CN104946765A - 基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法。本发明通过对野生型柚和突变型柚的各个组织的深度重测序，对得到的高质量的测序reads和甜橙基因组进行比对获得各组材料的单核苷酸多态性位点(SNP)。基于这些全基因组分布的SNP位点，对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的候选位点，对这些候选位点进行注释，并推测性状相关变异发生的染色体区域，最后利用Sanger测序方法对候选位点进行验证，获得了突变型柚的变异位点。该方法最大的优势在于低成本、周期短。完成一个突变体突变位点挖掘的成本在2万元左右，在3个月时间内可完成，体现了基因组前沿技术和柑橘传统育种研究的结合与创新探索。本发明还公开了所述方法的开发及应用。

Description

基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法

技术领域

本发明涉及柑橘基因组学及分子育种领域，具体地指一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法。

背景技术

体细胞突变(somatic mutation)是指植物在体细胞水平(如芽的分生组织)发生的突变。芽变是体细胞突变的一种，一般表现在枝、叶、花、果及物候期、成熟期等特征和特性上。人们通过芽变选种选育了很多优良的品种，柑橘主要栽培品种70％以上来自于体细胞变异，如脐橙、温州蜜柑、葡萄柚、克里曼丁橘的一系列品系。选择突变芽及其成长的枝，经过无性繁殖可以创造出新品种称芽变选种。芽变选种作为柑橘育种的一种方式，与其它育种方式(实生选种、杂交育种、辐射诱变育种、原生质体融合育种、转基因育种等)相比，有着独特的优势：其变异性状在田间容易被发现；可通过嫁接繁殖被保存下来；没有童期的干扰；可较快地进行鉴定和推广应用。由于芽变的经常发生以及变异的多样性，使得芽变成为无性繁殖植物变异选择的丰富源泉。随着分子生物学研究手段的迅速发展，人们在对芽变品种进行利用的同时开始研究芽变性状形成的分子机理，以期深入认识芽变的规律，利用基因工程手段定向改良柑橘品种。

目前对体细胞突变机理的研究特别是突变基因的挖掘和鉴定还缺乏有效的方法，特别是利用遗传学手段鉴定突变位点，所需要的时间长(果树一般需要5-10年才能获得杂交后代的果实)，另果树树体大，种植大规模群体的占地面积比较大。以500棵单株的柑橘群体为例，需要10亩地才能定值。因此，无论是正向遗传学(遗传群体定位策略)和反向遗传学(人工突变体库)方法鉴定突变位点在果树上都比较困难，在人力、物力和时间上都很难实现，获得成功的例子仅有少数几例。

通过全基因组序列信息挖掘为鉴定体细胞突变位点提供了一条快速、有效和低成本的途径。特别是二代测序的成本进一步下降(当前市场价降低到250元/Gbase)，通过全基因组测序的策略挖掘芽变位点的成本可以为单个课题组承担。但目前基于基因组测序挖掘体细胞突变位点还缺乏适合的方法(果树基因组具有杂合态等特点)，需要对序列信息分析流程和方法进行优化和改良。全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)。提取全基因组中所有的多态性位点，结合质量值、深度、重复性等因素做进一步的过滤筛选，得到可信度高的SNP数据集，有望在全基因组水平上扫描并检测与重要性状相关的基因序列差异，实现突变位点及重要性状候选基因的筛选。

单核苷酸多态性(SNP)，主要是指近缘种群或同种个体在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异常由单个碱基的转换(transition)或者颠换(transversion)所引起，组成DNA的碱基虽然只有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度。SNP被认为是继RFLP和SSR之后最有前途的第三代分子标记，在植物领域的遗传图谱构建、性状相关分子标记开发、以及生物学基础研究正在快速应用。

PCR扩增目的序列及对其产物进行测序是鉴别SNP的最简捷的方法。根据目的序列设计特异性引物，以不同个体的基因组DNA为模板，用同一PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增产物直接测序，仔细核对各个体的PCR产物序列就可查明该目的序列在所测各个体基因组之间是否存在SNP。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法。本发明可以揭示柑橘芽变品种的突变位点，为解析柑橘体细胞突变机制提供强有力的基因组工具。

为解决上述目的，本发明提供的一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，包括以下步骤：

1)首先对野生型柚和突变型柚的果皮、果肉各个组织进行深度30X的DNA重测序，并对得到的数据进行质量检测，去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；

2)然后以已发布的甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；再使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping，得到各组材料的多态性位点；

3)根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值；并综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，

4)采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的候选位点；对找到的候选SNP位点进行注释，并推测性状相关变异发生的染色体区域；

5)最后利用Sanger测序方法对候选位点进行实验验证。

进一步地，所述方法还用于果树芽变位点的挖掘和鉴定。

再进一步地，所述方法还用于木本植物体细胞突变位点的挖掘和鉴定。

再进一步地，包括以下步骤：

1)制备琯溪蜜柚红肉突变体的基因组DNA

在本实施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个组织的基因组DNA，其四个组织分别为外果皮、中果皮、囊衣和汁胞；

2)基因组测序

a.DNA测序文库的构建：基因组DNA的片段化、末端补平、磁珠纯化；加A即添加dAMP到双链DNA文库片段的3’端、加接头即连接带有3’-dTMP端的双链DNA接头到文库片段；磁珠纯化，切胶回收500bp左右大小的DNA片段；文库扩增；磁珠纯化；

b.DNA文库的测序

对建好的DNA文库用Qubit 2.0测定质量浓度，用Agilent 2100生物分析仪检测插入片段大小，用QPCR测定摩尔浓度，当质量浓度≥2nM、插入片段集中且符合目的大小即可判定文库合格。根据所需30X的数据量对各个文库取样，用hiseq2000-PE125的测序策略上机测序；

3、SNP分析

对测序得到的野生型柚和突变型柚的各个组织数据进行质量检测，并用Trimmomatic-0.30去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；以甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping的流程，得到各组材料全基因组范围内的SNP多态性位点。

4、突变位点挖掘

根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值，用以综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同，即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，用beagle软件对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的5个候选位点，并进行验证；

5、相关突变位点的验证

根据5个候选SNP位点所在的序列设计特异性引物，以不同的基因组DNA为模板，用PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增产物直接测序，比较各个体的PCR产物序列，验证该目的序列，最终确定统计水平最显著的候选位点即5号染色体上的SNP位点为突变位点。

本发明的有益效果在于：

1)芽变(体细胞变异)育种是果树独具特色的育种途径，70％的柑橘品种来自于芽变。本方法将为挖掘柑橘芽变位点、解析芽变机理以及未来进一步利用芽变机理育种提供重要工具和方法；

2)本发明基于基因组测序开发了适合于柑橘的信息分析方法，该方法最大的优势在于缩短了检测突变位点的时间，在3个月时间内挖掘到体细胞突变位点(而传统的遗传学方法在柑橘鉴定果实性状突变位点需要5-10年)，体现了基因组前沿技术和柑橘传统育种研究的结合与创新探索。

3)本发明的方法所需要的成本低，完成一个突变体突变位点挖掘的成本在3万元左右。相比于传统的遗传学办法，如种植大规模群体、遗传图谱构建以及性状定位在土地管理、材料维护、分子试剂等高昂的成本，本方法价格低廉。本方法对于其它果树芽变机理研究具有借鉴价值，有望推广应用到其它果树品种。

附图说明

图1为本发明的技术流程图。

图2为利用本发明找到的与柑橘果肉体细胞变异有关的SNP位点验证结果。利用Sanger测序方法对此发明找到的候选位点进行实验验证，找到与琯溪蜜柚红肉突变性状相关的5个SNP候选位点，运用PCR得到验证的是5号染色体上的一个SNP位点。在该位点，野生型白肉琯溪蜜柚的基因型为纯合的T/T，而突变体红肉琯溪蜜柚的基因型为杂合的T/G，其中一个T突变为G，并且对应的密码子由一个终止密码子(TAA)突变为具有编码氨基酸能力的氨基酸(GAA)。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1 琯溪蜜柚红肉突变体突变位点的挖掘

1、制备琯溪蜜柚红肉突变体的基因组DNA

在本实施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个组织(外果皮、中果皮、囊衣和汁胞)的基因组DNA。

2、基因组测序

2.1 DNA测序文库的构建

基因组DNA的片段化(用超声波打断仪将基因组DNA打断为200-1000bp的范围)；末端补平(产生平端的5’磷酸化片段)；磁珠纯化；加A(添加dAMP到双链DNA文库片段的3’端)；加接头(连接带有3’-dTMP端的双链DNA接头到文库片段)；磁珠纯化；切胶回收500bp左右大小的DNA片段；文库扩增(PCR扩增两端都带有特异接头序列的文库片段)；磁珠纯化。

2.1 DNA文库的测序

对建好的DNA文库用Qubit 2.0测定质量浓度，用Agilent 2100生物分析仪检测插入片段大小，用QPCR测定摩尔浓度，当质量浓度≥2nM、插入片段集中且符合目的大小即可判定文库合格。根据所需30X的数据量对各个文库取样，用hiseq2000-PE125的测序策略上机测序。

3、SNP分析

对测序得到的野生型柚和突变型柚的各个组织数据进行质量检测，并用Trimmomatic-0.30去除其中低质量的部分(碱基质量高于28，长度大于20)，得到各组材料高质量的测序reads；以甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping(最小深度为5，mapping质量值高于40)的流程，得到各组材料全基因组范围内的SNP多态性位点。

4、突变位点挖掘

根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值，用以综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同(p<0.05)，即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，用beagle软件对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的5个候选位点。实验见表1。

表1.利用突变体红肉琯溪蜜柚和野生型白肉琯溪蜜柚基因组比较筛选得到候选突变位点

5、相关突变位点的验证

根据5个候选SNP位点所在的序列设计特异性引物(引物信息见表2)，以琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个组织(外果皮、中果皮、囊衣和汁胞)的基因组DNA为模板，用PCR进行扩增(反应体系为：4ul PCR buffer，0.4ul dNTPs，0.2ul pfu聚合酶(均购自于湖北晶茂公司)，100ng DNA，正、反向引物各0.6μl，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：95℃5min；95℃30sec，55℃45sec，72℃45sec，35个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，反应是在S1000Thermal Cycler PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1XTAE缓冲液(0.04MTris-acetate，0.001M EDTA，pH8.0)，电压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存)，对所获得的扩增产物直接测序，比较各个体的PCR产物序列，验证该目的序列，最终确定统计水平最显著的候选位点即5号染色体上的SNP位点为突变位点。

表2:5个SNP候选位点所在染色体位置及根据其所在序列设计的特异性引物信息及PCR产物长度

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)首先对野生型柚和突变型柚的果皮、果肉各个组织进行深度30X的DNA重测序，并对得到的数据进行质量检测，去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；

2)然后以已发布的甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；再使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping，得到各组材料的多态性位点；

3)根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值；并综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，

4)采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的候选位点；对找到的候选SNP位点进行注释，并推测性状相关变异发生的染色体区域；

5)最后利用Sanger测序方法对候选位点进行实验验证。

2.根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：所述方法还用于果树芽变位点的挖掘和鉴定。

3.根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：所述方法还用于木本植物体细胞突变位点的挖掘和鉴定。

4.根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备琯溪蜜柚红肉突变体的基因组DNA

在本实施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个组织的基因组DNA，其四个组织分别为外果皮、中果皮、囊衣和汁胞；

2)基因组测序

a.DNA测序文库的构建：基因组DNA的片段化、末端补平、磁珠纯化；加A即添加dAMP到双链DNA文库片段的3’端、加接头即连接带有3’-dTMP端的双链DNA接头到文库片段；磁珠纯化，切胶回收500bp左右大小的DNA片段；文库扩增；磁珠纯化；

b.DNA文库的测序

对建好的DNA文库用Qubit 2.0测定质量浓度，用Agilent 2100生物分析仪检测插入片段大小，用QPCR测定摩尔浓度，当质量浓度≥2nM、插入片段集中且符合目的大小即可判定文库合格，根据所需30X的数据量对各个文库取样，用hiseq2000-PE125的测序策略上机测序；

3)SNP分析

对测序得到的野生型柚和突变型柚的各个组织数据进行质量检测，并用Trimmomatic-0.30去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；以甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping的流程，得到各组材料全基因组范围内的SNP多态性位点；

4)突变位点挖掘

根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值，用以综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同，即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，用beagle软件对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的5个候选位点；

5)相关突变位点的验证

根据5个候选SNP位点所在的序列设计特异性引物，以不同的基因组DNA为模板，用PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增产物直接测序，比较各个体的PCR产物序列，验证该目的序列，最终确定统计水平最显著的候选位点即5号染色体上的SNP位点为突变位点。