CN104611435B - 一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用 - Google Patents

一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104611435B
CN104611435B CN201510047010.5A CN201510047010A CN104611435B CN 104611435 B CN104611435 B CN 104611435B CN 201510047010 A CN201510047010 A CN 201510047010A CN 104611435 B CN104611435 B CN 104611435B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide
seq
sequence
primer
single stranded
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510047010.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104611435A (zh
Inventor
陈双燕
刘公社
齐冬梅
侯莉娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Botany of CAS
Original Assignee
Institute of Botany of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Botany of CAS filed Critical Institute of Botany of CAS
Priority to CN201510047010.5A priority Critical patent/CN104611435B/zh
Publication of CN104611435A publication Critical patent/CN104611435A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104611435B publication Critical patent/CN104611435B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种对不同种质的羊草进行基因分型的引物及其应用。本发明的引物由引物对1‑引物对17中任意所示的引物对组成。本发明利用羊草转录组数据开发的SNP引物能够对羊草不同种质进行基因分型，并且本发明方法简单、快捷、准确、通量高、成本低。本发明开发的SNP引物还可以用来进行羊草亲本选配、发展功能分子标记、用于羊草分子标记辅助育种、构建指纹图谱及用于羊草育成新品种的保护。

Description

一种对不同种质的羊草进行基因分型的SNP引物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种对不同种质的羊草进行基因分型的SNP引物及其应用。
背景技术
羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)是多年生禾本科赖草属植物，它是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为我国北方草原重要的乡土草，羊草不仅营养丰富、产量高、各类家畜均喜食，而且具有广泛的逆境适应能力，尤其对于一些极端气候和土壤条件。羊草还具有发达的横走根茎，穿透侵占能力很强，且能形成强大的根网，盘结固持土壤作用很大，是很好的水土保持植物。羊草的这些优异特性，使得它在我国北方草原生态建设、植被恢复、畜牧业的发展等方面起着独特的作用。
分子标记是反映生物个体间基因组中某种差异特征的DNA片段，来源于DNA水平的突变。分子标记技术在植物育种、遗传多样性分析、基因定位及绘制指纹图谱中发挥着越来越重要的作用。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)，是基因组上单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性。与其它类型的分子标记相比，具有明显的优势，表现在数量多，分布广泛，多态性丰富，密度高；一般只有两种碱基组成，是二等位基因(Biallelic)，只需+/-的分析，适于快速、规模化筛查基因组；某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平；SNP等位基因频率容易估计；易于基因分型；遗传稳定性比SSR高。因此，SNP被认为是应用前景最好的遗传标记之一。
随着测序技术的发展，转录组测序已经成为鉴定SNP多态性分子标记的重要数据源。基于转录组挖掘SNP分子标记的显著优点是这些潜在的SNP变异位于功能基因上可能直接与植物表型相关。目前基于转录组测序开发SNP标记已在玉米、大豆、水稻等作物中广泛开展，开发的SNP被广泛运用于遗传图谱构建和遗传多样性分析中。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的成套引物。
本发明提供的对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的成套引物为如下(1)-(17)中至少一种引物对：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7；
(8)为由SEQ ID No.15所示的单链DNA和SEQ ID No.16所示的单链DNA组成的引物对8；
(9)为由SEQ ID No.17所示的单链DNA和SEQ ID No.18所示的单链DNA组成的引物对9；
(10)为由SEQ ID No.19所示的单链DNA和SEQ ID No.20所示的单链DNA组成的引物对10；
