATCTACAAGTGGTTCTCTCCTCTG，G2-27R：GCTACATCTATTTGGATTCTCATTC；下游G2-19F：GGTCGAGGAGGTCAACAAGCA，G2-19R：AAGCGTTCCAGTTCATTTCAG；mRNA克隆测序引物：2AR-1F：CTCTGTCTGATCCCTCTCGC，2AR-1R：CCAGGCACTGTTCCAAAGTA；2AR-5F：TCTCCTCTGTCTGATCCCTCT，2AR-5R：ATGTAAAACATGACGGCTGTA，酶切CAPS标记开发引物：B2A-1F：TTGGAATAAACTGGTCTGGAAAA，B2A-1R：AAAACTGCGACACTTACTATGGA；
引物G2-27、G2-19用于扩增TaTGW-2A基因上游和下游，PCR产物克隆测序，并拼接基因全长；引物2AR-1、2AR-5用于扩增mRNA全长，PCR产物克隆测序；引物B2A用于CAPS标记开发，用MseI在37℃下酶切2h，产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带。
进一步地，(1)小麦基因组DNA提取的步骤：
1)将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mLSDS提取液(0.1M Tris-HCl(PH＝8.5)，0.1M NaCl，0.05M EDTA(PH＝8.0)，2％SDS)在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡；
2)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
3)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层；
4)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
5)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次；
6)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
7)取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min；
8)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
9)用70％的乙醇洗涤两次；
10)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
11)沉淀自然风干，4℃存，备用。
进一步地，(2)选用拟南芥作为对照进行测序。
进一步地，(3)CAPS标记开发的PCR反应体系：1μL 2.5mM dNTP,0.25μL 10μM引物，1μL 10*La Tap Buffer,0.5U TaKaRa LaTap,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL。
进一步地，(3)CAPS标记开发的PCR反应程序：95℃变性5min；95℃变性45s；55℃退火50s；72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。
进一步地，(3)琼脂糖凝胶电泳：1.5-2％琼脂糖凝胶，缓冲体系为1×TAE溶液，在100V恒压下，电泳50min，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统扫描并保存，聚丙烯酰胺凝胶电泳：6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，缓冲体系为1×TBE溶液，电压1200V，电流55A，功率55W，电泳90-110min。
本发明的主要原理是：
(一)简化基因组测序技术(1)基于生物信息学进行方案系统设计利用生物信息学方法，对小麦的参考基因组(或已知BAC序列)进行系统分析，根据基因组的GC含量、重复序列情况和基因特点等信息，设计标记开发方案，以保证其分子标记开发的密度、均匀性、效率和关联分析的准确性。(2)SLAF-seq文库构建及测序选择小麦作为研究材料，构建SLAF-seq文库，根据前期信息学方法设计的方案，筛选特异性长度片段，应用高通量测序技术获得海量标签序列。(3)SLAF-seq数据分析对数据进行基本处理，对测序数据进行评估，获得测序深度和质量满足要求的SLAF片段，来代表小麦基因组信息。本发明利用SLAF-seq技术鉴定了小麦粒重相关基因的热点区域。
(二)聚合酶链式反应(PCR)，反应步骤：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，经过30个循环左右，目的片段得到大量扩增。本发明采用Primer Premier 5软件设计引物，对粒重相关候选基因进行克隆。
本发明的有益效果：
本发明利用简化基因组测序技术，鉴定出与小麦粒重紧密关联的候选区域，并克隆了该区域的候选基因，经人工群体和自然群体联合验证，该基因是一种对粒重影响显著的新的主效基因，并开发了较SNP标记更易于检测的CAPS标记(TaTGW-2A)。本发明为小麦高产育种提供了新的基因资源，同时进一步阐明了产量形成的分子机制。
附图说明
图1为TaTGW-2A基因功能预测示意图；(黄色氨基酸代表配体结合位点。3CUE_D：酿酒酵母；gi|541040813：猪蛔虫；gi|429328500：巴贝西虫；gi|403340193：尖毛虫属；1WC9_A：小家鼠；gi|190580260：丝盘虫；gi|239876112：海洋派琴虫；gi|74882182：约氏疟原虫；gi|146184553：嗜热四膜虫；Query：TaTGW-2A)
