CN108004303A

CN108004303A - 日本鳗鲡适应性snp位点的筛选方法

Info

Publication number: CN108004303A
Application number: CN201711339156.2A
Authority: CN
Inventors: 刘炳舰; 刘立芹; 吕振明; 龚理; 柳意樊
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明公开了日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，包括提取基因组DNA，RAD文库构建及测序，RAD数据产出及质量控制，SNP位点的检测及筛选。有益效果为：本发明所公开的方法筛选得到的37700个SNP位点广泛分布于日本鳗鲡草图的整个基因组范围，总共包含在10710条contigs中，平均每条contig中含有3.5个SNP位点，进一步补充和完善了日本鳗鲡这一濒危物种的基因组信息资源，为日本鳗鲡群体遗传结构及种群历史动态的相关研究提供了重要的基础。

Description

日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法。

背景技术

关于适应性遗传分化的的研究越来越引起研究人员的兴趣，特别是在确定和筛选受选择的分子遗传标记方面。本地适应性进化引起关注主要有以下几个方面的原因：首先，在以往的群体遗传学研究中，只是一些中性遗传数据的积累，研究人员意识到群体中检测到的中性变异并不能揭示种群适应进化的一面；其次，目前在全球气候变化的大环境下，也使得研究人员越来越多的关注气候变化所引起的生物微进化。检测野生群体的适应性分化并不是一件容易的事情，尤其是在空间和时间分化上的选择作用，因此，采用分子标记来检测适应性选择信号具有很大优势。群体基因组学使得在基因组水平探讨自然种群的完整进化历史成为可能，有助于更加全面理解生物多样性起源与分化，并已经成为分子生态学领域中应用最为广泛的研究手段。

日本鳗鲡（Anguilla japonica）为研究空间异质选择和基因流的相互作用提供了一个很好的机会。日本鳗鲡是一种兼性洄游鱼类，占据了非常广泛的分布区域，且分布范围内的环境因子存在很大差异，选择压力在空间上的异质性可能会导致种群本地适应性的产生。养殖从业者的生产经验显示采自不同地理群体的日本鳗鲡苗种在生长速度、适温性和抗病力上存在一定差异。此外，日本鳗鲡苗种群体的形态特征和发育时相的相关研究也显示不同地理群体在形态性状和生态习性上存在差异，提示可能存在不同的地方种群。可见，日本鳗鲡不同地理种群可能存在对本地环境的适应性进化。因此，开展日本鳗鲡不同地理种群适应本地环境的遗传学机制研究具有非常重要的科学价值，而适应性SNP位点的筛选对于日本鳗鲡遗传学机制的研究具有非常重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，该方法所得到的37700个SNP位点广泛分布于日本鳗鲡草图的整个基因组范围，总共包含在10710条contigs中，平均每条contig中含有3.5个SNP位点，进一步补充和完善了日本鳗鲡这一濒危物种的基因组信息资源，为日本鳗鲡群体遗传结构及种群历史动态的相关研究提供了重要的基础，且筛选过程中DNA片段浪费少，成本低。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，包括以下步骤：

提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA；

RAD文库构建及测序：采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，对所得DNA片段进行末端平化，3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板，通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用Illumina HiSeq4000测序平台进行双端测序，该过程不受参考基因组的限制，可简化复杂基因组，能够在整个基因组内批量寻找SNP位点，具有一致的扩增效率，有效地降低了建库成本和测序成本；

RAD数据产出及质量控制：过滤掉原始测序数据中包含带Adaptor信息、低质量碱基和未测出的碱基的reads pair；原始测序数据中所包含的这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，分析前将这些干扰信息去除掉，所得到的有效数据为后续数据的精确分析提供了保证；

SNP位点的检测及筛选：将过滤所得的reads pair通过BWA软件与已发表的日本鳗鲡基因组草图进行比对，接着采用SAMTOOLS 0.1.19中的贝叶斯算法模型以最大reads深度为1000的参数设置进行SNP的检测，过滤得日本鳗鲡适应性SNP位点，通过该过程得到37700个SNP位点，这些位点广泛分布于日本鳗鲡草图的整个基因组范围，总共包含在10710条contigs中，平均每条contig中含有3.5个SNP位点，进一步补充和完善了日本鳗鲡这一濒危物种的基因组信息资源，为日本鳗鲡群体遗传结构及种群历史动态的相关研究提供了重要的基础。

作为优选，RAD文库构建及测序中酶切反应体系为50μL，其中含有2μL 10×NEBbuffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水。该条件下，内切酶稳定性好，不易失活，且所获得的DNA片段纯度高，为后续步骤提供了充足的DNA片段。

作为优选，RAD文库构建及测序中桥式PCR扩增所用的上游引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，下游引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。

作为优选，RAD文库构建及测序中桥式PCR扩增条件为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响聚合酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所公开的方法筛选得到的37700个SNP位点广泛分布于日本鳗鲡草图的整个基因组范围，总共包含在10710条contigs中，平均每条contig中含有3.5个SNP位点，进一步补充和完善了日本鳗鲡这一濒危物种的基因组信息资源，为日本鳗鲡群体遗传结构及种群历史动态的相关研究提供了重要的基础。

具体实施方式

以下结合实施例作进一步详细描述：

实施例1：日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，包括以下步骤：

1)提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA，具体过程如下：将样品放入1.5ml离心管剪碎，加入600μL STE（10mmol/L TriS-Cl，pH 8.0；0.1mol/L EDTA，pH 8.0；1%m/v SDS），于振荡器上震荡均匀，加入RNase（4μg/μL）6uL，终浓度0.04μg/μL，37℃烘箱内孵育1h，期间不时轻轻翻动离心管，使组织与抽提缓冲液混合均匀，接着加蛋白酶K（20μg/μL）15μL，终浓度0.5μg/μL，颠倒混匀，于50℃烘箱内孵育2h，期间也不时轻轻翻动离心管，使组织与抽提缓冲液混合均匀，接着从烘箱内取出后凉至室温，再加600μL（pH8.0）平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊（≥30min），离心（10000r/min，10min），小心吸取上清至另一干净的1.5mL离心管，接着加等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀20min，离心（10000r/min，10min），小心吸取上清至另一干净的1.5ml离心管，接着加等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀20min，离心（10000r/min，10min），小心吸取上清至另一干净的1.5mL离心管，再加入等体积的预冷酒精，颠倒混匀，-20℃存放2小时以上，离心（12000r/min，10min）产生白色沉淀，轻柔倒去液体，再加入800μL75%的预冷酒精，缓慢颠倒洗涤DNA沉淀，再离心（12000r/min，10min），弃酒精，重复步骤6（注：不要将DNA沉淀倒掉），接着将DNA样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥（视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间）；加入适量TE（10mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH8.0）溶解，置4ºC冰箱待用或长期保存于-20ºC待用；

2)RAD文库构建及测序：将提取的基因组DNA保存在超纯水中，稀释浓度在25ng/µL以上，DNA的总质量大于1µg，采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，酶切反应体系为50μL(2μL 10×NEB buffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水)，酶切反应条件为：36℃反应9min，然后71℃反应18min，向酶切片段中加入第一接头（可与EcoRI酶切DNA缺口互补），将所得片段混池，随机打断到一定的片段（平均片段长度约500bp），通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，末端平化后加3’dA overhang，接着加入第二接头，第二接头含有3’dT overhang，可以与随机打断的3’dA overhang互补结合，从而形成PCR富集扩增前的DNA模板，接着通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，桥式PCR扩增所用的上游引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，下游引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’，成簇后应用Illumina HiSeq4000测序平台进行双端测序，其中，第一接头包含4个部分：EcoRI限制性内切酶酶切末端，用以对样品进行追踪的6bp barcode序列（每个barcode序列之间至少存在2个碱基的差异以避免由于测序误差造成的样品归属偏差），与Illumina测序引物结合的互补序列以及与PCR扩增前引物结合的序列；第二接头为局部双链分叉Y型DNA，可实现选择性的扩增同时含有第一接头和第二接头的DNA；

3)RAD数据产出及质量控制：DNA文库通过IlluminaHiSeq4000平台进行测序，测序得到的原始测序序列为原始数据，原始测序数据中会包含带接头（Adaptor）信息、低质量碱基和未测出的碱基（以N表示）的reads pair，然而这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，分析前需将这些干扰信息去除掉，最终得到的数据即为有效数据，此外，在获得有效数据后，需要进一步去除由于PCR复制导致的重复reads（duplication）并对数据的质量得分（Q20，Q30）及GC含量分布进行评估，以保证后续数据分析的要求，过滤的标准为：过滤掉含有接头序列的reads pair；当单端测序read中N碱基（N表示测序无法确定的碱基信息）的含量超过10%时，去除此对双末端reads；当单端测序read中含有的低质量（phred score≤5）碱基数超过该条read长度的50%时，去除此对双末端reads pair；过滤掉由于PCR扩增产生的重复序列；

4)SNP位点的检测及筛选：将步骤3)所得到的Clean reads通过BWA软件（Li andDurbin 2010，默认的参数设置）与已发表的日本鳗鲡基因组草图（www.eelgenome.com）进行比对，然后采用SAMTOOLS 0.1.19（Li et al. 2009）中的贝叶斯算法模型以最大reads深度为1000的参数设置进行SNP的检测，最后对检测到的SNP位点按照以下的标准进行过滤：SNP的质量值不低于30（Q30）；SNP的reads支持数不低于10；SNP的个体覆盖度不低于80%；最小等位基因频率（MAF）不低于5%；仅保留双等位基因位点；每个群体杂合度H _O≤0.5；近交系数-0.3≤F _IS≤0.3；对于过滤后得到的clean reads，平均每个个体有15530000reads可以比对到日本鳗鲡基因组草图的contigs上，应用SAMTOOLS软件共检测到45552012个SNP位点，通过深度、覆盖度等参数过滤后，共得到37700个SNP位点，这些位点广泛分布于日本鳗鲡草图的整个基因组范围，总共包含在10710条contigs中，平均每条contig中含有3.5个SNP位点。

实施例2：日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，包括以下步骤：

1)提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA；

2)RAD文库构建及测序：将提取的基因组DNA保存在超纯水中，稀释浓度在25ng/µL以上，DNA的总质量大于1µg，采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，酶切反应体系为50μL(2μL 10×NEB buffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水)，酶切反应条件为：38℃反应11min，然后73℃反应25min，向酶切片段中加入第一接头（可与EcoRI酶切DNA缺口互补），将所得片段混池，随机打断到一定的片段（平均片段长度约500bp），通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，末端平化后加3’dA overhang，接着加入第二接头，第二接头含有3’dT overhang，可以与随机打断的3’dA overhang互补结合，从而形成PCR富集扩增前的DNA模板，接着通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用IlluminaHiSeq4000测序平台进行双端测序，其中，第一接头包含4个部分：EcoRI限制性内切酶酶切末端，用以对样品进行追踪的6bp barcode序列（每个barcode序列之间至少存在2个碱基的差异以避免由于测序误差造成的样品归属偏差），与Illumina测序引物结合的互补序列以及与PCR扩增前引物结合的序列；第二接头为局部双链分叉Y型DNA，可实现选择性的扩增同时含有第一接头和第二接头的DNA；

实施例3：日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，包括以下步骤：

2)RAD文库构建及测序：将提取的基因组DNA保存在超纯水中，稀释浓度在25ng/µL以上，DNA的总质量大于1µg，采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，酶切反应体系为50μL(2μL 10×NEB buffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水)，反应前向酶切反应体系再加入0.2ng四氯扁桃酸和0.5ng 2-羟基苯乙酸，接着在37℃反应10min，然后72℃反应23min，所加入的四氯扁桃酸和2-羟基苯乙酸与10×NEB buffer具有协同作用，提高了内切酶的活性，促进了分子链内部磷酸二酯键的水解，增加了酶切液中DNA片段的含量，降低了DNA片段的浪费；接着向酶切片段中加入第一接头（可与EcoRI酶切DNA缺口互补），将所得片段混池，随机打断到一定的片段（平均片段长度约500bp），通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，末端平化后加3’dA overhang，接着加入第二接头，第二接头含有3’dT overhang，可以与随机打断的3’dA overhang互补结合，从而形成PCR富集扩增前的DNA模板，接着通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用Illumina HiSeq4000测序平台进行双端测序，其中，第一接头包含4个部分：EcoRI限制性内切酶酶切末端，用以对样品进行追踪的6bp barcode序列（每个barcode序列之间至少存在2个碱基的差异以避免由于测序误差造成的样品归属偏差），与Illumina测序引物结合的互补序列以及与PCR扩增前引物结合的序列；第二接头为局部双链分叉Y型DNA，可实现选择性的扩增同时含有第一接头和第二接头的DNA；

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Saccharum)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Saccharum)

<400> 2

caagcagaag acggcatacg a 21

Claims

1.日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

2)RAD文库构建及测序：采用内切酶对基因组DNA进行酶切，对酶切后的DNA片段进行文库构建，得到高通量测序文库；

3)RAD数据产出及质量控制：过滤掉原始测序数据中包含带Adaptor信息、低质量碱基和未测出的碱基的reads pair；

4)SNP位点的检测及筛选：将过滤所得的reads pair通过BWA软件与已发表的日本鳗鲡基因组草图进行比对，接着采用SAMTOOLS 0.1.19中的贝叶斯算法模型以最大reads深度为1000的参数设置进行SNP的检测，最后经过滤得日本鳗鲡适应性SNP位点。

2.根据权利要求1所述的日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)中内切酶为限制性内切酶EcoRI。

3. 根据权利要求1所述的日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)中酶切反应体系为50μL，其中含有2μL 10×NEB buffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水。

4. 根据权利要求1所述的日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)中文库构建过程为：向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段打断，回收200bp-400bp的DNA片段，对所得DNA片段进行末端平化，3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板，通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用Illumina HiSeq4000测序平台进行双端测序。

5.根据权利要求4所述的日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，其特征在于：所述桥式PCR扩增所用的上游引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，下游引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。

6.根据权利要求4所述的日本鳗鲡适应性SNP位点的筛选方法，其特征在于：所述桥式PCR扩增条件为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min。