(11)为由SEQ ID No.21所示的单链DNA和SEQ ID No.22所示的单链DNA组成的引物对11；
(12)为由SEQ ID No.23所示所示的单链DNA和SEQ ID No.24所示的单链DNA组成的引物对12；
(13)为由SEQ ID No.25所示的单链DNA和SEQ ID No.26所示的单链DNA组成的引物对13；
(14)为由SEQ ID No.27所示的单链DNA和SEQ ID No.28所示的单链DNA组成的引物对14；
(15)为由SEQ ID No.29所示的单链DNA和SEQ ID No.30所示的单链DNA组成的引物对15；
(16)为由SEQ ID No.31所示的单链DNA和SEQ ID No.32所示的单链DNA组成的引物对16；
(17)为由SEQ ID No.33所示的单链DNA和SEQ ID No.34所示的单链DNA组成的引物对17。
上述成套引物中，所述成套引物由上述17个引物对组成。
上述成套引物中，所述SNP位点为17个位点中的至少一种；
所述17个位点为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13、SNP14、SNP15、SNP16和SNP17；
所述SNP1位点的核苷酸为序列表中序列35的第67位核苷酸；所述SNP2位点的核苷酸为序列表中序列36的第148位核苷酸；所述SNP3位点的核苷酸为序列表中序列37的第31位核苷酸；所述SNP4位点的核苷酸为序列表中序列38的第60位核苷酸；所述SNP5位点的核苷酸为序列表中序列39的第54位核苷酸；所述SNP6位点的核苷酸为序列表中序列40的第37位核苷酸；所述SNP7位点的核苷酸为序列表中序列41的第100位核苷酸；所述SNP8位点的核苷酸为序列表中序列42的第36位核苷酸；所述SNP9位点的核苷酸为序列表中序列43的第104位核苷酸；所述SNP10位点的核苷酸为序列表中序列44的第38位核苷酸；所述SNP11位点的核苷酸为序列表中序列45的第28位核苷酸；所述SNP12位点的核苷酸为序列表中序列46的第55位核苷酸；所述SNP13位点的核苷酸为序列表中序列47的第47位核苷酸；所述SNP14位点的核苷酸为序列表中序列48的第38位核苷酸；所述SNP15位点的核苷酸为序列表中序列49的第37位核苷酸；所述SNP16位点的核苷酸为序列表中序列50的第106位核苷酸；所述SNP17位点的核苷酸为序列表中序列51的第51位核苷酸。
本发明另一个目的是提供含有上述成套引物的PCR试剂。
本发明提供的含有上述成套引物的PCR试剂为PCR试剂1或PCR试剂2或PCR试剂3或PCR试剂4或PCR试剂5或PCR试剂6或PCR试剂7或PCR试剂8或PCR试剂9或PCR试剂10或PCR试剂11或PCR试剂12或PCR试剂13或PCR试剂14或PCR试剂15或PCR试剂16或PCR试剂17；
所述PCR试剂1包括上述成套引物中的引物对1；
所述PCR试剂2包括上述成套引物中的引物对2；
所述PCR试剂3包括上述成套引物中的引物对3；
所述PCR试剂4包括上述成套引物中的引物对4；
所述PCR试剂5包括上述成套引物中的引物对5；
所述PCR试剂6包括上述成套引物中的引物对6；
所述PCR试剂7包括上述成套引物中的引物对7；
所述PCR试剂8包括上述成套引物中的引物对8；
所述PCR试剂9包括上述成套引物中的引物对9；
所述PCR试剂10包括上述成套引物中的引物对10；
所述PCR试剂11包括上述成套引物中的引物对11；
所述PCR试剂12包括上述成套引物中的引物对12；
所述PCR试剂13包括上述成套引物中的引物对13；
所述PCR试剂14包括上述成套引物中的引物对14；
所述PCR试剂15包括上述成套引物中的引物对15；
所述PCR试剂16包括上述成套引物中的引物对16；
所述PCR试剂17包括上述成套引物中的引物对17。
上述PCR试剂中，所述成套引物中的各个引物对独立包装，各个引物对中的各条引物独立包装。
上述PCR试剂中，所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15引物对16或引物对17的各条引物的物质的量相同。
本发明还有一个目的是提供含有上述成套引物或含有上述PCR试剂的试剂盒。
上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中所述SNP位点为17个位点中的至少一种；
所述17个位点为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13、SNP14、SNP15、SNP16和SNP17；
所述SNP1位点的核苷酸为序列表中序列35的第67位核苷酸；所述SNP2位点的核苷酸为序列表中序列36的第148位核苷酸；所述SNP3位点的核苷酸为序列表中序列37的第31位核苷酸；所述SNP4位点的核苷酸为序列表中序列38的第60位核苷酸；所述SNP5位点的核苷酸为序列表中序列39的第54位核苷酸；所述SNP6位点的核苷酸为序列表中序列40的第37位核苷酸；所述SNP7位点的核苷酸为序列表中序列41的第100位核苷酸；所述SNP8位点的核苷酸为序列表中序列42的第36位核苷酸；所述SNP9位点的核苷酸为序列表中序列43的第104位核苷酸；所述SNP10位点的核苷酸为序列表中序列44的第38位核苷酸；所述SNP11位点的核苷酸为序列表中序列45的第28位核苷酸；所述SNP12位点的核苷酸为序列表中序列46的第55位核苷酸；所述SNP13位点的核苷酸为序列表中序列47的第47位核苷酸；所述SNP14位点的核苷酸为序列表中序列48的第38位核苷酸；所述SNP15位点的核苷酸为序列表中序列49的第37位核苷酸；所述SNP16位点的核苷酸为序列表中序列50的第106位核苷酸；所述SNP17位点的核苷酸为序列表中序列51的第51位核苷酸。
本发明最后一个目的是提供一种对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的方法。