图2为京411和红芒春21观察记带的示意图；(1、2：京411；3、4：红芒春21；a：酶切之前；b：酶切之后)
图3为TaTGW-2A的遗传定位的示意图。(TaTGW-2A与Xgwm122和Xgwm95两侧标记紧密连锁，LOD值取3.0)
具体实施方式
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
(一)小麦基因组DNA提取
用于DNA提取的试验材料为亲本京411和红芒春21、两个高低混池、重组自交系RIL(京411/红芒春21)F9群体各家系、262份种质资源材料。具体方法为：
1、将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mLSDS提取液(0.1M Tris-HCl(PH＝8.5)，0.1M NaCl，0.05M EDTA(PH＝8.0)，2％SDS)在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡。
2、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
3、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层。
4、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
5、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次。
6、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
7、取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min。
8、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
9、用70％的乙醇洗涤两次。
10、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
11、沉淀自然风干，4℃存，备用。
(二)简化基因组测序和酶切方案设计
1、参考基因组确定：根据小麦的基因组大小以及GC含量等信息，最终选取小麦A基因组作为参考基因组进行酶切预测。
2、酶切方案确定：利用酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切方案。
3、实验流程：根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA用限制性内切酶HaeIII(New England Biolabs,NEB)，进行酶切。对得到的酶切片段(SLAF标签)用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增(PCR扩增引物：F AATGATACGGCGACCACCGA R CAAGCAGAAGACGGCATACG)、纯化(Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,High Wycombe,UK))、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。为评估酶切实验的准确性，选用拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)作为对照(Control)进行测序。
4、信息分析流程：利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的reads。过滤测序reads的接头后，进行测序质量和数据量的评估。通过Control数据评估酶切效率，以此判断实验过程的准确性和有效性。通过reads间聚类的方法，在亲本和混池中开发SLAF标签，寻找在亲本中存在多态性的SLAF标签。将得到的多态性SLAF标签进行关联分析，获得与性状紧密关联的SLAF标签，并将其定位到参考基因组上，确定候选区域，获得与小麦粒重紧密关联的分子标记和候选区域，并对区域内的转录本进行基因克隆和功能标记开发。
(三)引物设计
1、TaTGW-2A基因全长克隆拼接引物：上游G2-27F：ATCTACAAGTGGTTCTCTCCTCTGG2-27R：GCTACATCTATTTGGATTCTCATTC；下游G2-19F：GGTCGAGGAGGTCAACAAGCA G2-19R：AAGCGTTCCAGTTCATTTCAG；mRNA克隆测序引物：2AR-1F：CTCTGTCTGATCCCTCTCGC 2AR-1R：CCAGGCACTGTTCCAAAGTA；2AR-5F：TCTCCTCTGTCTGATCCCTCT 2AR-5R：ATGTAAAACATGACGGCTGTA。酶切CAPS标记开发引物：B2A-1F：TTGGAATAAACTGGTCTGGAAAAB2A-1R：AAAACTGCGACACTTACTATGGA。SSR引物信息来自Gremene数据库(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)。引物有Primer Premier 5软件设计，由上海生工合成。
2、PCR反应体系：1μL 2.5mM dNTP,0.25μL 10μM引物，1μL10*La Tap Buffer,0.5UTaKaRa LaTap,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL。
PCR反应程序：95℃变性5min；95℃变性45s；55℃退火50s(退火温度视引物而定)；72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。