本发明提供的对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的方法包括如下步骤：用上述成套引物对待测羊草基因组DNA进行PCR扩增，得到待测羊草的PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行分析确定SNP位点的基因型。
上述方法中，上述成套引物对具体为引物对2。
上述方法中，所述SNP位点为序列表中序列36的第148位核苷酸。
上述方法中，所述SNP位点的基因型为GGGG、GGAA、GAAA、GGGA或AAAA。
上述方法中，对所述PCR扩增产物进行分析可为对所述PCR扩增产物进行HRM分析，或为对所述PCR扩增产物进行序列分析。
通过实验证明：本发明利用羊草转录组数据开发的SNP引物能够对羊草不同种质进行基因分型，并且本发明方法简单、快捷、准确、通量高、成本低。本发明开发的SNP引物还可以用来进行羊草亲本选配、发展功能分子标记、用于羊草分子标记辅助育种、构建指纹图谱及用于羊草育成新品种的保护。
附图说明
图1为从羊草转录组测序数据中鉴定出的SNP及其变异类型和数目。
图2为SNP引物对2在不同羊草种质中的扩增结果。
图3为以SNP引物对2为例，利用高分辨率溶解曲线分析后，羊草48个种质表现出不同的溶解曲线峰。
图4为以SNP引物对2为例，根据羊草不同种质表现出的差异溶解曲线峰，对羊草48个种质的基因分型结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、对羊草进行基因分型的SNP引物的获得及其应用
一、初步筛选对羊草进行基因分型的SNP引物
1、转录组数据的获得
采用常规的Trizol法提取羊草中科2号和羊草中科3号总RNA，通过电泳和NanoDrop检测获得的RNA的质量和含量。将合格的总RNA样品用带有oligo-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA。利用超声波将mRNA打断成短片段，以打断成短片段的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，用RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，再经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复，加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用罗氏454GS FLX Titanium和IlluminaHiSeqTM2000测序平台进行测序，获得羊草转录组测序数据。
2、转录组数据的拼装及生物信息学分析
首先对罗氏454GS FLX测序的原始数据进行评估，剔除杂质数据，包括接头序列、载体序列、短序列(≦60bp)及线粒体序列等，去除后的序列称为Clean reads，就可以进行拼装了。具体方法是利用Newbler(参数设置为默认参数)软件对测序数据进行拼装成转录本。取每条基因中最长的转录本作为Unigene，以此作为后续分析的参考序列。将得到的Unigene序列与蛋白质数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG进行blastx比对(E-value≦1e-5)，确定Unigene的序列方向及编码区，跟上述库比不上的Unigene，再用ESTScan预测其编码区并确定序列方向。同时，对这些基因进行功能注释，包括GO注释、KOG和KEGG功能分类，以及差异表达基因筛选，包括GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。
3、SNP的识别
首先对原始的Illumina HiSeqTM2000数据进行过滤去掉Q值小于30的碱基，去除后得到Clean reads，然后使用BWA将Clean reads map到454测序数据拼装后得到的Unigene上，然后利用samtools去call SNP，最后对SNP进行过滤，去掉深度超过100的SNP。BWA和samtools均使用软件推荐的参数。通过该方法成功鉴定出41,843个SNP，SNP变异的形式有多种，但类型主要有转换和颠换，转换是颠换的2倍左右(图1)。
4、SNP引物的设计
挑选50个SNP位点，利用DNAMAN(未说明的部分均使用软件默认参数)软件设计50对SNP引物。设计的方法如下：首先确定SNP位点所在序列的方向，如果序列是反向的，需要进行反向互补，然后与水稻基因组(http://rice.plantbiology.msu.edu/)进行BLASTN比较，确认序列的结构，保证扩增片段在一个外显子；在SNP位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度18-24bp；Tm 62-66℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃；GC含量40％-60％，45-55％最佳；产物大小为50-200bp；其它还应注意引物3'端尽量为GC，不应出现超过3个的连续G或C；引物不能形成发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之间不能有连续3个以上的碱基互补，尤其避免3'端的互补。
5、SNP引物的有效性验证
提取羊草YC45和YC48基因组DNA，以羊草基因组DNA为模板，采用待检测SNP引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；反应结束后，取3μL的PCR产物加入2μL loading buffer，以Trans2K Plus II DNA Marker为DNA分子量标准，用1.2％琼脂糖凝胶电泳法检测。能检测到目的条带且无其它杂带和引物二聚体的，该待检测引物即为有效引物，图2为部分扩增产物的电泳图。
PCR的反应体系10μl：30ng模板DNA、1.5mmol·L-1Mg2+、400μmol·L-1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L-1引物及10×PCR buffer和水。
PCR的反应程序：94℃预变性2min；然后94℃变性30s，72℃复性30s，72℃延伸30s(复性温度从72℃到58℃每个循环降落1℃)，然后进行30个循环94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
结果表明：挑选的50对SNP引物中，有42对引物能够扩增出条带，说明引物设计的方法较好，但其中的18对引物扩增出的条带比预期要大，暂不考虑进行HRM分析，另外24对引物扩增条带单一且产物大小与预期一致，为有效SNP引物，用于HRM分析。1对引物对应1个目标SNP位点，1对引物的扩增产物为含有对应SNP位点的DNA片段。
二、再次筛选对羊草进行基因分型的SNP引物
1、PCR扩增
以48个羊草种质(信息情况见表2)的基因组DNA为模板，分别采用上述24对SNP有效性引物进行PCR扩增，得到每个种质的24个引物对应的PCR扩增产物，每个引物对的PCR扩增产物为含有某个SNP位点的DNA片段。
PCR反应体系10μl：30ng模板DNA、1.5mmol·L-1Mg2+、400μmol·L-1dNTPs、0.5UTaqDNA聚合酶、1μmol·L-1引物及10×PCR buffer。
PCR反应程序：94℃预变性2min；然后94℃变性30s，72℃复性30s，72℃延伸30s(复性温度从72℃到58℃每个循环降落1℃)，然后进行30个循环94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
2、高分辨率溶解曲线(HRM)分析进行基因分型
PCR反应结束后，向步骤1中得到的各PCR扩增产物中加入1μL LCGreen(美国Idaho公司，货号BCHM-ASY-0005)，然后进行95℃30s，25℃30s；此程序结束后，得到反应产物，将反应产物放在LightScanner仪器上进行HRM分析，对羊草不同种质进行基因分型。
结果表明：有17对引物(如序列表中序列1-序列34)能够对上述48种羊草种质进行基因分型，其余7对引物因其高分辨率溶解曲线峰形杂乱，考虑用于基因分型时可信度不高，所以被淘汰。17个引物对对应的SNP位点信息表如表1所示，其中SNP1位点的核苷酸为序列表中序列35的第67位核苷酸；SNP2位点的核苷酸为序列表中序列36的第148位核苷酸；SNP3位点的核苷酸为序列表中序列37的第31位核苷酸；SNP4位点的核苷酸为序列表中序列38的第60位核苷酸；SNP5位点的核苷酸为序列表中序列39的第54位核苷酸；SNP6位点的核苷酸为序列表中序列40的第37位核苷酸；SNP7位点的核苷酸为序列表中序列41的第100位核苷酸；SNP8位点的核苷酸为序列表中序列42的第36位核苷酸；SNP9位点的核苷酸为序列表中序列43的第104位核苷酸；SNP10位点的核苷酸为序列表中序列44的第38位核苷酸；SNP11位点的核苷酸为序列表中序列45的第28位核苷酸；SNP12位点的核苷酸为序列表中序列46的第55位核苷酸；SNP13位点的核苷酸为序列表中序列47的第47位核苷酸；SNP14位点的核苷酸为序列表中序列48的第38位核苷酸；SNP15位点的核苷酸为序列表中序列49的第37位核苷酸；SNP16位点的核苷酸为序列表中序列50的第106位核苷酸；SNP17位点的核苷酸为序列表中序列51的第51位核苷酸。
高分辨率溶解曲线部分结果如下：图3为以SNP引物对2为例，对48个种质进行HRM分析的高分辨率溶解曲线；图4以SNP引物对2为例，48个种质的基因分型结果，A1-D12表示羊草48个种质，a-h表示分型的结果，每种颜色表示一种基因型，相同的颜色表示该SNP位点的基因型一致(图中S表示每个分组即每种颜色的一个标准种质)。
表3中列出了每对SNP引物对羊草48个种质的基因分型结果，每个字母代表一种基因型；相同的字母表示不同种质在该位点的基因型一致，un表示未知基因型，×表示未能检测出信号。
表1、17个引物对对应的SNP位点信息表
表2、48个羊草种质的信息情况
表3、每对SNP引物对羊草48个种质的基因分型结果
3、高分辨率溶解曲线分析结果的验证
通过对PCR产物测序对步骤2中高分辨率溶解曲线分析得到的基因分型的结果进行验证。具体步骤如下：挑选SNP2的不同分型群的PCR产物各2μl，连接到pMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5α，每个转化子挑选10个单克隆，利用ABI 3730测序仪进行测序，根据测序峰图和等位基因出现的频率确定基因型，并与HRM基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。
测序结果表明：引物对2对应的SNP2位点的不同类型基因分型群SNP2-a，SNP2-b，SNP2-c，SNP2-d，SNP2-e，SNP2-f对应的基因型分别为GGGG、GGAA、GAAA、GGGA、GGGG和AAAA，其中e群基因型目标位点与a群基因型一致(GGGG)，但是在扩增产物的其它位点有变异，所以产生新的基因型；
经过测序验证本发明的引物通过HMR分析对羊草进行基因分型的结果是可靠的。

Claims (9)

1.一种对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的成套引物，由如下(1)-(17)的17个引物对组成：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7；
(8)为由SEQ ID No.15所示的单链DNA和SEQ ID No.16所示的单链DNA组成的引物对8；
(9)为由SEQ ID No.17所示的单链DNA和SEQ ID No.18所示的单链DNA组成的引物对9；
(10)为由SEQ ID No.19所示的单链DNA和SEQ ID No.20所示的单链DNA组成的引物对10；
(11)为由SEQ ID No.21所示的单链DNA和SEQ ID No.22所示的单链DNA组成的引物对11；