3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳：1.5-2％琼脂糖凝胶，缓冲体系为1×TAE溶液，在100V恒压下，电泳50min，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统扫描并保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳：6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，缓冲体系为1×TBE溶液，电压1200V，电流55A，功率55W，电泳90-110min。
(四)TaTGW-2A基因全长克隆
引物G2-27、G2-19用于扩增TaTGW-2A基因上游和下游，PCR产物克隆测序，并拼接基因全长；引物2AR-1、2AR-5用于扩增mRNA全长，PCR产物克隆测序；引物B2A用于CAPS标记开发。
(五)基因结构和序列变异分析
TaTGW-2A(京411等位基因)基因从翻译起始密码子到终止子全长2814bp，包含5个外显子和4个内含子，基因阅读框长564bp，编码188个氨基酸。通过比较大粒京411和小粒红芒春21的序列发现：TaTGW-2A等位基因在外显子上没有发生序列变异；在第一内含子上存在4处碱基变异，第一个位于第一内含子第16bp处京411等位基因碱基C缺失，第二个位于第18、19bp处GC→AA，第三个位于第21bp处ACAG碱基缺失，第四个位于第32、33bp处AA→CC。第二个内含子存在3个碱基替换，第一处(位于557bp)G→A，第二处(位于596bp)T→C，第三处(位于1058bp)A→C。第四个内含子(位于420bp)存在一个T→C替换。3’端下游非翻译区则存在多处碱基替换。
经生物信息学分析，TaTGW-2A含有转运蛋白颗粒(TRAPP)复合体Bet3亚基相似结构(图1)。TRAPP复合体的功能是牵引运输小泡在内质网到高尔基体或高尔基体内物质的运输，在植物细胞分裂过程中，TRAPP复合体(TRAPPC9)能够牵引小泡在细胞分裂位点积累有利于子细胞的形成(Sidney等，2012)。TaTGW-2A在外显子上保守，而在内含子上存在多处变异，推测内含子上碱基的突变，可能增强京411等位基因表达水平，进而促进小泡的物质加工和运输，另一方面基因表达水平的增加，也可能促进了细胞的分裂，增加细胞数目，进一步影响粒重的形成。
(六)标记开发、遗传定位以及与粒重的相关性
依据3，端下游非翻译区TTAA→TTGA，设计酶切引物B2A-1F：TTGGAATAAACTGGTCTGGAAAA B2A-1R：AAAACTGCGACACTTACTATGGA，开发CAPS标记。PCR反应程序：95℃变性5min；95℃变性45s；63℃退火50s(每个循环降0.3℃)；72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。最后用MseI(NEB)在37℃下酶切2h，产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带(图2)。
本发明同时利用两种群体(重组自交系和262份种质资源材料所组成的自然群体)进行TaTGW-2A与粒重的相关性分析。
TaTGW-2A在RIL和自然群体中与粒重的相关性(**在置信度为0.01时，相关性极显著，*在置信度为0.05时，相关性显著。)注：A：京411等位基因类型；B：红芒春21等位基因类型。
结果表明，在3年环境下(2011、2012、2014)，TaTGW-2A在重组自交系群体中能够解释15.4-18.7％的表型变异。在3年(2012、2013、2014)环境下，TaTGW-2A在自然群体中显示与粒重的相关性达极显著水平，能够解释7.2-15.7％的表型变异。说明TaTGW-2A确实对粒重影响较显著，为调控粒重的主效QTL。本发明继续利用上述重组自交系群体，选取2A上分布均匀的SSR引物进行遗传定位分析，结果表明TaTGW-2A与Xgwm122和Xgwm95紧密连锁(图3)，且该基因刚好定位于原先已定位的主效QTL的区间，由此进一步推断TaTGW-2A作为QTL区域的候选基因影响粒重的表型。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，品种为京411，其序列如SEQ ID NO:2；
控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，步骤包括：
(1)小麦基因组DNA提取；
(2)对基因组DNA用限制性内切酶HaeIII进行酶切，对得到的酶切片段用KlenowFragment和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序，PCR扩增引物：F：AATGATACGGCGACCACCGA；
R：CAAGCAGAAGACGGCATACG；
(3)设计引物
TaTGW-2A基因全长克隆拼接引物：
G2-27：G2-27F：ATCTACAAGTGGTTCTCTCCTCTG；
G2-27R：GCTACATCTATTTGGATTCTCATTC；
G2-19：G2-19F：GGTCGAGGAGGTCAACAAGCA；
G2-19R：AAGCGTTCCAGTTCATTTCAG；
mRNA克隆测序引物：
2AR-1：2AR-1F：CTCTGTCTGATCCCTCTCGC；
2AR-1R：CCAGGCACTGTTCCAAAGTA；
2AR-5：2AR-5F：TCTCCTCTGTCTGATCCCTCT；
2AR-5R：ATGTAAAACATGACGGCTGTA；
酶切CAPS标记开发引物：
B2A：B2A-1F：TTGGAATAAACTGGTCTGGAAAA；
B2A-1R：AAAACTGCGACACTTACTATGGA；
引物G2-27、G2-19用于扩增TaTGW-2A基因上游和下游，PCR产物克隆测序，并拼接基因全长；引物2AR-1、2AR-5用于扩增mRNA全长，PCR产物克隆测序；引物B2A用于CAPS标记开发，用MseI在37℃下酶切2h，产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带。
2.控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，品种为红芒春21，其序列如SEQ ID NO:1；
控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，步骤包括：
(1)小麦基因组DNA提取；
(2)对基因组DNA用限制性内切酶HaeIII进行酶切，对得到的酶切片段用KlenowFragment和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序，PCR扩增引物：F：AATGATACGGCGACCACCGA；
R：CAAGCAGAAGACGGCATACG；
(3)设计引物
TaTGW-2A基因全长克隆拼接引物：
G2-27：G2-27F：ATCTACAAGTGGTTCTCTCCTCTG；
G2-27R：GCTACATCTATTTGGATTCTCATTC；
G2-19：G2-19F：GGTCGAGGAGGTCAACAAGCA；
G2-19R：AAGCGTTCCAGTTCATTTCAG；
mRNA克隆测序引物：
2AR-1：2AR-1F：CTCTGTCTGATCCCTCTCGC；
2AR-1R：CCAGGCACTGTTCCAAAGTA；
2AR-5：2AR-5F：TCTCCTCTGTCTGATCCCTCT；
2AR-5R：ATGTAAAACATGACGGCTGTA；
酶切CAPS标记开发引物：
B2A：B2A-1F：TTGGAATAAACTGGTCTGGAAAA；
B2A-1R：AAAACTGCGACACTTACTATGGA；
引物G2-27、G2-19用于扩增TaTGW-2A基因上游和下游，PCR产物克隆测序，并拼接基因全长；引物2AR-1、2AR-5用于扩增mRNA全长，PCR产物克隆测序；引物B2A用于CAPS标记开发，用MseI在37℃下酶切2h，产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带。
3.根据权利要求1或2所述的控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(1)中小麦基因组DNA提取的步骤：
1)将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mLSDS提取液在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡；
2)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
3)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇并上下颠倒旋转至两相不很快分层，所述等体积的酚：氯仿：异戊醇的比例具体为25:24:1；
4)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
5)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇并上下颠倒旋转数次，所述等体积的酚：氯仿：异戊醇的比例具体为25:24:1；
6)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
7)取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min；
8)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
9)用70％的乙醇洗涤两次；
10)在4℃12000rpm条件下，离心10min；
11)沉淀自然风干，4℃存，备用。
4.根据权利要求1或2所述的控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(2)中选用拟南芥作为对照进行测序。
5.根据权利要求1或2所述的控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(3)中CAPS标记开发的PCR反应体系：1μL 2.5mM dNTP,0.25μL 10μM引物，1μL 10*La Tap Buffer,0.5U TaKaRa LaTap,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL。
6.根据权利要求1或2所述的控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(3)中CAPS标记开发的PCR反应程序：95℃变性5min；95℃变性45s；55℃退火50s；72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。
7.根据权利要求1或2所述的控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳：2％琼脂糖凝胶，缓冲体系为1×TAE溶液，在100V恒压下，电泳50min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统扫描并保存。
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