(12)为由SEQ ID No.23所示的单链DNA和SEQ ID No.24所示的单链DNA组成的引物对12；
(13)为由SEQ ID No.25所示的单链DNA和SEQ ID No.26所示的单链DNA组成的引物对13；
(14)为由SEQ ID No.27所示的单链DNA和SEQ ID No.28所示的单链DNA组成的引物对14；
(15)为由SEQ ID No.29所示的单链DNA和SEQ ID No.30所示的单链DNA组成的引物对15；
(16)为由SEQ ID No.31所示的单链DNA和SEQ ID No.32所示的单链DNA组成的引物对16；
(17)为由SEQ ID No.33所示的单链DNA和SEQ ID No.34所示的单链DNA组成的引物对17。
2.含有权利要求1所述成套引物的PCR试剂。
3.含有权利要求1所述成套引物的试剂盒。
4.含有权利要求2所述PCR试剂的试剂盒。
5.权利要求1所述的成套引物在对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型中的应用。
6.权利要求2所述的PCR试剂在对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型中的应用。
7.权利要求3或4所述的试剂盒在对不同种质的羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型中的应用。
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于：所述SNP位点为17个位点中的至少一种；
所述17个位点为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13、SNP14、SNP15、SNP16和SNP17；
所述SNP1位点的核苷酸为序列表中序列35的第67位核苷酸；所述SNP2位点的核苷酸为序列表中序列36的第148位核苷酸；所述SNP3位点的核苷酸为序列表中序列37的第31位核苷酸；所述SNP4位点的核苷酸为序列表中序列38的第60位核苷酸；所述SNP5位点的核苷酸为序列表中序列39的第54位核苷酸；所述SNP6位点的核苷酸为序列表中序列40的第37位核苷酸；所述SNP7位点的核苷酸为序列表中序列41的第100位核苷酸；所述SNP8位点的核苷酸为序列表中序列42的第36位核苷酸；所述SNP9位点的核苷酸为序列表中序列43的第104位核苷酸；所述SNP10位点的核苷酸为序列表中序列44的第38位核苷酸；所述SNP11位点的核苷酸为序列表中序列45的第28位核苷酸；所述SNP12位点的核苷酸为序列表中序列46的第55位核苷酸；所述SNP13位点的核苷酸为序列表中序列47的第47位核苷酸；所述SNP14位点的核苷酸为序列表中序列48的第38位核苷酸；所述SNP15位点的核苷酸为序列表中序列49的第37位核苷酸；所述SNP16位点的核苷酸为序列表中序列50的第106位核苷酸；所述SNP17位点的核苷酸为序列表中序列51的第51位核苷酸。
9.一种对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的成套引物中的引物对2对待测羊草基因组DNA进行PCR扩增，得到待测羊草的PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行分析确定SNP位点的基因型；
所述SNP位点为序列表中序列36的第148位核苷酸；所述SNP位点的基因型为GGGG、GGAA、GAAA、GGGA或AAAA。
CN201510047010.5A 2015-01-29 2015-01-29 一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用 Active CN104611435B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510047010.5A CN104611435B (zh) 2015-01-29 2015-01-29 一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510047010.5A CN104611435B (zh) 2015-01-29 2015-01-29 一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104611435A CN104611435A (zh) 2015-05-13
CN104611435B true CN104611435B (zh) 2016-08-31

Family

ID=53146082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510047010.5A Active CN104611435B (zh) 2015-01-29 2015-01-29 一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104611435B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755493B (zh) * 2017-01-25 2020-04-21 中国科学院植物研究所 用于羊草品种鉴定的snp标记引物组合及鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181443A (zh) * 2011-03-21 2011-09-14 中国科学院植物研究所 一种多重检测基因组dna多态性的方法及其专用探针
CN103966335A (zh) * 2014-05-22 2014-08-06 山东农业大学 一种利用snp开发与snp紧密连锁的snp-ssr分子标记的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181443A (zh) * 2011-03-21 2011-09-14 中国科学院植物研究所 一种多重检测基因组dna多态性的方法及其专用探针
CN103966335A (zh) * 2014-05-22 2014-08-06 山东农业大学 一种利用snp开发与snp紧密连锁的snp-ssr分子标记的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Transcriptome exploration in Leymus chinensis under Saline-Alkaline treatment using 454 pyrosequencing》;Yepeng Sun,et al;《PLOS ONE》;20130131;第8卷(第1期);e53632 *
《山西白羊草种质资源遗传多样性的ISSＲ 分析》;李钰莹，等;《草业学报》;20140228;第23卷(第1期);217-222 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104611435A (zh) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Transcriptome sequencing of mung bean (Vigna radiate L.) genes and the identification of EST-SSR markers
Idrees et al. Molecular markers in plants for analysis of genetic diversity: a review
Laurentin et al. Genetic relationship and diversity in a sesame (Sesamum indicum L.) germplasm collection using amplified fragment length polymorphism (AFLP)
CN102747138B (zh) 一种水稻全基因组snp芯片及其应用
Xia et al. Allelic variations of a light harvesting chlorophyll a/b-binding protein gene (Lhcb1) associated with agronomic traits in barley
Jing et al. Gene-based sequence diversity analysis of field pea (Pisum)
Liu et al. A deep sequencing analysis of transcriptomes and the development of EST-SSR markers in mungbean (Vigna radiata)
CN109295179B (zh) 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒
Yang et al. Methods for developing molecular markers
Iangrai et al. Development and characterization of a new set of genomic microsatellite markers in rice bean (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi and Ohashi) and their utilization in genetic diversity analysis of collections from North East India
KR20180077873A (ko) 수박 분자마커이용여교잡 선발용 snp 마커
CN112575102B (zh) 控制莲心皮数的主效qtl、snp分子标记、kasp检测引物组及应用
CN104611435B (zh) 一种对不同种质的羊草进行基因分型的snp引物及其应用
KR102298723B1 (ko) 토마토 황화잎말림 바이러스 저항성 판별용 마커 및 이를 이용한 판별 방법
BRPI0614050A2 (pt) métodos para peneiramento de polimorfismos de hibridização especìficos de gene (gshps) e seus usos no mapeamento genético e desenvolvimento de marcador
CN107475417B (zh) 与燕麦β葡聚糖含量相关的分子标记及其应用
KR102439855B1 (ko) 토종닭 또는 육계 신품종을 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
CN112575103B (zh) 控制莲子单粒质量性状的qtl、分子标记、kasp检测引物组及应用
CN107988337A (zh) 一种抗稻瘟水稻鉴定方法和基因的标记方法及其应用
CN102443583A (zh) 外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法
CN108588242B (zh) 一种长牡蛎ahr基因的snp位点
CN111647677A (zh) 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-6D紧密连锁的分子标记及应用
CN109868330A (zh) 一种基于RNA-Seq开发的小扁豆EST-SSR标记及应用
KR102527604B1 (ko) 황어 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법
KR102369297B1 (ko) 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant