CN109321582A - 粗山羊草Yr4DS基因在麦族植物抗条锈病育种的应用 - Google Patents

粗山羊草Yr4DS基因在麦族植物抗条锈病育种的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粗山羊草Yr4DS基因及其在麦族植物抗条锈病育种中的应用，本发明首次从粗山羊草中克隆得到了一个新型小麦抗条锈病基因Yr4DS，所述基因的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。该基因能够有效的调控小麦抗条锈病的能力，丰富了小麦抗条锈病基因资源。本发明发现Yr4DS的表达提供高水平抗条锈病的功能，预示着人为操作Yr4DS基因可以赋予小麦等麦族植物抗条锈病的特性。本发明可通过基于Yr4DS基因的分子标记辅助育种、遗传转化和基因编辑等技术，用于改良现有小麦等麦族植物的抗条锈病水平，培育和创制抗条锈病中间材料和生产品种。

Description

粗山羊草Yr4DS基因在麦族植物抗条锈病育种的应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种粗山羊草Yr4DS基因及其在麦族植物抗条锈病育种的应用。
背景技术
小麦条锈病(Wheat Stripe Rust,orYellow Rust)是由小麦专化型条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici.，Pst)引起的真菌病害，在全球范围内危害小麦的生产。小麦条锈病通常可造成0.5％-5％的产量损失，严重发生时可导致5％-25％的产量损失，甚至绝产(Chen.2005.Canadian Journal ofPlant Pathology 27:314-337)。中国是世界上小麦条锈病普遍发生的区域，曾发生4次小麦条锈病大流行(1950、1964、1990和2002年)，每次大流行均导致上亿公斤的产量损失，小麦产量损失总计约12亿公斤，其中1950年的产量损失约合全国小麦总产量的41.4％(陈万权等，2013。中国农业科学46:4254-4262)。
利用抗病品种是防治病害最为经济、有效且环保的措施。小麦育种中普遍存在遗传基础狭窄的弊端，导致多数品种缺乏有效的抗条锈病基因或现有抗病基因的抗病性逐渐丧失等现象(康振生等，2015。中国农业科学48:3439-3453)。另外，小麦条锈菌存在有性生殖、毒性变异快，导致新型致病小种的不断进化，这也造成了很多小麦品种在推广3-5年后就“丧失”抗病性(陈万权等，2013。中国农业科学46:4254-4262)。当前，生产上可用的小麦抗病资源日渐匮乏、形势严峻。因此，分离新的抗病基因是当前小麦抗病育种中亟待解决的问题。通过抗病新基因的分离，可拓宽小麦抗源，促进抗病品种的培育；并可通过基因工程或分子标记辅助选择等方法与已知基因进行多基因聚合，培育具有持久抗性、广谱抗性的种质材料。
利用抗病基因是控制条锈病的重要手段，全球范围内已经在小麦及其近缘植物基因组中定位了上百个抗条锈病基因，但由于小麦基因组巨大并复杂等因素，已知序列的抗条锈病基因的数量非常有限。迄今为止，只有Yr5、Yr7、Yr15、Yr18和Yr36五个基因得以克隆(Fu et al.2009.Science 323:1357-1360；Krattinger et al.2009.Science 323:1360-1363；Marchal et al.2018.Nature Plants4:662-668；Klymiuk et al.2018.NatureCommunications 9:3735)，大大限制了抗条锈病基因在小麦等作物育种中的有效利用。
发明内容
针对上述现有技术，为解决抗病基因资源缺乏的困难，本发明提供了一个从小麦祖先粗山羊草(Ae.tauschii ssp.strangulata)中分离的新基因Yr4DS，并通过功能验证确认了该基因的表达可提高小麦和大麦的抗条锈病水平。利用本发明，可将Yr4DS抗条锈病基因应用于麦族植物抗病育种，促进抗条锈病小麦和大麦品种或种质材料的培育。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种抗条锈病基因，命名为Yr4DS基因，所述Yr4DS基因为以下a)-j)中任一项所述的核酸：
a)核酸，其由SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成；
b)核酸，其由SEQ ID NO.3所示的碱基序列组成；
c)核酸，其由SEQ ID NO.5所示的碱基序列组成；
d)核酸，其由SEQ ID NO.7所示的碱基序列组成；
e)核酸，其由SEQ ID NO.9所示的碱基序列组成；
f)核酸，其由SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成；
g)核酸，其由编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的碱基序列组成；
h)核酸，其由编码SEQ ID NO.4所示蛋白质的碱基序列组成；
i)核酸，其由编码SEQ ID NO.6所示蛋白质的碱基序列组成；
j)核酸，其由编码SEQ ID NO.8所示蛋白质的碱基序列组成。
其中，Yr4DS基因全长cDNATV1序列如SEQ ID NO.1所示；Yr4DS基因全长cDNA TV2a序列如SEQ ID NO.3所示；Yr4DS基因全长cDNATV3序列如SEQ ID NO.5所示；Yr4DS基因全长cDNATV4序列如SEQ ID NO.7所示；Yr4DS基因组全长表达框架，包括启动子、基因组编码区和终止子，其核甘酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明的第二方面，提供一种由上述抗条锈基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
其中，SEQ ID NO.1所示的Yr4DS基因全长cDNATV1编码的蛋白Yr4DS蛋白TV1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.3所示的Yr4DS基因全长cDNATV2a编码的蛋白Yr4DS蛋白TV2a，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；SEQ ID NO.5所示的Yr4DS基因全长cDNATV3编码的蛋白Yr4DS蛋白TV3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；SEQ ID NO.7所示的Yr4DS基因全长cDNATV4编码的蛋白Yr4DS蛋白TV4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
携带上述抗条锈病基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供如下a)-f)中任一项所述的DNA片段作为抗条锈病基因在植物育种或小麦和大麦条锈病防治中的应用；
a)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的cDNA片段；
b)编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的cDNA片段；
c)SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA片段；
d)编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的DNA片段；
e)cDNA片段或DNA片段，其编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6或SEQ ID NO.8所示的蛋白等价，但在氨基酸序列上存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入；
f)cDNA片段或DNA片段，其在严格条件下与a)或c)的DNA片段杂交，且编码SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的蛋白。
本发明的第四方面，提供如下1)-4)中任一项所述的DNA片段通过调控抗条锈病基因表达在植物育种或小麦和大麦条锈病防治中的应用；
1)DNA片段，其转录产物在植物细胞中上调SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达；
2)DNA片段，其翻译产物在植物细胞中上调SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达；
3)DNA片段，其转录产物在植物细胞中对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的转录RNA具有上调作用；
4)DNA片段，其翻译产物在植物细胞中对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因编码的蛋白具有上调作用。
本发明的第五方面，提供含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌或小麦抗条锈基因编码的蛋白在培育条锈病抗性提高或降低的麦族植物中的应用；优选的，所述麦族植物为小麦或大麦。
本发明的第六方面，提供一种抗条锈病小麦的培育方法，所述培育方法包括：将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因转入小麦或大麦中，获得抗条锈病小麦或大麦；或者上调小麦或大麦基因组中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达，筛选得到条锈病抗性提高的小麦或大麦植株。
上述培育方法中，将抗条锈病基因转入小麦或大麦中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。
上述培育方法中，上调小麦或大麦基因组中的抗条锈病基因的表达的方法包括：导入能够激活或提高小麦抗条锈病基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性的DNA片段；或者控制特异小RNA分子的合成，上调小麦抗条锈病基因mRNA的积累。
所述特异小RNA分子包括：微小RNA分子(microRNA，miRNA)、干扰小RNA(smallinterfering RNA，siRNA)或人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)。
本发明的第七方面，提供一种培育条锈病抗性降低的小麦或大麦的方法，所述方法包括：抑制小麦或大麦基因组中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达，筛选得到条锈病抗性降低的小麦或大麦植株。
上述方法中，抑制小麦或大麦基因组中的抗条锈病基因的表达的方法包括：突变或敲除小麦或大麦中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示基因的全部或者部分序列；或者使用干扰RNA干扰SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示基因的表达；或者使用基因沉默系统使SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示基因沉默。
本发明的第八方面，提供一种用于鉴定小麦抗条锈病基因的分子标记，所述分子标记有三个，分别命名为Yr4DS-PM、Yr4DS-GM和Yr4DS-TM。上述三个分子标记均可以区分抗条锈病和感条锈病的不同粗山羊草家系。
其中，Yr4DS-PM是基于Yr4DS基因启动子区域设计的PCR标记，其核苷酸序列如SEQID NO.61所示。
用于扩增该Yr4DS-PM的引物为Yr4DS-FP1(SEQ ID NO.11)和Yr4DS-RP1(SEQ IDNO.12)。若扩增条带长度为727bp，则与粗山羊草高抗小麦条锈病的性状紧密连锁；若不扩增或扩增产物为575bp，则建议相应的粗山羊草不抗小麦条锈病。
Yr4DS-GM是基于Yr4DS基因编码区区域设计的PCR标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO.62所示。
用于扩增Yr4DS-GM的引物为Yr4DS-FP2(SEQ ID NO.13)和Yr4DS-RP2(SEQ IDNO.14)。将扩增产物用HaeIII酶酶切后，若出现一条361bp的条带，则与粗山羊草高抗小麦条锈病的性状紧密连锁；若出现两条240bp和121bp的条带，则建议相应的粗山羊草不抗小麦条锈病。
Yr4DS-TM是基于Yr4DS基因终止子区域设计的PCR标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO.63所示。
用于扩增Yr4DS-TM的引物为Yr4DS-FP3(SEQ ID NO.15)和Yr4DS-RP3(SEQ IDNO.16)。若扩增条带长度为858bp，则与粗山羊草高抗小麦条锈病的性状紧密连锁；若不扩增，则建议相应的粗山羊草不抗小麦条锈病。
本发明的第九方面，提供一种获得携带所述抗条锈病基因的植物细胞的方法，通过转基因或基因组编辑手段而获得。
本发明的第十方面，提供一种获得携带所述抗条锈病基因的植株的方法，由上述方法获得的植物细胞再生成苗。
本发明的有益效果：
本发明首次从粗山羊草中克隆得到了一个新型抗条锈病基因Yr4DS，该基因能够有效的调控麦族植物(特别是小麦和大麦)抗条锈病的能力，丰富了抗条锈病基因资源。本发明发现Yr4DS的表达提供高水平抗条锈病的功能，预示着人为操作Yr4DS基因可以赋予小麦等麦族植物抗条锈病的特性。本发明可通过基于Yr4DS基因的分子标记辅助育种、遗传转化和基因编辑等技术，用于改良现有小麦、大麦等麦族植物的抗条锈病水平，培育和创制抗条锈病中间材料和生产品种。
附图说明
图1：鉴定粗山羊草Yr4DS基因的三个有效标记Yr4DS-PM、Yr4DS-GM和Yr4DS-TM；其中，Yr4DS-PM和Yr4DS-TM为PCR的直接扩增产物；Yr4DS-GM为PCR扩增产物的HaeIII酶切结果。粗山羊草CIae9、PI511383高抗小麦条锈病；粗山羊草PI486274和PI560536高感小麦条锈病；SM1675和SW3为携带抗病型Yr4DS拷贝的六倍体小麦；中国春(CS)和六倍体小麦CB037不携带抗病型Yr4DS基因。品系后括弧内的字母代表该品系抗条锈病(R)或感条锈病(S)，星号(*)表示其抗病性受遗传背景或其它抗病基因的影响。M代表分子量标准样品。
图2：Yr4DS基因在粗山羊草成株期叶片中的表达；其中，Rpool、Spool分别代表组成抗病池和感病池的F6代纯合株系；图中：上图应用RT-PCR检测了Yr4DScDNA的表达情况，样品包括抗条锈病粗山羊草亲本PI511383，感条锈病粗山羊草亲本PI486274以及二者来源的F6代纯合株系所组成的BSA抗病池(Rpool，包括12个株系，每个株系都显示Yr4DScDNA阳性，这里只展示其中的4个株系)和BSA感病池(S pool，包括11个株系，每个株系都显示Yr4DScDNA阴性，这里只展示其中的4个株系)。RT-PCR检测应用到PCR引物Yr4DS-FP4和Yr4DS-RP4(表1)。下图应用RT-PCR测试了对应样品中粗山羊草Actin基因(内源参照)的表达情况，应用到PCR引物Actin-FP和Actin-RP(表1)。
图3：抗病型Yr4DS基因的突变导致人工合成小麦在成株期高感小麦条锈病。图中，L68和L91为人工合成小麦(Syn-SAU-93，携带抗病型Yr4DS基因)的M3代EMS突变体(表2)，高感小麦条锈病(感染型介于8-9)。相应的野生型对照(WT)表现中抗小麦条锈病(感染型介于3-4)。比例尺＝1cm。
人工合成小麦‘Syn-SAU-93(AS2382/AS2388)’表现良好的成株抗条锈病水平,感染型介于3-4(Infection type或IT；Line and Qayoum.1992.USDATechnical Bulletin1788)。图3为M3突变体(L68和L91；表2)及野生型对照(WT＝Syn-SAU-93)在成株期感染小麦条锈菌后的发病情况，Yr4DS基因突变体高感小麦条锈病(IT介于8-9)，野生型对照表现中抗小麦条锈病(IT介于3-4)。
图4：利用小麦‘CB037’和大麦‘Golden Promise’开展Yr4DS等基因的遗传互补研究图；图中：A)图片为携带Yr4DS等基因组全长表达框架(SEQ ID NO:5)的质粒，该质粒骨架是pCC1FOS，红色线条代表载体区段；共转化载体为PC174，上面携带除草剂筛选标记BAR基因，该质粒骨架为pCAMBIA1300。B)图片为转基因小麦植株接菌后的反应，并利用PCR方法验证了植株中三个基因的整合和表达情况。三个基因的排列为RLK1(左)、RLK2(中)和Yr4DS(右)。C)图片为转基因大麦植株接菌后的反应，也检测了三个基因的整合和表达情况(左边RLK1，中间RLK2，右边Yr4DS)，“+”代表整合或表达，“-”代表未整合或未表达。小麦“CB037”和大麦“Golden Promise”(GDP)为非转基因野生型对照。比例尺＝1cm。
图5：转基因小麦和大麦植株中RLK1、RLK2和Yr4DS基因的全长表达情况；图中展示了针对PC1104质粒不同类型转基因植株(G1-G6)中三个基因的表达，不同类型参照表3。使用双轮PCR检测目标基因的表达：第一轮使用长跨度PCR引物富集目标及其同源基因的全长转录本，第二轮使用特异PCR引物仅扩增三个目标基因的转录本。对于Yr4DS基因，同时检测了两类全长转录本，分别为Yr4DSTV1和Yr4DSTV4。另外使用肌动蛋白(ACTIN)基因作为内参对照，该对照只需要一轮PCR。虚线左边为小麦植株，虚线右边为大麦植株。PI511383为野生型阳性对照(PC)；CB037和GDP为野生型阴性对照(NC)。图中白色箭头指示基因组拷贝的扩增产物或其它非特异扩增产物。M代表分子量标准样品。比例尺＝1cm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，由于小麦基因组巨大并且复杂，已知序列的抗条锈病基因的数量非常有限，大大限制了抗条锈病基因在小麦育种中的有效利用。基于此，本发明的目的是提供一种新的抗条锈病基因，并将其用于小麦、大麦等麦族植物的育种。
本发明利用RNA测序(RNA-seq)和集团分离分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA),比较了粗山羊草分离群体F6世代的抗条锈病BSA池和感条锈病BSA池在成株期的叶片转录组(transcriptome)，从中鉴定到只在抗条锈病亲本(PI511383)和抗条锈病BSA池中表达的基因，进一步筛选到一个在PI511383上特异表达、具有NBS-LRR结构域、位于粗山羊草4DS染色体的基因，故命名为Yr4DS基因。结果表明，人为操作Yr4DS基因可以提高小麦和大麦的抗条锈病水平。本发明可用于提高小麦等麦族植物的抗条锈病水平、培育高抗条锈病的中间材料和生产品种。
Yr4DS基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7所示；Yr4DS基因编码的蛋白(即Yr4DS蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示；Yr4DS基因组全长表达框架，包括启动子、基因组编码区和终止子，其核甘酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明涉及编码粗山羊草Yr4DS蛋白及其同源蛋白的cDNA、合成DNA和基因组DNA的应用。本领域的技术人员利用常规技术即可获得Yr4DS基因相关的cDNA和基因组DNA。cDNA的制备涉及如下步骤：a)从粗山羊草或其它物种中提取信使RNA(message RNA，mRNA)；b)利用mRNA作为模板合成cDNA；c)根据本发明Yr4DS基因全长cDNA序列SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7设计PCR引物，然后从cDNA模板中扩增Yr4DS基因或其同源基因；d)将PCR产物克隆到质粒载体，分离出Yr4DS基因或其同源基因的cDNA；e)利用Yr4DS基因cDNA序列为模板，委托商业服务人工合成DNA。同理，本领域的技术人员也可以从粗山羊草或其它物种中提取基因组DNA，用以创建基因组DNA文库(如BAC、cosmid、fosmid等类型文库)，再利用基于本发明Yr4DS基因组全长表达框架的核苷酸序列(如SEQ ID NO.10)的DNA探针或PCR引物筛选DNA文库，获得携带Yr4DS基因的阳性质粒。也可采用长片段PCR方法，利用本发明Yr4DS基因组全长表达框架的核苷酸序列(如SEQ ID NO.10)的特异PCR引物，从植物基因组DNA或质粒DNA扩增Yr4DS基因或其同源基因，再将PCR产物连接到克隆载体。
本发明包括Yr4DS同源DNA片段，只要它们编码的蛋白与Yr4DS蛋白(如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)功能等价。本文所指的“与Yr4DS蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中Yr4DS蛋白(如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)接近。Yr4DS蛋白典型的生物学功能是提供抗条锈病功能。为验证Yr4DS基因是否抗小麦条锈病，可使用甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)创建‘携带Yr4DS基因的人工合成小麦’的突变群体(实施例4和5)，通过接种鉴定出高感小麦条锈病的突变个体，再分析Yr4DS基因的突变情况，分析Yr4DS基因的突变频率和感病表型的相关性。为明确Yr4DS基因的功能，也可采用遗传互补(genetic complementation)手段加以验证。本发明利用基因枪轰击(biolisticsbombardment)技术将Yr4DS基因组全长表达框架载体(如SEQ ID NO.10)导入高感条锈病的小麦‘CB037’和大麦‘Golden Promise’(实施例6)；利用所获得的转基因植株，分析了Yr4DS转基因的表达对小麦和大麦抗条锈病的贡献。
如果DNA片段编码的蛋白功能等价于Yr4DS蛋白(如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)，这些DNA片段的优选来源是单子叶植物(monocotyledon)，更优选来源是禾本科植物(Gramineae)，最优选来源是小麦族植物(Triticeae)。这些DNA片段包括本发明核苷酸序列(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明Yr4DS蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。
基因组编辑(genome editing)技术，可以定向敲除目的基因，在动植物上均有应用(Cheng andAlper.2014.Current Opinion in Biotechnology 30:87-94)。部分基因组编辑技术，如规律性重复短回文序列簇(clustered,regularly interspaced,shortpalindromic repeats，CRISPR)在小麦等作物上(Shan et al.2014.Nature Protocols 9:2395-2410；Wang et al.2014.Nature Biotechnology 32:947-951；Zhang etal.2016.Nature Communications 7:12617)都得到了成功应用。基因组编辑技术会造成靶标基因的特定区域发生一个、数个或数十个碱基的删除或插入、导致基因突变，位于转录区域的DNA变异则可能造成编码蛋白的变异或截短(truncation)(Wang et al.2014.NatureBiotechnology 32:947-951)。转录区域DNA的碱基突变也会引起编码蛋白的氨基酸改变。利用基因组编辑或碱基突变创建的DNA片段，其编码的蛋白与Yr4DS蛋白(如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)相比，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入等现象，但只要该DNA片段编码的蛋白与Yr4DS蛋白(如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)功能等价，该DNA片段即属于本发明的应用内容。本发明界定的DNA片段还包括那些发生了碱基突变，但不改变编码蛋白序列的突变，即保守突变(conservative mutation)。
对于本领域的技术人员，可以采用基因组编辑技术改变本发明内容中Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7)及其同源基因序列。另外，目标基因的变异可以通过突变诱导产生或通过种质筛选鉴定本已存在的自然变异。比如，Slade等人(2005)创建了小麦的EMS突变群体，进而采用定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING)技术鉴定目标基因的点突变(Slade et al.2005.Nature Biotechnology 23:75-81)。自然种质的长期进化积累了大量的变异，也可以采用Ecotilling手段从自然种质或育成品种中鉴定目标基因的变异(Tillet al.2006.Nature Protocols 1:2465-2477)。对于本领域的技术人员，可以创建相关植物材料的突变群体，再从中筛选本发明内容中DNA片段(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)发生变异的个体。本领域的技术人员还可以从相关植物的自然种质或育成品种中鉴定本发明DNA片段(如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)的自然变异。因此，本发明还涵盖：a)所有通过基因组编辑、诱变或自然变异筛选而获得的携带本发明内容的DNA片段(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)发生变异的植物细胞；b)携带a)项植物细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆或植株后代等，只要它们仍携带a)项植物细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等，只要它们仍携带a)项植物细胞。
对于本领域的技术人员，获得DNA片段、使得它们编码的蛋白与Yr4DS蛋白(如SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)功能等价的方法很多，如PCR方法(Saiki et al.1985.Science 230:1350-1354；Hemsley et al.1989.Nucleic AcidsResearch 17:6545-6551；Landt et al.1990.Gene 96:125-128)、DNA重组技术和DNA人工合成技术(Kosuri and Church.2014.Nature Methods 11:499-507)。可以说，对于本领域的技术人员，从小麦或其它植物中获得与Yr4DS基因高度同源的DNA片段为常规技术，可利用对应本发明核苷酸序列(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQID NO.9或SEQ ID NO.10)的PCR引物，或使用对应本发明核酸序列(如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)的DNA探针，通过筛选基因组DNA或cDNA文库，获得相应的DNA片段。对于DNA片段的获得，无论是通过PCR方法、DNA重组、DNA人工合成还是其它同类技术，只要这些DNA片段所编码的蛋白与Yr4DS蛋白(如SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)功能等价，这些DNA片段就属于本发明内容。这些DNA片段所编码的氨基酸序列应当与本发明Yr4DS蛋白氨基酸序列(如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8)高度同源；这里所指的高度同源，意味着两者之间在能够匹配的区段上，氨基酸序列的等同率(sequence identity)至少50％或更高，优选70％或更高，更优选90％或更高(比如95％、96％、97％、98％和99％或更高)。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal ofMolecular Biology 215:403-410；Karlin and Altschul.1993.Proceedings of theNational Academy of Sciences 90:5873-5877)。
分子标记辅助选择育种利用有效分子标记加速育种进程和提高育种效果。当前，有效利用的标记包括：单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism)、酶切扩增多态性序列(Cleaved amplifiedpolymorphic sequence)、衍生酶切扩增多态性序列(Derived cleaved amplifiedpolymorphic sequence)和竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR)等。本领域的技术人员可以运用类似的标记创建方法，根据本发明Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQID NO.9或SEQ ID NO.10)或其同源基因的DNA片段，设计可用于抗条锈病基因回交转育和抗病基因聚合的分子标记(比如本发明设计的Yr4DS-PM标记；实施例3、图1)；利用有关分子标记开展小麦等作物的抗条锈病分子育种属于本发明内容。
从应用角度出发，本发明Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)或其同源基因的DNA片段，当导入高感条锈病的植物后，很可能创制出高抗条锈病的表型。换句话说，对于本发明Yr4DS基因(如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)或其同源基因的DNA片段或该DNA片段的重组载体，将它们导入高感条锈病的植物后，转基因细胞则分化再生形成高抗条锈病的转基因植株，从而将感病植物转变为抗病植物。反过来，也可以创制调控Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)或其同源基因表达的转基因植物。这里所指的“调控表达”包括DNA转录水平、cDNA翻译水平和蛋白产物活性三个层面，包括上调和下调两种程度。比如说，根据本发明Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)或其同源基因挖掘到的能够激活或提高该基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性等的DNA片段，或将它们插入合适质粒载体，将以上DNA片段或其承载质粒导入携带Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQID NO.10)或其同源基因的植株细胞，转基因细胞分化形成高抗条锈病的转基因植株。再比如，对于Yr4DS基因或其同源基因，或存在与之作用的微小RNA分子(microRNA，miRNA)、干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)或与之作用的人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)；通过合理控制特异小RNA分子(amiRNA、miRNA和siRNA)的表达，从而调控Yr4DS基因或其同源基因mRNA的积累，提高植物的抗条锈病水平。
本发明对用于开展植物细胞转化的质粒载体没有限制，只要它们在植物细胞中能够表达承载基因。比如，使用携带组成型启动子(如玉米Ubi启动子；Christensen etal.1992.Plant Molecular Biology 18:675-689)或叶片特异启动子的载体。本发明所指的“植物细胞”形式多样，包括各类具备生命全能性的单细胞、多细胞、植物组织或器官，可以是悬浮培养细胞、原生质体细胞，也可以是植物切片组织、植物愈伤组织，它们统一的特点是通过分化再生或无性繁殖能形成植株或部分植株。本发明所指的“植物细胞”还涵盖各种植物来源的细胞，比如小麦、大麦和其他麦族植物，它们统一的特点是通过分化再生或无性繁殖能形成植株或部分植株。
对于本领域的技术人员，可以使用各种手段将质粒载体导入植物细胞，比如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)法，电穿孔(electroporation)法，农杆菌介导法，基因枪轰击法等，并将转化细胞发展成为转基因植株。在植物领域，各种转基因技术趋向成熟，并得到广泛应用。以上这些方法和其他类似方法均适用于本发明领域。
对于携带本发明DNA片段的转基因植株，进而通过有性或无性方式得到它们的有性后代(如种子)、无性克隆(如不定枝、愈伤、原生质体等)、分生组织(如芽点、茎尖、根尖等)，可以大量繁殖转基因植株。因此，本发明涵盖：a)所有携带本发明内容DNA片段的转基因植物细胞；b)携带a)项转基因细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆和植株后代等，只要它们仍携带a)项转基因细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等，只要它们仍携带a)项转基因细胞。利用以上方式获得的转基因植株或携带转基因细胞的植株，其抗条锈病能力在理论上将有别于野生型对照植株。比如，将粗山羊草Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)或其同源基因导入感条锈病植株，创制高抗条锈病的植株。
综上所述，本发明集中在Yr4DS基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)在麦族植物抗条锈病领域的应用。利用感条锈病的植物作为受体，在叶片等组织中表达Yr4DS基因或其同源基因，可能将感条锈病植物转变为高抗条锈病的植物。由此推测，Yr4DS及其同源基因将在麦族植物的抗条锈病育种中发挥作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
本发明利用粗山羊草PI511383和PI486274作为亲本，创制了杂交高代的重组自交系(F6)。为测试它们的抗条锈病水平，本发明利用小麦条锈菌(Pst小种包括CYR29,CYR30,CYR31,CYR32,CYR33,CYR34,贵22-1，SY11-4,或HY46-8等)接种鉴定。粗山羊草在温室条件下种植，温室配备长日照(16h、105μmolm-2s-1)，白天温度25-30℃，夜间温度15-20℃。粗山羊草的接种采用注射法或抖粉法，然后在10℃、黑暗和高湿(100％)条件下保持24h，随后转移到人工气候室：8h黑夜、12℃；16h光照、18℃。本发明中分子生物学实验的用水、常规药品以及植物激素购自美国飞世尔科技公司(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)和美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，植物组织培养基购自美国植物技术公司(PhytoTechnology Laboratories，Overland Park，KS，USA)，微生物培养基购自美国BD公司(Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，USA)，抗生素和双丙氨膦(bialaphos)购自美国GoldBio公司(Gold Biotechnology，St.Louis，MO，USA)。本发明所涉及的PCR引物及序列见表1。
表1：本发明中应用到的PCR引物
备注：RT-PCR中内参引物Actin-FP和Actin-RP在小麦大麦和粗山羊草上都工作。
表2：高感条锈病人工合成小麦突变体中候选基因的突变情况1
1本表格描述了Yr4DS区域的三个基因的删除和点突变情况。肌动蛋白(ACTIN)基因用作内参评估DNA样品的质量。扩增引物包括RLK1(RLK1-FP1和RLK1-RP1)，RLK2(RLK2-FP1和RLK2-RP1)，Yr4DS(YR4DS-FP5和YR4DS-RP5)和ACTIN(Actin-FP和Actin-RP)。“+”代表PCR扩增阳性；“-”代表PCR扩增阴性，反映目标基因的整体或部分删除。目标基因扩增阳性的植株，对于所携带的RLK2和Yr4DS基因进行测序，所有个体的RLK2基因未出现编码序列的碱基突变，但Yr4DS基因的编码序列存在碱基突变。
2左侧字母为抗病型Yr4DS基因的碱基，中间数字代表cDNA水平相对于起始密码子ATG的碱基位置，右侧字母为突变后的碱基。
3左侧字母为抗病型Yr4DS蛋白中对应的氨基酸，中间数字代表相对于首位氨基酸的位置，右侧字母为突变后的氨基酸。
表3：不同目标基因的表达对转基因植株抗条锈病水平的影响
1首先酶切处理质粒PC1104，再用于小麦和大麦的转化。质粒的酶切处理包括：未酶切(Intact＝I)，BsrGI酶切(B1)，NotI酶切(N1)，XbaI酶切(X1)，和XbaI+KpnI双酶切(XK1)。通过检测Yr4DS区域的三个基因的表达及其转基因植株的抗条锈病水平，判断各个基因在抗条锈病中的作用。扩增引物包括RLK1(一轮引物RPK1-FP1和RLK1-RP2,二轮引物RPK1-FP3和RLK1-RP3),RLK2(一轮引物RLK2-FP2和RLK2-RP2,二轮引物RLK2-FP3和RLK2-RP3),Yr4DS(TV1一轮引物YR4DS-FP6和YR4DS-RP6，TV1二轮引物YR4DS-FP7和YR4DS-RP7；TV4一轮引物YR4DS-FP8和YR4DS-RP3，TV4二轮引物YR4DS-FP9和YR4DS-RP9)和ACTIN(单轮引物Actin-FP和Actin-RP)。“+”代表表达；“-”代表未表达。
2对于双数字，加号前的数字代表小麦的独立转基因株系的数目，加号后的数字代表大麦的独立转基因株系的数目。对于单个数字，只代表小麦的独立转基因株系的数目。
实施例1：利用转录组学鉴定抗条锈病亲本和抗病BSA池中特异表达的基因
本发明利用RNA测序(RNA-seq)和集团分离分析法(Bulked SegregantAnalysis,BSA),比较了粗山羊草分离群体F6世代的抗条锈病BSA池和感条锈病BSA池在成株期的叶片转录组(transcriptome)。RNA测序利用高通量测序技术直接测定样本cDNA分子。本发明通过RNA测序对比了抗条锈病粗山羊草PI511383，感条锈病粗山羊草PI486274以及二者来源的F6代纯合株系中12个抗条锈病株系组成的BSA抗病池(Rpool)和由11个感条锈病株系组成的BSA感病池(Spool)的成株期叶片的转录组。不同样本分别测定了一个生物学重复。总RNA的提取采用TRIzol试剂及相关方法(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)。RNA测序涉及的文库构建(优选500bp左右的mRNA碎片)和高通量双端测序(HiSeq 2500，Illumina，San Diego，CA，USA；paired-end，PE125)由北京贝瑞和康生物技术有限公司承担(Berry Genomics Company，Beijing，China)。
对于RNA-seq原始数据，首先剔除接头信息、低质量碱基(Q值≤3的碱基，占整个read的50％以上)和未测出碱基(N比例大于3％),获得有效数据；利用Trinity软件(H aaset al.2013.Nature Protocols 8:1494-1512)开展有效数据的从头拼装。通过比较PI511383、PI486274、抗病池(Rpool)和感病池(Spool)各自的叶片转录组数据，发现个别基因只在抗条锈病亲本PI511383和抗病池(Rpool)中表达。本发明鉴定到一个未知基因,其序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示；用引物组合Yr4DS-FP4/Yr4DS-RP4检测到该基因在抗病亲本P I511383和抗病池中表达，但在感病亲本PI486274及感病池中不表达(图2)。发明人预测该基因(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)可能影响粗山羊草抵抗小麦条锈病的水平。利用粗山羊草的基因组序列比对，发现该基因位于4DS染色体(http://aegilops.wheat.ucdavis.edu/ATGSP/blast.php)，本发明暂将该基因命名为Yellow rust resistance gene 4DS(Yr4DS)基因，并围绕该基因开展了功能研究。
实施例2：粗山羊草Yr4DS基因全长cDNA的验证
为验证Yr4DS基因的全长(full-length)cDNA，使用TRIzol试剂提取了粗山羊草PI511383接条锈菌10天后的叶片总RNA，然后利用RevertAid Frist Strand cDNASynthesis试剂盒(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)制备了cDNA模板。采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification ofcDNAends，RACE)分离Yr4DS基因(SEQ ID NO.1和3)全长cDNA的5'和3'末端，使用SMARTer RACE cDNAAmplification试剂盒(ClontechLaboratories，MountainView，CA，USA)，操作方法参照试剂盒说明书。5'端RACE PCR的嵌套引物为Yr4DS-RP10和Yr4DS-RP11，其中Yr4DS-RP11为Yr4DS-RP10的巢式引物(nestedprimer)。本基因存在两个3'端，第一个3'端RACE PCR的嵌套引物为Yr4DS-FP10和Yr4DS-FP11，其中Yr4DS-FP11为Yr4DS-FP10的巢式引物；第二个3'端RACE PCR的嵌套引物为Yr4DS-FP12和Yr4DS-FP13，其中Yr4DS-FP13为Yr4DS-FP12的巢式引物。对RACE PCR产物进行测序，证实了Yr4DS基因全长cDNA序列(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7)两端的完整性，说明RNA测序及序列拼装高度可靠。Yr4DS基因全长cDNATV1(SEQ ID NO.1)共4,266bp，包含一个3,207bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)；在起始密码子的上游30bp位置，有1个框内终止密码子(in-frame stop codon)，表明当前预测的ORF可靠、代表Yr4DS蛋白的一个异构体(isoform)。Yr4DS基因全长cDNATV2a(SEQ IDNO.3)共3,477bp，包含一个1,227bp的ORF，代表Yr4DS蛋白的另外一个异构体。Yr4DS基因全长cDNATV3(SEQ ID NO.5)共2,853bp，包含一个1,488bp的ORF，代表Yr4DS蛋白的第三个异构体。Yr4DS基因全长cDNATV4(SEQ ID NO.7)共2,609bp，包含一个1,416bp的ORF，代表Yr4DS蛋白的第四个异构体。
实施例3：‘PI 511383’基因组Fosmid文库的构建和筛选
为方便基因组DNA的克隆，创建了PI511383基因组DNAFosmid文库，构建方法参照已发表的文献(Jetty.2005.TheorAppl Genet111:1596-1607)。首先从PI511383叶片中提取大分子量基因组DNA(high-molecular weight，HMW)，利用重复冻融(液氮/45℃，20-30次)将大分子量基因组DNA随机“切割”成不同大小的片段；利用1％的琼脂糖凝胶及脉冲电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)游离DNA片段产物，从中纯化介于36-60kb的DNA片段；用末端修复酶补平DNA片段，重复脉冲电泳和片段纯化步骤，将经过两次纯化获得的DNA片段克隆到Fosmid载体pCC1FOS；经过噬菌体提取物包装后侵染宿主菌EPI300-T1R菌株细胞，将感染了噬菌体的宿主菌涂布到含有12.5ug ml-1氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养，收集平板上的Fosmid克隆。
PI511383基因组Fosmid文库包含大约1百万个克隆、保存在622个超级池中。根据随机挑选的120个Fosmid克隆检测文库质量，文库空载率为0，单克隆的平均插入片段35kb，覆盖粗山羊草全基因组(按4.3Gb计算)约8.2倍。为获得携带Yr4DS基因的Fosmid克隆，根据Yr4DS基因全长cDNATV1(SEQ ID NO.1)和粗山羊草基因组参考序列设计了多套PCR引物，测试不同引物组合在粗山羊草基因组DNA上的扩增效果，确定了两对用于文库筛选的引物组合：Yr4DS-FP1/Yr4DS-RP1和Yr4DS-FP14/Yr4DS-RP14。Yr4DS-FP1/Yr4DS-RP1在抗条锈病山羊草CIae9、PI511383中扩增出727bp的条带(图1)，在感条锈病山羊草PI486274和PI560536中不扩增特异条带，但能从感条锈病山羊草AL8/78扩增出575bp的条带。为验证该标记和山羊草抗条锈病的关系，本发明检测了来自粗山羊草组合(PI486274/PI511383，AS2388/AS87)的6,000多个分离个体，该标记(727bp条带)与抗条锈病表型完全连锁。为了进一步确定该标记的有效性，我们筛选了175份粗山羊草种质材料，其中69份抗性山羊草上扩增出727bp的条带，35份感条锈病山羊草上扩增出575bp的条带，另外71份感病粗山羊草上没有特异的扩增条带，该标记的基因型与现有粗山羊草种质的抗条锈病性状完全吻合。因此，Yr4DS-FP1/Yr4DS-RP1可以用作诊断粗山羊草抗条锈病表型的可靠标记，命名为Yr4DS-PM(promter-derived marker)。另外，我们也针对Yr4DS基因区和终止区设计了特异分子标记，命名为Yr4DS-GM(gene-derived marker)和Yr4DS-TM(terminator-derived marker)(图1)，都能用作诊断粗山羊草抗条锈病表型的可靠标记。
利用Yr4DS-PM标记，通过菌液PCR筛选了PI511383Fosmid文库的622个超级池，首先确认了阳性Fosmid单克隆所在的超级池，再通过逐级稀释筛选，获得阳性Fosmid单克隆，共筛选到10独立单克隆。然后利用Yr4DS基因引物Yr4DS-FP15/Yr4DS-RP15进一步筛选，得到8独立单克隆；克隆F2-1(即质粒PC1104)携带39,535bp的插入片段(SEQ ID NO.10；图4A)，该序列有3个表达基因，分别为类受体激酶蛋白1(receptor-like kinase gene 1,RLK1)、类受体激酶蛋白2(receptor-like kinase gene 2,RLK2)和Yr4DS。
实施例4：‘人工合成小麦’EMS突变群体的创建
为确认抗病型Yr4DS基因的功能，本发明利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethylmethane sulfonate,EMS)水溶液处理人工合成小麦Syn-SAU-93(AS2382/AS2388)(Zhanget al.2010.Euphytica 172:285-294)。前期结果表明AS2388和PI511383携带相同的抗病基因(Liu et al.2013.Crop Science 53:2014-2020)；实际上，二者的Yr4DS基因序列(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)一致。突变群体的创建如下：共处理1,850粒种子，每100毫升EMS水溶液(78mM)处理200粒种子，放置于水平摇床震荡12h(150rpm，25℃)，然后在室温下用自来水冲洗12h；将冲洗后的种子简单晾干，然后播种到四川农业大学小麦所试验田，共获得了613个M2株系。
实施例5：筛选人工合成小麦突变群体、确认Yr4DS等基因的突变及功能
将所有M2株系衍生得到的M3或M3种子混合种植在四川农业大学小麦所实验田，在苗期使用当前流行的条锈菌混合生理小种接菌，包括CYR30，CYR31，CYR32，CYR33，CYR34，贵22-1，SY11-4和HY46-8)；待感病对照充分发病后进行人工合成小麦感条锈病突变体的鉴定。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)方法(Yuan et al.2012.Journal of Genetics andGenomics 39:587-592)提取感病植株的基因组DNA，并利用NanoDropTM One超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Madison，WI，USA)测定DNA浓度，统一调整为100ng ul-1。利用PCR扩增技术，以高感条锈病的突变体DNA为模板克隆Yr4DS基因。针对Yr4DS基因中3,956bp的区域分三段扩增：第一段使用PCR引物Yr4DS-FP16和Yr4DS-RP16，第二段使用PCR引物Yr4DS-FP17和Yr4DS-RP17，第三段使用PCR引物Yr4DS-FP5和Yr4DS-RP5；PCR反应条件为，初始变性94℃、3min，10个循环(变性94℃、30sec；退火65℃每个循环降0.5℃、30sec；延伸72℃、105sec)；28个循环(变性94℃、30sec；退火60℃、30sec；延伸72℃、105sec)，终延伸72℃、6min。另外，我们还针对紧靠Yr4DS的RLK1和RLK2基因，检测它们在高感条锈病的突变体中的变异情况，使用到PCR扩增引物RLK1-FP1和RLK1-RP1、RLK1-FP4和RLK1-RP4、RLK2-FP4和RLK2-RP1(表1)。PCR扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序完成(SangonBiotech，Chengdu，China)。
在M3或M4混合世代中，共检测到60株高感小麦条锈病的人工合成小麦植株(表2，图3)。通过检测Yr4DS区域的3个基因，发现22个突变体发生了Yr4DS基因的删除，其中的21个突变体其删除伸展到RLK2基因；同时呈现RLK2和Yr4DS删除的植株中又有9个突变体其删除伸展到RLK1基因。但是，在所有60株高感小麦条锈病的突变体中，没有发现只有RLK1或RLK2基因删除的现象。Yr4DS基因删除占所有植株的36％，与Ni等人揭示约29％的目标基因删除相似(Ni et al.2017.Nature Communications8:15121)。对比RLK1、RLK2和Yr4DS的删除情况，Yr4DS基因的删除可能造成合成小麦抗条锈病能力的丧失。
对于未出现Yr4DS基因删除的38株高感条锈病的突变植株，10株出现Yr4DS基因的点突变，造成单个氨基酸的改变或蛋白翻译的提前终止。根据他人的研究，使用0.8％EMS(或78mM)处理普通小麦，每个突变体中点突变的平均步长约30kb(Krasileva etal.2017.PNAS114:E913–921)。假设Yr4DS基因和小麦抗条锈病性状无关(H0假设)，在其余38株高感条锈病的个体中，理论上会发现5(＝38×3.956÷30；Yr4DS基因的检测区域为3,956bp)株存在Yr4DS基因的突变，另外33株不存在Yr4DS基因被检测区段上的突变。实际上，在38株高感条锈病的个体中，28个植株未发现Yr4DS基因的有效点突变，但另外10株存在Yr4DS基因的有效点突变。据此开展卡方拟合优度检验(χ2＝5.8，df＝1，P＝0.016)，在α＝0.05的显著水平下推翻H0假设。因此，Yr4DS基因影响粗山羊草的抗条锈病水平。另外，我们也测定了高感条锈病突变体中的RLK2基因，该基因位于Yr4DS基因远着丝粒端小于3kb的距离，但未发现任何有效点突变。与此相比，在携带Yr4DS基因但高感条锈病突变体中，Yr4DS基因发生点突变的频率为26.3％。可见，Yr4DS基因影响粗山羊草的抗条锈病水平。
实施例6：转基因小麦和大麦的获得、表型分析及分子验证
为开展小麦遗传互补实验，我们开展了携带Yr4DS等基因的Fosmid F2-1(或质粒PC1104，其插入序列为SEQ ID NO.10；图4A)的遗传转化，并利用到共转化载体PC174(图4A)。共转化载体携带Bar筛选标记(Block et al.1987.The EMBO Journal 6:2513-2518)。PC1104携带RLK1、RLK2和Yr4DS三个基因，为获得个别基因表达的转基因植株，我们还利用限制性内切酶，包括BsrGI、NotI、XbaI和KpnI+XbaI(New England Biolabs,美国)分别处理PC1104，然后开展酶切产物的遗传共转化。
小麦幼胚培养和基因枪轰击转化参照Lv等人的流程(Lv et al.2014.PLoS ONE9:e94171)。其中，Yr4DS基因载体PC1104和共转化载体PC174按3:1的摩尔比例混合。本发明选择可感染条锈病的小麦‘CB037’和大麦‘Golden Promise’作为转化受体。对于小麦转化，取开花后7-14d左右的幼胚，进行幼胚表面灭菌，首先70％酒精(含0.05％吐温-20)处理5min，然后20％高乐氏漂白液(Regular Bleach，Oakland，CA，USA；额外添加了0.05％吐温-20)处理15min，最后用灭菌水冲洗3-5遍。在超净台上剥取幼胚(幼胚长度介于1-1.5mm)，按盾片朝上摆放到诱愈培养基(MS基本培养基4.3gL-1，麦芽糖40gL-1，维生素B10.5mgL-1，天冬氨酸0.15gL-1，2,4-D 2mgL-1，硫酸铜0.78mgL-1，植物凝胶2.5gL-1，pH 5.8)，于22-23℃条件下暗培养4-6d。将幼胚转移到高渗培养基(即诱愈培养基+蔗糖171.15gL-1，pH 5.8)处理4h，随后开展基因枪轰击。轰击处理20h后，将幼胚转移到恢复培养基(等同于诱愈培养基)，22-23℃条件下暗培养2wk。将幼胚衍生的胚性愈伤转移到分化培养基(即诱愈培养基+6-苄氨基嘌呤0.1mgL-1+双丙氨膦3mgL-1，pH 5.8)，22-23℃和16h光照(25μmolm- 2s-1)条件下培养2wk。将分化出的再生苗(高度2-3cm)转移至生根培养基(MS基本培养基2.15gL-1，麦芽糖20gL-1，维生素B10.25mgL-1，天冬氨酸0.075gL-1，2,4-D 1mgL-1，硫酸铜0.39mgL-1，植物凝胶2.5gL-1，双丙氨膦3mgL-1，pH 5.8)，并在同样环境条件下培养。待再生苗根系发育完全后，转为盆栽，在温室条件下种植。
轰击处理采用PDS-1000/He台式基因枪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)。轰击微粒混合物的准备步骤如下：在1.5ml的硅化离心管中加入2mg金粉(直径0.6μm)，再加入35μl无水乙醇，震荡混匀，离心收集(12,000rpm，5sec)，弃上清；加入200μl冰预冷的灭菌水，震荡混匀，离心收集(12,000rpm，5sec)，弃上清；加20μg质粒DNA(浓度约1μgμl-1)，再加入冰预冷的灭菌水至245μl，震荡混匀；然后加入250μl冰预冷的氯化钙(2.5M)，震荡混匀；最后加入50μl亚精胺(1.45％，v/v)，4℃条件下震荡15-20min，离心收集(12,000rpm，10sec)，弃上清；再加入36μl冰预冷的无水乙醇，震荡混匀。吸取10μl金粉和DNA悬浊液至载体膜中央，无菌风干后，将载体膜(金粉面朝下)置入微粒发射器(microcarrierlaunch assembly)，该发射器位于可裂膜(1,100psi)下方3cm处。接受轰击的愈伤摆放到高渗培养基(直径约3.5cm的区域)，然后放置于载体膜下方6cm处。PDS-1000/He基因枪的使用参照仪器说明书，轰击参数为1,300psi(轰击压力)和25mm Hg(真空度)。
本发明共轰击了8,380个小麦幼胚(包括未经酶切的PC1104质粒处理的1,590个幼胚和经过酶切的PC1104质粒处理的6,790个幼胚)，经过组培、筛选和移栽，成功获得来自170个幼胚的222棵株系。利用PCR引物，检测了RLK1(RLK1-FP5和RLK1-RP5)、RLK2(RLK2-FP3和RLK2-RP4)和Yr4DS(YR4DS-FP1和YR4DS-RP1、YR4DS-FP3和YR4DS-RP3)在222棵株系中的整合情况。进而使用RT-PCR引物，RLK1(首轮引物RLK1-FP1和RLK1-RP2；二轮引物RLK1-FP3和RLK1-RP3)、RLK2(首轮引物RLK2-FP2和RLK2-RP2；二轮引物RLK2-FP3和RLK2-RP3)和Yr4DS(TV1首轮引物YR4DS-FP6和YR4DS-RP6，二轮引物YR4DS-FP7和YR4DS-RP7；TV4首轮引物YR4DS-FP8和YR4DS-RP3，二轮引物YR4DS-FP9和YR4DS-RP9)确认各个目标基因的表达(表3，图5)。还利用RT-PCR引物Actin-FP和Actin-RP确认了内源参照ACTIN基因的表达。通过小麦条锈病测试，所有222棵株系后代中，只有表现Yr4DS转基因表达的2个株系高抗小麦条锈病(表3，图4和5)。综上所述，Yr4DS基因组全长表达框架(SEQ ID NO.10)的表达提供小麦高抗条锈病的能力，将感病小麦转变为抗条锈病小麦。
大麦上只开展了未经酶切的PC1104质粒的共转化，其转化步骤类似小麦，但组培、再生和筛选采用Hao等人的方法(Hao et al.2018.Molecular Plant Pathology 19:1995-2010)。基因枪轰击后，将处理后的幼胚转移至诱愈筛选培养基中，24℃黑暗培养14d；将分化出愈伤的幼胚转移至诱愈筛选培养基中，进行继代筛选培养，24℃黑暗培养14d；挑取明黄色的胚性愈伤继续转移至诱愈筛选培养基中，进行继代筛选培养，24℃黑暗培养14d；将生长旺盛的愈伤转移至过渡培养基中，诱导愈伤分化再生，培养5-10d即可再生出绿芽，培养条件为24℃，弱光，光照强度为2μmol m-2s-1；14d后将愈伤转移至再生培养基中，培养条件为24℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为35μmol m-2s-1；大约14d后，将生长健壮的再生苗转移至生根培养基，培养条件与上一步一致；待再生苗根系发育良好后，将其移栽到温室种植。
大麦组培所使用的各种培养基如下：a)诱愈培养基包括MS盐4.3g L-1，麦芽糖30gL-1，酶水解酪蛋白1g L-1，A溶液10mL L-1，植物凝胶3.5g L-1，pH＝5.8、高压灭菌(121℃，15min)后加入潮霉素25mg L-；b)过渡培养基包括MS盐2.7g L-1，麦芽糖20g L-1，谷氨酸0.75g L-1，B溶液5mL L-1，植物凝胶3.5g L-1，pH＝5.8、高压灭菌后加入潮霉素25mg L-1，2,4-D2.5mg L-1和6BA0.1mg L-1；c)再生培养基包括MS盐2.7g L-1，麦芽糖20g L-1，谷氨酸0.75g L-1，B溶液5mL L-1，植物凝胶3.5g L-1，pH＝5.8、高压灭菌后加入潮霉素25mg L-1；d)生根培养基包括MS盐4.3g L-1，麦芽糖30g L-1，酶水解酪蛋白1g L-1，A溶液10mL L-1，植物凝胶3.5g L-1，pH＝5.8、高压灭菌后加入潮霉素25mg L-1。A溶液为肌醇35g L-1，脯氨酸69g L-1，硫酸铜0.12g L-1，VB10.1g L-1，pH＝5.8。B溶液为硝酸铵33g L-1，肌醇20g L-1，VB10.08gL-1，pH＝5.8。
本发明共轰击了2,200个大麦幼胚，经过组培、筛选和移栽，成功获得来自300个幼胚的540棵株系。利用小麦上介绍的PCR引物，检测了RLK1、RLK2和Yr4DS在540棵株系中的整合和表达情况(表3，图5)；另外利用到Actin-FP和Actin-RP确认了内源参照ACTIN基因的表达。通过对大麦条锈菌株PSH-72的测试，在5棵阳性转基因株系后代中，所有表现Yr4DS转基因表达的3个株系高抗大麦条锈病(表3，图4和5)。
综上所述，Yr4DS基因组全长表达框架(SEQ ID NO.10)的表达提供小麦和大麦高抗条锈病的能力，将感病小麦和大麦分别转变为抗条锈病小麦和大麦。由此可见，将Yr4DS基因组全长表达框架(SEQ ID NO.10)导入感条锈病小麦等麦族植物，可以创建高抗条锈病的植物，这将在小麦等麦族植物的抗条锈病育种中发挥作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学，四川农业大学
<120> 粗山羊草Yr4DS基因在麦族植物抗条锈病育种的应用
<130> 2018
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4266
<212> DNA
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 1
gcagctccac ctaccgcagc tggccggtcg tcggtccttg catcgcatcc aaggcgacgc 60
cggctccacc actgccgcca ccactgattg gtaccttaag ctcccgtgaa gctacaaggg 120
aggaggcccc ctcgcctccc atccattgtt cctcaacagc ttgggtgccg agctccccca 180
ccaccacact agacgcgctg ggattcattg gatccgctcc agcgagcgag ccggattcag 240
ttcaccgaga ttatattcac ccttcccgtc tgccaactga ttacctccct tttcccattc 300
taccctgggt gaccactctg ctcactctca ctctttcttt ctcctctacg ccggccgtgc 360
acagcgcgac gccgacgacc gcatcccccc gacgttgccg cagccgccat acaagtagaa 420
ggaccgagat ggcaacctct cccagctttg tgctacaccg caagtactag gagcattgct 480
gaatgccgga tatagatccc cagatctagg ccaagggtct cgctttctgc tcactgttac 540
ttctatcatc tctccaatcg atccaagttc cagctcaagc cactggaccc tgcaactact 600
tgcgagacag cacgggatat ctatctctgc aacaagatcc gtctctcatc tctctagtcg 660
attcaagtac tagttcaagc gtgagcaaac cctgcaacca atggcggggg ttctggatgc 720
tttggcatcc tacgtgacca acatgctcac cgagatggct aaagaggagg tggccatgct 780
aatcggcgtg tctgacggga tcaaagacct aagcatcaag cttggggacc tcaagaattt 840
ccttgctgat gctgatagga ggaacattac cgatgatagt gtgcgggggt gggtgggcga 900
actgaagcgt gccatgtact tggccactga catcgtcgac ctatgtcagc tcaaggccat 960
ggagcaaggt caaacaaagg acagggcgtg ccggtgcctt aaccctctgc tcttttgcat 1020
gcggaatccc ctccacgccc acgacatcgg cacccgcatc aagctgctca accaaaattt 1080
ggatgatatt tgcaagaggg gcagcagttt caatttcatc aagctagaag cctaccaaga 1140
ccaaaagacc actcggtctc ccgccactga ccggaaaaca aattcactga ttgagcggtc 1200
cggtgtggtt ggagagaaga tcgaggagga cacgagggca cttgtggagg tgcttacaag 1260
ggaggcggta ggtgacaaga gtggtcgcct cattgtggtc gccattgttg gtatcggagg 1320
gattggtaag actaccctcg gcaagaaggt cttcaatgat gaggccatcg aaggcaagtt 1380
tactaagaag atatggctta gcatcacaca agatttcacc gatgttgagt tgttaagtac 1440
gaccatcact gccattgggg cagatcttcc tggagggggt ggggctccag acaaggccct 1500
acttgtcgat gctctcaaga acgccatcaa ggacaagaag ttctttcttg tactagatga 1560
cctgtgggat gtcgatgcat ggaacaaaca tctaatgact ccctttagct atggtggccc 1620
cggtagtaga gtcctcatca ccaccagaca tgacactgta gcccgaagca tgaaagcctt 1680
tcatccctac catcatgttg acaaattagc tccacaagat gcttggtcgt tgctcaagaa 1740
gcaggtagtc acaggagagg aaaatgaacc agaagttgat atgctagaag atattgggct 1800
gcagattata gcaaaatgtg atggcttacc acttgctgta aaagttatgg gtggactcct 1860
atgcaagaag gagaaaacac gacgtgattg gcaagacgtc ttgaatgatg atatgtggtc 1920
agtatctcaa atgtcaaagg aactaaatta tgccatatat cttagctatg aggatttgtc 1980
cccttactta aaacagtgct tcttgcactt ctccctcaaa ccaaaaaaga cagtgataac 2040
tgatactgaa atggtgtcca tgtgggttgg tgaaggattg gttgaaggag acacatatac 2100
tcgtagtttg gaagaaggga ataagtacta taaggagcta atagtaagga accttataga 2160
ggtagataca aagtacccta gtcaacttat ttgcaacatg catgatgtta ttcgctcatt 2220
tgctcaattt gtggctaggg atgaaacact agtaggtcac aatggagata ctatcaaaac 2280
aaatcttaga tcaccgaatt atcttagatt atccatagaa acgaaaggag tgggatccga 2340
tgaatttgag tggagatatt taagagagca aaaattgctt aggtctctaa tattaactgg 2400
aaacctcaaa agtcagcctg gggattcgtt gactatcttc ccaagtctac gtcttttgca 2460
tatagaatca gcaaatattg ctgcactagt tgaatctatg taccaactca agcatttgag 2520
atatttggca ttaaagagga ctgatatgtg tagactacca gagaacatcc atgagatgaa 2580
attcctacag catattagcc ttgaaggttg tgaaagtttc atgaaacttc ctgatagtat 2640
tatcaagctg caagggttga gatatcttga tatgggtgac acacgtgtaa gtagtattcc 2700
taggggtttc cgagctctta caaatttgac ttcactattt gggtttccag cctatattga 2760
tggtgactgg tgtagtctgg aagagttggg gtctctttcc cagctcaatg aactttcact 2820
acagagccta gaaaatgtat ctagtgcctt gttggctgaa aaggcaaggg taaatgcaaa 2880
gaaacaactt accgtacttg ctttaaaatg tggtggtaga gtgggacatg ggttggtcca 2940
aggagaggtc tctgagtcta aggaggagga gcaaataatt gaggcggtgt ttgatgtgct 3000
ctgtcctcag ccttgcatag aacacatcag aatagaaaga tattttggtc gtcggctccc 3060
aggatggatg gcgtccacag ctatggtgcc cctcgagagc ttgaagattc tatgcctcga 3120
acacctgccc tgctgcaccc aactcccaga tggcttgtgc aggctcccgt atttggagtg 3180
gataaaagtg atgaatgctc cagtaatcaa gtgtattggt cctgaattcg ttcaacagta 3240
caatcagctg caccgtcctt catctcagtt ggctgctacg tttcccaaac tccagatgtt 3300
ggaatttcac ggaatggagg aatgggagga gtgggtttgg gagacggaag tgaaagctat 3360
gcccttattg gaggaacttc gtatcacttc ttgcagactg agccgtatgc ctccaggact 3420
tatgtctcat gcaatggctt tgaagaagct aacaatatgg agcgtccaat gtctccactc 3480
tctagagaac tttgtttctg tagttgaact cgaattggga aacatacctg aactggccat 3540
gatctccaat cttccaaaat tacaaaaact tacaatcgag tgctgcccaa agctcgagat 3600
gctgcaggag atggctgcac tccggagact cgagctgacc attttcaaca gcgaaaatca 3660
acttccggtc tacctgcaga ctgtgaagcc tagtaatttg ctgctgacct gcaacctagc 3720
ggtactcact tccatggctg agggtgaatc tagctccgag tgggacaagt tcagtcatat 3780
caaccacgtt gaggcttatg cagaggatgg agaagatgag aagaaatggc acgtgttcta 3840
cacatctgaa tcctgcaaca tagagacaaa tattcatcag gatcgattgg tcgaagaaga 3900
ggagtaggct gaaactccag ccgaacgagg aaggaccata tgatgcaagg atatataagt 3960
atgtctgctg ttacaacttc aactagtttt gagatcgaat ccatgaaggg atacggggaa 4020
aagcatcagc cataatgcca tatacactta cctgcagaga ttcacacatc atactaattt 4080
cttgtgaagt gtgacatata cagttacgaa tttagagatg taaacttcgt ggcggactat 4140
ccagctggtg aagaaacatg gtgaccttgg caaggctctc ctttgtttag tgcaagcaac 4200
taatggagtt tagactactc tgctttgctc tgctctctga aagcagctca ggttgcaggt 4260
cctctg 4266
<210> 2
<211> 1068
<212> PRT
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 2
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1 5 10 15
Thr Glu Met Ala Lys Glu Glu Val Ala Met Leu Ile Gly Val Ser Asp
20 25 30
Gly Ile Lys Asp Leu Ser Ile Lys Leu Gly Asp Leu Lys Asn Phe Leu
35 40 45
Ala Asp Ala Asp Arg Arg Asn Ile Thr Asp Asp Ser Val Arg Gly Trp
50 55 60
Val Gly Glu Leu Lys Arg Ala Met Tyr Leu Ala Thr Asp Ile Val Asp
65 70 75 80
Leu Cys Gln Leu Lys Ala Met Glu Gln Gly Gln Thr Lys Asp Arg Ala
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aggaggcccc ctcgcctccc atccattgtt cctcaacagc ttgggtgccg agctccccca 180
ccaccacact agacgcgctg ggattcattg gatccgctcc agcgagcgag ccggattcag 240
ttcaccgaga ttatattcac ccttcccgtc tgccaactga ttacctccct tttcccattc 300
taccctgggt gaccactctg ctcactctca ctctttcttt ctcctctacg ccggccgtgc 360
acagcgcgac gccgacgacc gcatcccccc gacgttgccg cagccgccat acaagtagaa 420
ggaccgagat ggcaacctct cccagctttg tgctacaccg caagtactag gagcattgct 480
gaatgccgga tatagatccc cagatctagg ccaagggtct cgctttctgc tcactgttac 540
ttctatcatc tctccaatcg atccaagttc cagctcaagc cactggaccc tgcaactact 600
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tttggcatcc tacgtgacca acatgctcac cgagatggct aaagaggagg tggccatgct 780
aatcggcgtg tctgacggga tcaaagacct aagcatcaag cttggggacc tcaagaattt 840
ccttgctgat gctgatagga ggaacattac cgatgatagt gtgcgggggt gggtgggcga 900
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gcggaatccc ctccacgccc acgacatcgg cacccgcatc aagctgctca accaaaattt 1080
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ccaaaagacc actcggtctc ccgccactga ccggaaaaca aattcactga ttgagcggtc 1200
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cctgtgggat gtcgatgcat ggaacaaaca tctaatgact ccctttagct atggtggccc 1620
cggtagtaga gtcctcatca ccaccagaca tgacactgta gcccgaagca tgaaagcctt 1680
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<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 6
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145 150 155 160
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165 170 175
Asp Thr Arg Ala Leu Val Glu Val Leu Thr Arg Glu Ala Val Gly Asp
180 185 190
Lys Ser Gly Arg Leu Ile Val Val Ala Ile Val Gly Ile Gly Gly Ile
195 200 205
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Gly Lys Phe Thr Lys Lys Ile Trp Leu Ser Ile Thr Gln Asp Phe Thr
225 230 235 240
Asp Val Glu Leu Leu Ser Thr Thr Ile Thr Ala Ile Gly Ala Asp Leu
245 250 255
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ccaccacact agacgcgctg ggattcattg gatccgctcc agcgagcgag ccggattcag 240
ttcaccgaga ttatattcac ccttcccgtc tgccaactga ttacctccct tttcccattc 300
taccctgggt gaccactctg ctcactctca ctctttcttt ctcctctacg ccggccgtgc 360
acagcgcgac gccgacgacc gcatcccccc gacgttgccg cagccgccat acaagtagaa 420
ggaccgagat ggcaacctct cccagctttg tgctacaccg caagtactag gagcattgct 480
gaatgccgga tatagatccc cagatctagg ccaagggtct cgctttctgc tcactgttac 540
ttctatcatc tctccaatcg atccaagttc cagctcaagc cactggaccc tgcaactact 600
tgcgagacag cacgggatat ctatctctgc aacaagatcc gtctctcatc tctctagtcg 660
attcaagtac tagttcaagc gtgagcaaac cctgcaacca atggcggggg ttctggatgc 720
tttggcatcc tacgtgacca acatgctcac cgagatggct aaagaggagg tggccatgct 780
aatcggcgtg tctgacggga tcaaagacct aagcatcaag cttggggacc tcaagaattt 840
ccttgctgat gctgatagga ggaacattac cgatgatagt gtgcgggggt gggtgggcga 900
actgaagcgt gccatgtact tggccactga catcgtcgac ctatgtcagc tcaaggccat 960
ggagcaaggt caaacaaagg acagggcgtg ccggtgcctt aaccctctgc tcttttgcat 1020
gcggaatccc ctccacgccc acgacatcgg cacccgcatc aagctgctca accaaaattt 1080
ggatgatatt tgcaagaggg gcagcagttt caatttcatc aagctagaag cctaccaaga 1140
ccaaaagacc actcggtctc ccgccactga ccggaaaaca aattcactga ttgagcggtc 1200
cggtgtggtt ggagagaaga tcgaggagga cacgagggca cttgtggagg tgcttacaag 1260
ggaggcggta ggtgacaaga gtggtcgcct cattgtggtc gccattgttg gtatcggagg 1320
gattggtaag actaccctcg gcaagaaggt cttcaatgat gaggccatcg aaggcaagtt 1380
tactaagaag atatggctta gcatcacaca agatttcacc gatgttgagt tgttaagtac 1440
gaccatcact gccattgggg cagatcttcc tggagggggt ggggctccag acaaggccct 1500
acttgtcgat gctctcaaga acgccatcaa ggacaagaag ttctttcttg tactagatga 1560
cctgtgggat gtcgatgcat ggaacaaaca tctaatgact ccctttagct atggtggccc 1620
cggtagtaga gtcctcatca ccaccagaca tgacactgta gcccgaagca tgaaagcctt 1680
tcatccctac catcatgttg acaaattagc tccacaagat gcttggtcgt tgctcaagaa 1740
gcaggtagtc acaggagagg aaaatgaacc agaagttgat atgctagaag atattgggct 1800
gcagattata gcaaaatgtg atggcttacc acttgctgta aaagttatgg gtggactcct 1860
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cgattggtgg aagaagagga ctagaccgaa actcctacgg aacgagttta ggcgaaagga 1980
ccatatgatg caaggatata cggatacctg gaaagcatca gccataatgc catatacact 2040
taacctgcag agattcggac accacactaa tttcttgcga agtgtgacat atacacttac 2100
taattttgag atgtaaactt cttggcgtac tatctagctg gtgaagaaac atggtgacct 2160
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ttcaatcagt gcagtcaaat taagttcagg ttttccccgc aaaaaaaaaa atttaagttc 2520
aggtttgttc tggggctcag gacatatgtt gtggatggaa gcaactgtat caggacatat 2580
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<210> 8
<211> 471
<212> PRT
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 8
Met Ala Gly Val Leu Asp Ala Leu Ala Ser Tyr Val Thr Asn Met Leu
1 5 10 15
Thr Glu Met Ala Lys Glu Glu Val Ala Met Leu Ile Gly Val Ser Asp
20 25 30
Gly Ile Lys Asp Leu Ser Ile Lys Leu Gly Asp Leu Lys Asn Phe Leu
35 40 45
Ala Asp Ala Asp Arg Arg Asn Ile Thr Asp Asp Ser Val Arg Gly Trp
50 55 60
Val Gly Glu Leu Lys Arg Ala Met Tyr Leu Ala Thr Asp Ile Val Asp
65 70 75 80
Leu Cys Gln Leu Lys Ala Met Glu Gln Gly Gln Thr Lys Asp Arg Ala
85 90 95
Cys Arg Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Cys Met Arg Asn Pro Leu His
100 105 110
Ala His Asp Ile Gly Thr Arg Ile Lys Leu Leu Asn Gln Asn Leu Asp
115 120 125
Asp Ile Cys Lys Arg Gly Ser Ser Phe Asn Phe Ile Lys Leu Glu Ala
130 135 140
Tyr Gln Asp Gln Lys Thr Thr Arg Ser Pro Ala Thr Asp Arg Lys Thr
145 150 155 160
Asn Ser Leu Ile Glu Arg Ser Gly Val Val Gly Glu Lys Ile Glu Glu
165 170 175
Asp Thr Arg Ala Leu Val Glu Val Leu Thr Arg Glu Ala Val Gly Asp
180 185 190
Lys Ser Gly Arg Leu Ile Val Val Ala Ile Val Gly Ile Gly Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Thr Thr Leu Gly Lys Lys Val Phe Asn Asp Glu Ala Ile Glu
210 215 220
Gly Lys Phe Thr Lys Lys Ile Trp Leu Ser Ile Thr Gln Asp Phe Thr
225 230 235 240
Asp Val Glu Leu Leu Ser Thr Thr Ile Thr Ala Ile Gly Ala Asp Leu
245 250 255
Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Asp Lys Ala Leu Leu Val Asp Ala Leu
260 265 270
Lys Asn Ala Ile Lys Asp Lys Lys Phe Phe Leu Val Leu Asp Asp Leu
275 280 285
Trp Asp Val Asp Ala Trp Asn Lys His Leu Met Thr Pro Phe Ser Tyr
290 295 300
Gly Gly Pro Gly Ser Arg Val Leu Ile Thr Thr Arg His Asp Thr Val
305 310 315 320
Ala Arg Ser Met Lys Ala Phe His Pro Tyr His His Val Asp Lys Leu
325 330 335
Ala Pro Gln Asp Ala Trp Ser Leu Leu Lys Lys Gln Val Val Thr Gly
340 345 350
Glu Glu Asn Glu Pro Glu Val Asp Met Leu Glu Asp Ile Gly Leu Gln
355 360 365
Ile Ile Ala Lys Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala Val Lys Val Met Gly
370 375 380
Gly Leu Leu Cys Lys Lys Glu Lys Thr Arg Arg Asp Trp Gln Asp Val
385 390 395 400
Leu Asn Asp Asp Met Trp Ile Asp Trp Trp Lys Lys Arg Thr Arg Pro
405 410 415
Lys Leu Leu Arg Asn Glu Phe Arg Arg Lys Asp His Met Met Gln Gly
420 425 430
Tyr Thr Asp Thr Trp Lys Ala Ser Ala Ile Met Pro Tyr Thr Leu Asn
435 440 445
Leu Gln Arg Phe Gly His His Thr Asn Phe Leu Arg Ser Val Thr Tyr
450 455 460
Thr Leu Thr Asn Phe Glu Met
465 470
<210> 9
<211> 8844
<212> DNA
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 9
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tagagatatc aagccttcca acatacttct tgatgatgcc ttgacagcaa aagtgtcaga 180
ctttggagct tcaaggtaca ttgccatgaa tcaaacagga acaacaactg cagtgcaagg 240
aactataggt tacttggatc ctacatatta ttatagcaga cgcctcacag aaagtagcga 300
tgtttatagc tttggagttc ttcttattga attgcttact aggaggaagc catctttgta 360
tagatccaat gaaggcgttg ggcttgtcat ggagttcgtt gcactacttg cagaaggcaa 420
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tatttaaaat aaatttgaat gcacccaact ctgttgtgct aattttgcat gttgtcgcgc 900
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ggattcattg gatccgctcc agcgagcgag ccggattcag ttcaccgaga ttatattcac 2220
ccttcccgtc tgccaactga ttacctccct tttcccattc taccctgggt gaccactctg 2280
ctcactctca ctctttcttt ctcctctacg ccggccgtgc acagcgcgac gccgacgacc 2340
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cctcttcgtc ctagccagcg gatcctcaga tctgagctga gtggggccgc agcaagctca 2460
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tatgatacta gtgtataaac tacatccata gtgcatagta tcatagatta gtatcatagg 8280
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ctacctatgt tactataact atctctctct tctttaattg cctgccacat aagcatgttt 8400
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ttcacaatca tttggcatca ctggccgccg gccaccgttt ttactccatt attttttgtt 8520
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aaataagcca actatttagc aactttaggt gctaacttat taaataaggt gtgcttagca 8640
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ttaagataat ttgagttccg gaaaaggttt tcgtcccgct ttatataatt caatcgaccg 8820
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<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 10
tgttttaaga tcaatgacct ttttaaattt cgcggccctt tttcaaagtc atgatttttt 60
ttcaaattca tgattttatt agaaaaatat aatgaacttt ttcatttttt cgaattaatt 120
tatcaaattc gagtattgtt tttcaaatcg atgaaatttt tataaacttg tgagcgaatc 180
catgattttt taattttaaa accgggaact ggtttttcag ttaacaaaat accagcagaa 240
gagaaaaccg agaaaatata gcgaggaaac gaaaactgat gatcacaagc ggtgaacagg 300
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attgatgcct accatgggca tgcttttcat gcatgtccaa aaatagaaca tgttcaacgg 1020
agggtgtccg agtaggcgag aagggtccat atgagagcaa gctttttcgg aatcgcccag 1080
taaccccatt tcccatgaga ttatatgaac aattaaaggc gccatgccaa gttgtttgag 1140
ttttggataa tatttgtatt ttctggagtt tttttgttga aaagttgctg ataaattgcc 1200
ggacgtgacg caacttgcat acggtgttgc aaagcgttca aacctggcat ggatgcctac 1260
cataggcatg ctcatctgct ggcaaaaggt aggatcatta aatttatgtc aaaaatagat 1320
catgttcaaa gtagggtgtc cgtgtaggct agaaaggtcc gtatgagaac atgttttttt 1380
ggcatcgtca aatatcccta aaaattttac atgagcatat atgacctatt taaaggcacc 1440
atgcaaagtt attttagttt ggacaattgt tgcactttct agaattttct tgatgaataa 1500
tgactgataa aacagctgga cgtgatgcaa cttgcatccg gtgttagaat atattcaaat 1560
caggcatgga tacctatcat gggcatgccc acatgctgga aaaagttaga gtcatttcat 1620
gtatgtctaa aaatatatca tgttcaacga agggtgtttg cgtaggccag aaggggtcgt 1680
atgagagcat attttttcgg cttcgtcata tgaccccaaa tttttcccat gctcttatat 1740
aaccaattca aggcaccatg ccaagttgtt tgagttttcg aaaaatcatg cattttctgg 1800
agttttctcg gtgaaaaagt gatgataaat ggctggacgt gtcacaaggt tcaaacggtg 1860
tcagaaatcg ttgaaaccag gcatcgatgt ttcatatgtc cgcgccaggc tgctgtaaaa 1920
agttggggtt atttatccgt agtccaaaaa accaccagtt gagagaagtg tgcttactaa 1980
gccagacgag tgcatccgtg agcatggtgt ttgtattttc cgctaatata attaacacga 2040
aaaaaaatgt cctaactatt tctttaaatt tatctacaat tttagatgct tttgttattt 2100
gcaatttccg tcattgtcaa tgaacatgaa ctttaatttg tgcaaagtgc acacatttgc 2160
caaaattcga aaaaagaaaa aagaaaaaga aaacagaata taacgaagca aaacccggtt 2220
ttttaaaaga tggagaatgg ccaaaaattt cacaaaatta catttgccac ataagaagcc 2280
aaaaagaaag caagtgttca agttgtgttc aaaatgttag ttcctatgtt tgcacgctcc 2340
tcaaatatct ttaaaattgt tcaaaatgtt gttcaaaaaa atgttcttaa cattttgaac 2400
taacataacc atttaatttt tttgttttca tgctttaaaa aaatgttgtt cattgttttt 2460
aaatgttcat gtctttttta aatgaaaatt ttaatatgtg ttcaagttgt tcaaaacatt 2520
gttggatttt cagaatgttc gtgcgcctag ttcggaaccc ctcgtccgtg ggcctgctgc 2580
ctcgttatct tgcagcattc aactgacgtt ggtgctaatt tggcagatca tggacgtggc 2640
agctccttca atacattagt tagcaaaaca gccatttatc cctcatgatc atgtaaagtg 2700
gaacgccttt atccctaaaa aacaatcaaa gcagccactc ctagtcgatt attccccttt 2760
tagctgattt tgatccgttt ttgagggaga aaagggcggc gtgataggct tccctcccca 2820
ttcgattatt cccctcgacc aatctacaca tgcctagatt acgctgccct tccttagtcg 2880
ccctatgtac acctggacct actttttttt aaaatttaca cctgggcctt tttttaattt 2940
acacatggac ctactgggta catgtgtttt ggttgacggg ctcaataaac tcggacggaa 3000
ggagtggttc gtaaatttgc acgctcctca tttttcacaa acactagtca gagccactca 3060
ctctcacgtg cacagaggtc cgtggtttga ttcctagagg gtgcatgcat acttattttg 3120
tgaactttta ctccggcggg tgagtgatgt attttaataa aagaccatct tacccttttt 3180
aggggagacc atcttaccct ttagtatgaa ggggtatgaa gaaatctact tctttgaagt 3240
gattaggaag gttgtaccaa aggagaagtg acattaaaat aacgtaaaat gggcggggac 3300
aaacgagact atgagaatgc accaaaatga aaaaaacagg cttaccggtc ataattttgt 3360
cggcaggctg gtggacgtgt agcaggacga gcttgtcgcc accggtaagg aggtttcgag 3420
cggcccacat gaggtttgac ctgccgtcct cttcatcctt cccgacagcc acatacaagt 3480
tccttcctcc tccgccgcca ccatcctctt cgcccttcca taagggcaca tacatccttc 3540
ctccttcgcc atcatgctcc aagttggcgg tggtctcctc tttggcacaa gcaccgacac 3600
cggcaccgag gctagcgctt atgtcggact cggtggacga cctccgggta cgccacatct 3660
tggcccagta ggatcggttc ctcagcttac cctcacgagc agtgtagcta tacatcaagc 3720
cgccggaaga tgatgatgat ggtgatagtg atgatgatgc cggcttaggc ttaggcttac 3780
aaactcttga gaatctgctc cgccaagctc gtcaaacaga tcaaagagac tgagaaattt 3840
ctcccaagaa cccttgaccc gaagattcga accctcgacc aagctggcca aagagatcaa 3900
actctggtca aagagattcg aacacgcaat ttctcaagca tgtgttttct gttctcaagt 3960
gcaatttcaa gcttacagga cgcaactgac acacattgta tagtttttag gctgtcaaat 4020
gcattttttt ctgagcaaag gaagcttcac gaaggaacca gagttttctt tttggcaata 4080
aaaccccctc tatatttggt gcacgggtcg ccggttagcg accacgcgtg gacccccccc 4140
ccccccccta cacacacacg ctggcctttc catgggctag tttttctttt tctttctttc 4200
gtgtttttct attcttttta ttattatttt ttcatttttc tagttttttc agtttgcaaa 4260
actcttttaa atttatgaat attttggaaa tcatgcacat tttctgaaat gatgaatttt 4320
tttaaattga tgaacatatt ttcgaaaccg tggacctttt ttttacaaac ttgtgaagag 4380
tctcctaaat cccgaatgtt ttttgaaatc atgaacattt ataaaattcg tgaagaattt 4440
gtcaaaatca tgatcctgtt tttaaaaaat tcatgatcat tcattttttg aaatgatgaa 4500
cgttgttcga ctcatgaata ttttgtaaat ttatgaacaa tttttcaaaa ttgtgaattg 4560
tttgaaaatt tgtgcagatt cttttgaatt cacgaacatt ttttaacacg gcactgccag 4620
ccacctgagc aagcccgaca gcatcgctcg gtggtggcaa ctggagagcg cacagggtga 4680
gggggccgag aaaagtgtat cggaacgctg cctgagtcgc ccgacaaaag gacgacgcgg 4740
gggcatttct gtttttttaa cacggcacat tcgaagtcac tcacatacac gagcatacaa 4800
tcaacctaca aatgtgtgca catacacacc ttacccctat gtgtgatatt caatatgttg 4860
cattatctag cacatatcat gttcttattt ctgaataata ggaccggcag cgtgcacatg 4920
tccacgtaca gttcagtagc ttcacttagt tagtctgtaa gtagattcag ttagttggtt 4980
agccagattt gctcaattga tcgcttctag ggatgctagg atcgttacgg tttatgcggg 5040
cagtgtagtt gctcgatttc agcttggcat cgtgggatgg cacgaccagt aggccggctt 5100
gaaacatggg cgtctcccgt gtaattcgtc agccgtttga gctggctaca aataacagaa 5160
aagcagagaa aaagctgcag ttcagtgagc agcacaaaaa cttctgtgag agtctctcct 5220
accacctctc gcaaagctcg gtcgttagtg ctaggcaaca acaatgataa cctccgagag 5280
actgagttga cacatgcttt tgagattgac aaagttgcca taaacgcctt cgtagtcgat 5340
cagatcgtct catccccact taacgcacat caccggaaca aggtatgtga gaaccaatgt 5400
catgtctagg acttgaaatc tggtgggttg agaataccac taccctcata accatcatac 5460
cgcagcttgg ttcgccgttt tttgtttgtt gatatatgtt cccccacggt cacaatgttt 5520
tggtacagga aaaaggtaag aatactcaat agtagaatgt tgtggagaag tggtggcaga 5580
ggggccgtac atttccttgt aacatgcctc tgccagtagt ccgtcctctc atcgaatcat 5640
catggttgaa catagcttac tattttcttg ataatcatta tcttcatgtt caactccaat 5700
tgttcctaca gaaaatatat tcagacttag cacacaaatg aactatgagt gaactactac 5760
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tgctatttgc cagtgtgttt tttatgagtg tgcgttagtg ttgcctgtgt gtaacccagc 5880
catgcagaaa ccgggtgcgt gctcattgcg tttgtatcat cttgatgctt cattttgagt 5940
gaataaaatc cacccattaa aaaaaataag cattgatgtt cctggcctag cgggagaaag 6000
agaggctgga atcaccgtcc cgacctttca gggcagaaga aaaaggttat ttgaccaacg 6060
gttcttactc ttagtcatca aaactctgtg cgggtcccgg ggagactggc ctagtccaag 6120
tcttcacata taagtgaggg acatgtttgt tttcctttta tttttgtgag aacacatttt 6180
tgttttgacg gggcacaaaa agccatagac ctgtatacta gtccttttcg agactagtct 6240
atgttagaat agttagaatg aagcatcata aaaaagacaa tttctgatgc ttcattctaa 6300
ctattcacga ggcatttctt tatctttttt acacaagcca caaaaaacgt cgtttttcac 6360
cgaaaccttg tgaacggaca taaaatgtcc ggatatacac gcggggtttt tgttccgaat 6420
ttttcaactt ttcaaaatgt gtgttttcga caatgggtgc atatgcacct atgagcaaaa 6480
aagccgcgtc cggtgaagtt tgcatatcat cttctttaca agtatataaa gcatacacca 6540
aacaatctgg actcactaac atttccagcc aatcagataa tttgcatagg tctggctcta 6600
gttaagtgaa gttgtttgtt ttaaaacaca aaacatattc ctaaaatatc tggactcggt 6660
ctcatttcca gccaatcaaa taagatggat atgtagctct ggatccatca atatgttgag 6720
ggctagaaaa gccgtgtgga ccactcaaac agacgcttgc tggctaatgt tgctttcaac 6780
agggatttga ccaaatccgt acgaaaaatc acccaacctc gtgcgctcta ttaatttttt 6840
attctgtctt tcgtcgttgg gatattaaac cgtcatttat tttttctttt ttagaagtct 6900
cgtatgtagc tatccgaatg actcatgcat ttgcaaagct gcctaggaaa tgacaaaatt 6960
tgcgaatgag ttttgttatt ttctacccac atgaatgttc tcaggaaaat agatatttta 7020
cagatttgca gttcactcaa cacattttca aagagggcct cgcacacctt agcgttagcg 7080
agtgatatag atgcgcacac ctggcttact cctgcatcgt agcgcataac tgcataagta 7140
caccactgga attaggtaac tgtagcgaca agtcaatccg tcctgtcctg ccatacataa 7200
tgctaagcag ctgcgtatcc attgcggcag cggtggtgct gctgctaatc tcggcaccgg 7260
cggccgcagc agggcctccg ccgatgaaga tagggatgcc gggctgcaac accacctgcg 7320
gcaacgtaag cgtgccttac ccgttcggca tgggcccgaa gagttgttac tggccggggt 7380
tcaagctcac ctgcgacaac aacggaagca atctcccgcg gcttctcctc ggcgatggaa 7440
gtgccggcat tttcgaggtc gtcaagatct ccgtggagaa cactacgatg cacatcatca 7500
gccacggact gcaagccatc aacatgagag gcggctcggg ccggtggagc ctcggtgatg 7560
ctgagactga gagcatcggc gccggcaggt tgccctactt gctgcacccg gattcaaatg 7620
atttcatcct cacgggttgc aacgtgcagg cgacgcttct ggggaaccgc agcctcgcca 7680
gcggctgcgc ttcgttctgc ccggcttttg gtgatggtgg tggcggtaac ctagtttatt 7740
ctgggggaaa atccaatacc tgctccaaca tcggctgctg ccagtcgacc atccaaactg 7800
ccagcgcgtc ctacggcgtg gagctcaagc ggctcaacta cagcggcgtg tacagcaatt 7860
tcgatttgcc cgtgcacgtg ctcatcgccg aggtgggttg gttcgactta gaccacaatc 7920
gggaggtggt tatgaacctg tactgggagg aaaaccaaaa agaaaatctc tcgcggaagg 7980
ctgatcggct cagggtcccc gtgattctcg cgtgggcatt ggcacacgag gcagcagtga 8040
actctggcca tttgcattgc ccagaccacg cagcccggag catatgcaag agcgcccaca 8100
gcaattgcag tgtcggagac tttcaagtca gaggctattc gtgccagtgc agggagggct 8160
accagggcaa cccttacctc accggaggat gccaaggtga gtttacaatt tttttactga 8220
attatttgca ttgctttcca tatgtgtcac gtggttattt ttgttcgtgg acatatacac 8280
agatatcaaa gagtgcgatc aaaaagaaaa acatttctgc ttcggggact gtgaggaact 8340
gccgggctcg ttccagtgcc ggtgcccgaa cggaacgcat ggcaattaca caaagcccgg 8400
tggctgcatc atcatcgagt ctgaagacac aatcggaggt actcctagcc tgccgattac 8460
tagtgcgtgc aacaggagac aatggaacaa ttaatgttca ttagttaatt atctcgctcc 8520
atttatatat tcttgataaa atagtactag tagtaaatgt gtcaattgct tttcaggtca 8580
taataacttg ggtttaatca ttggtctctc ggtcgctagt ggcccattta ttctactttt 8640
ggttcttggt gcaatcctaa ctatccgtgg ttttaaccaa cgcaaggcga aggcgctgag 8700
acagaagttc tttactcaaa accgtggcca actattaaag caattggttt ctcacagggc 8760
cgacatcgca gagcggatgc tcatctcttt agaagagcta gagaaggcta ccaacaattt 8820
tgatcaagcc cgcaggctag gtggaggtgg acatggcact gtctacaaag ggattatgtt 8880
agacctgcat gttgtggcca tcaagaagtc aaatattgtc gtgaggagag aaatcgacga 8940
gttcataaat gaggttgcca tactctcaca gatcaaccat agaaatattg tgaagctccg 9000
tggatgttgc ctcgaggcag aagtgacgtt acttgcttac gagttcattt ccaatggaac 9060
actcgccgac catcttcacg cggaaaaagg aggatcgcta ccttggaaag ataggttaag 9120
gatcacaagt gaaataggca aagctattgc ttaccttcac tctgctatat cagtccctgt 9180
aatacacaga gatatcaaac cctccaacat acttcttgat gatgccttga cagcaaaagt 9240
gtcagacttt ggagcttcaa ggtacattat tcctgtggat caaacaggta caacaactac 9300
ggtgcaagga actatagggt acttagatcc tatgtattat tatactggac gcctaaccga 9360
aagtagtgat gtttatagct ttggagtcct tcttgttgaa ttgcttacta ggaggaagcc 9420
atctctgtat agatcttccg aaggtgatgg gcttgtcatg caatttgttg cactacttgc 9480
agaaggcaat ttggcaaaaa taatagaccc acaagttata gaggaggggg gtagcgcagt 9540
gaaagaagtt gctactctag ccatggagtg cgtgaaacta agagcagagg agcgaccaac 9600
catgaggcaa gtagagatgg cgctagaagc tctccaagca cccaataagc gtgtcggggc 9660
tgatttgata gaagaaacag atgagaagga atatgcagca acaggctatc catccaccag 9720
ccaacaagca aagaaaaatg aaggaagcag gtgttatagc caagaagatg agttcctgtt 9780
atctgcgaca taccctcgat agtttttgct tgcttgtaag tgaattttta gccatggtga 9840
attgtttctg ttattgtaaa tcagtgcgtg tttttatatg aatatatatg ccgaacagaa 9900
cttaagtgta tgcttcaaaa aaactgaatg cacccaacta tgttgttcta attttgcatg 9960
ctgccctgct ctcagtcttg atgatcatct atatatccat cttccacacg tactcacaag 10020
actgaccaag acactatcca tcatttcgtt gcacttatac gtatttattg atgtgtcgat 10080
ccttgtctcc attaaaaatt gtgcaacttg tggtagtaga agcaaggtag ccgctcgggt 10140
gttgggcatc ttatttaacc attgaacccc gcgatgtcat ttgatatctc agtatcgtct 10200
tgggaacatt gaactgcaca ccccagaatg caaactatac caacactatg gtacagtgca 10260
tgtaatgcaa caattggttt catctccacg caaaaattgg aattaaagca aacgctgcac 10320
atgcatgcat gctggttgct ggccctacac atgtacatag aacctctatg attcgagcgt 10380
gtgatcagca gggactggtg atgagtccaa atctcatctc cgtgttcaaa taggtacatg 10440
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cgcccaaggc gtcgaaaaag agcggcctag gagcgagccg gcgctagatc ggcccctggg 10860
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gcgtcgcgga ggcatcgtca tcagctgccg ggctgggcag cggcggcggc gtcgccggta 11280
actgattcag gatgtggccg cgctccgcca agaaccacgc cttgagcttc tcgtcgccgc 11340
tttggagcat gtcagcgcca cccatcaaga aggcgaggtc gttgttcctc ttcttcgcgt 11400
attgagcttt gagttttgcg gcgccgttgg tccggagcaa gtcgagtttg acaacgttgt 11460
tcgtcatcaa aacagcccac ctcgcctcag ttttctcttc tcgctgggcg gccctggtct 11520
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gcgcgtccgg cttatacgtc tctttggctt tggcgagggt gcgcgggacg gctgcccatt 11700
tctcgcacct gtcgatccgc ctgaagacgt ggaggtactt gaactctgcg tcactgttgt 11760
catcgcggaa catggcgaac atgcgtagca gctgcgccga acgaaagaac atcagtcggc 11820
gtgctcggcg cgcacgaggc gaaagtgtgc gcgcacggcg gaaggcaaca gtatgagata 11880
cctgatcctc gacgctgatg ccgctctccg ggcgagccgc gacctcctcg acgatcccat 11940
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gcttcatgtg cacgcttttg aagtaggggt cgacgagctt ccgctcgtcg aactcggcct 12060
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caaccttcca cgcttcggcg aggcactcct cttccttgga cgcccacttg atgcgtggct 12180
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cctcctcctc ctcttcctcc tcctccggct cttcctcgcc gtagtcgagc tcgtcgttca 12300
tgtcaccgag gtcaatcgag tcgtcctggg tagtgaaccc gggggaagcg gcggcggcgg 12360
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gcatcaagga tgcggcttgc gagtagagaa tgcggcgaag aggtggcatc ggtgaggctg 12480
cgtagtccgg cggcgagtaa gtgtatggcg ggtactgcac gccggcgaat gctggcgagg 12540
gcgtgcgctg gacagggcgc ccatggggaa ggtgatgttg gggttgaagc caccatgggc 12600
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catcatcgcc gcgcacgccg cctccgcttg ttctgccacc accgcagccg tagcgtgcgc 12780
cgctttttcc ctggccttct tggccctgtt gcgcctgtcg gcggtgacga cctcccggtg 12840
ctccacatcc gccttccact cagcgttgct gatgccgggg ggcttggata gcggcgccct 12900
cggcttcctt tgcttctgct gggcggcggc ggctgtggga tccgtcgcgg cgcgcggcat 12960
cacgtacttc ttcggcggca tggcgggcgt ttggcgggag gagccgagcg tttggcgcga 13020
ggagccaagc gtatcagatt gggatattct tgatcgattt ggtcggatat gtagaattgg 13080
tgggaggaat ggagaagaga tgggagccta gggggaaagc gggagaaaac ggcgggaaag 13140
ggcttcagtc gccgacggag cggccccacg ccggttttcg cttgtgccgg cgcgcccagg 13200
cgacacccgg ccgcttgggt tcggggcggg atcgccggct ctgtatttcg cccaaaccgg 13260
cgctaaacga gatcctaggg tcgtgactgg gccgattttc ggccaccggc gctaaaaatt 13320
cgcctggggg gtctgttgga ggcgcggctg gagatgctct aacaacctac tctaagtgct 13380
ccctgtccaa ggaacccctg cttctcctcc ggctgtgtcc cgtgtgagca atgtcgtcct 13440
cacctccggc aaggccctgg ccaaccgtcg cccgccactt gttagaataa atctgaggca 13500
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gaggttcacc gatatggcta catccccggg gcctgactac aggcgctcct ccccgtgaca 13620
ccgtcacaat accgcacccg gtcgccctgg acaccggcac atgctgccgg cttcccctgc 13680
gttccggtgc tattatgttg gcataggtta catcgtgtgt ctacccccgg tatatatgag 13740
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tacaagtcca actgtaacct accttgtaca caatattcgg cacaactcta acaagcgcca 13860
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tgagagatat cgggaattaa tttaccagtg aggcgctctt gtagatactc ttggccacgt 14160
ctccgaggaa cagcaacatc acgaaatgag ttgctgtggt tgtcttgctg tggggaacca 14220
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gtaggctgcc gtcctgtggt ttcagctcca ccacatagga cgcgtatccc atgagattga 14400
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tccaatctat tgaagcaagc aactgaactc tattgcattc attttcctgt tgtcacccaa 14760
attccctact actcaaattt gtgataatca tctatcataa ttttcactcc tacccaaaga 14820
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tatttaatta ggtggtactt cctctgatcc aaaatatagt gtgtattaga tttttttttc 14940
aatatcaaat cttgtaaact gtaagcaagt tcatagaaaa ataataatat caacacctat 15000
aatacaaagt caataccatt agattcatca aatatatttg cacttgattt ggtactccct 15060
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tgtgagtagt ggtttcgggt ggcttgatgt atattcctgt tcgacctttg ttgaataata 29160
aataaagatg accgtatgca tcgattgatg cagaggccgg tgttttaacc tcctttttga 29220
aaggaaaagt actatgttag tagagtgctt agctgattaa ggatgaaaac tgcaatagct 29280
ccttactttc cctggtaaaa ctacaaatat cacaaatgca aacccaccca tcccggtagc 29340
ctcgtcaaat taaaataaaa aaaaatataa gaaaaggaaa atgcgaccgg cggctagcag 29400
ctccacctac cgcagctggc cggtcgtcgg tccttgcatc gcatccaagg cgacgccggc 29460
tccaccactg ccgccaccac tgattggtac cttaagctcc cgtgaagcta caagggagga 29520
ggccccctcg cctcccatcc attgttcctc aacagcttgg gtgccgagct cccccaccac 29580
cacactagac gcgctgggat tcattggatc cgctccagcg agcgagccgg attcagttca 29640
ccgagattat attcaccctt cccgtctgcc aactgattac ctcccttttc ccattctacc 29700
ctgggtgacc actctgctca ctctcactct ttctttctcc tctacgccgg ccgtgcacag 29760
cgcgacgccg acgaccgcat ccccccgacg ttgccgcagc cgccatacaa gtagaaggtg 29820
aggaccccct tcctctcctc ttcgtcctag ccagcggatc ctcagatctg agctgagtgg 29880
ggccgcagca agctcagact aaattgtttc ttacaaatct ttgagatgat ttccgtacca 29940
cgtatagaac tcctaatttc tcagcagaag aaatcaccgg gttctgggtt tgcgcacaaa 30000
gctttgattt tgttttgtgc tgtgctgtga aaattgagct cagatcttct tttagtagcc 30060
tgtgatttgt gcagtccaat ttgctgtgcg gtaccaacta agctcacatc tttttagtag 30120
aaagtaccta gtagttttta gagctttgct ttgcaagtag tacactagta ctacaaatta 30180
agctcacaca ttatattatt acagaggctc tgttttgttc agtactacaa agcttagatt 30240
ttgatttctg tactacgaat ttagctcaga tcttttttct gaacagcaag cttttaattt 30300
ctgcaaatag gaccgagatg gcaacctctc ccagctttgt gctacaccgc aagtactagg 30360
agcattgctg aatgccggat atagatcccc agatctaggc caagggtctc gctttctgct 30420
cactgttact tctatcatct ctccaatcga tccaaggtaa ttcatcgatt gcagcagcac 30480
caccctctat ttagtgtgca ctttcttttg tgtgcaatcc atgcttttcc tttacaacga 30540
attgttggta gtctctgctg agtgaatcta catgaccatc cttcttttcc attttttttg 30600
catgtcacta ttgatgtgtg aaaggtagta ataaagagga ctcattttgt gtgcatcctt 30660
tgttttcagt tccagctcaa gccactggac cctgcaacta cttgcgagac agcacgggat 30720
atctatctct gcaacaagat ccgtctctca tctctctagt cgattcaagg tacatagctg 30780
aatccagcta cacaacactt actctagtta tttttctttt ttgaaagagc tgatcgtgtg 30840
tctttccatt tcaattgttg gtgtttgttc aaggtaatac tatatcggtt ttatttcgag 30900
ccgaatttct gtgcactgtc tttgcaagcc acattttcct ttggatttgt tactagcctc 30960
tagtgagtga atctgattat ccttcctgtt agcatgggat tgttgatgtg aaaaagcgag 31020
gtagtaatac aaaggactaa tttttatttc catgcttctt ttcagtacta gttcaagcgt 31080
gagcaaaccc tgcaaccaat ggcgggggtt ctggatgctt tggcatccta cgtgaccaac 31140
atgctcaccg agatggctaa agaggaggtg gccatgctaa tcggcgtgtc tgacgggatc 31200
aaagacctaa gcatcaagct tggggacctc aagaatttcc ttgctgatgc tgataggagg 31260
aacattaccg atgatagtgt gcgggggtgg gtgggcgaac tgaagcgtgc catgtacttg 31320
gccactgaca tcgtcgacct atgtcagctc aaggccatgg agcaaggtca aacaaaggac 31380
agggcgtgcc ggtgccttaa ccctctgctc ttttgcatgc ggaatcccct ccacgcccac 31440
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agcagtttca atttcatcaa gctagaagcc taccaagacc aaaagaccac tcggtctccc 31560
gccactgacc ggaaaacaaa ttcactgatt gagcggtccg gtgtggttgg agagaagatc 31620
gaggaggaca cgagggcact tgtggaggtg cttacaaggg aggcggtagg tgacaagagt 31680
ggtcgcctca ttgtggtcgc cattgttggt atcggaggga ttggtaagac taccctcggc 31740
aagaaggtct tcaatgatga ggccatcgaa ggcaagttta ctaagaagat atggcttagc 31800
atcacacaag atttcaccga tgttgagttg ttaagtacga ccatcactgc cattggggca 31860
gatcttcctg gagggggtgg ggctccagac aaggccctac ttgtcgatgc tctcaagaac 31920
gccatcaagg acaagaagtt ctttcttgta ctagatgacc tgtgggatgt cgatgcatgg 31980
aacaaacatc taatgactcc ctttagctat ggtggccccg gtagtagagt cctcatcacc 32040
accagacatg acactgtagc ccgaagcatg aaagcctttc atccctacca tcatgttgac 32100
aaattagctc cacaagatgc ttggtcgttg ctcaagaagc aggtcggtac ttcccaaaac 32160
tcaatataat acacgtcgtt tgggactaca ctgttaagtt aatttgatct acacttgcat 32220
aagtctacca atctgaaatt tatatattta taatgcttcc ttgacttaaa tttcaccgta 32280
acacgagttc atcaagtttg tatatgaaat taggaagata ttaaacaata ttttcatttg 32340
tatgcatgat gtacggcttc tcaatttgtg gattattccg gacttaagtt tagcaattat 32400
cagggattgc atccagcttc tcaattagtt tctacttgca ggtagtcaca ggagaggaaa 32460
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gcttaccact tgctgtaaaa gttatgggtg gactcctatg caagaaggag aaaacacgac 32580
gtgattggca agacgtcttg aatgatgata tgtggtcagt atctcaaatg tcaaaggaac 32640
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gggttggtga aggattggtt gaaggagaca catatactcg tagtttggaa gaagggaata 32820
agtactataa ggagctaata gtaaggaacc ttatagaggt agatacaaag taccctagtc 32880
aacttatttg caacatgcat gatgttattc gctcatttgc tcaatttgtg gctagggatg 32940
aaacactagt aggtcacaat ggagatacta tcaaaacaaa tcttagatca ccgaattatc 33000
ttagattatc catagaaacg aaaggagtgg gatccgatga atttgagtgg agatatttaa 33060
gagagcaaaa attgcttagg tctctaatat taactggaaa cctcaaaagt cagcctgggg 33120
attcgttgac tatcttccca agtctacgtc ttttgcatat agaatcagca aatattgctg 33180
cactagttga atctatgtac caactcaagc atttgagata tttggcatta aagaggactg 33240
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atcttgatat gggtgacaca cgtgtaagta gtattcctag gggtttccga gctcttacaa 33420
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taaaatgtgg tggtagagtg ggacatgggt tggtccaagg agaggtctct gagtctaagg 33660
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tcccagatgg cttgtgcagg ctcccgtatt tggagtggat aaaagtgatg aatgctccag 33900
taatcaagtg tattggtcct gaattcgttc aacagtacaa tcagctgcac cgtccttcat 33960
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ttgaactcga attgggaaac atacctgaac tggccatgat ctccaatctt ccaaaattac 34260
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ggagactcga gctgaccatt ttcaacagcg aaaatcaact tccggtctac ctgcagactg 34380
tgaagcctag taatttgctg ctgacctgca acctagcggt actcacttcc atggctgagg 34440
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aggatggaga agatgagaag aaatggcacg tgttctacac atctgaatcc tgcaacatag 34560
agacaaatat tcatcaggta atactttggt ctctccctct ttcaatctag ctaataataa 34620
tattcttcct tattgttgtc tgttccatgc atatctattt tcatcagtat gatataggat 34680
agctgaatat atctcccact gtttttgttt tgcttgccag gatcgattgg tcgaagaaga 34740
ggagtaggct gaaactccag ccgaacgagg aaggaccata tgatgcaagg atatataagt 34800
atgtctgctg ttacaacttc aactagtttt gagatcgaat ccatgaaggg atacggggaa 34860
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atttgggatt gaacgatgag gccatcgaga ccaaattagc ttgcagggaa ggaccttttt 35460
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atactagtat catgcatatg atactagtgt ataaactaca tccatagtgc atagtatcat 35700
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ataattcaat cgaccgttca catgcaggac tagctgtaca acacagttga tgctacttgc 36300
tatagtgcca catgggtatc tgtaaccatt ccgtaattaa tggtttaacc caacggatgg 36360
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gctctgctct gttctctgaa agcagctcag gttgcagctt ctccattgtg gcgtttttct 37800
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tgctaaatac ttgtatagtt agaaggttac ttcagaaagg gggaatgccc agggctggga 38700
tttgtctgtc taaaattgat gagaggatct tcacccttga agcttccaca cctagcttgt 38760
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aagtgtctgt tggcatgctt gttcgaaggc caaggttcaa tcactatgga atttt 39535
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtgtcatgt ttggtcgata gg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcctcccttg tagcttcacg 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcttccttga cttaaatttc accg 24
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccacatatca tcattcaaga cg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agatgagaag aaatggcacg tg 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccagtataca tcactctgat tcg 23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atattcaccc ttcccgtctg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cttgccaatc acgtcgtgtt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcaccgtcct tcatctcagt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tgcttttccc cgtatccctt 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tagttcaagc gtgagcaaac c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccatgtttct tcaccagctg 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctgtagttga actcgaattg gg 22
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atggctgatg cttttccccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
actacttgcg agacagcacg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaagcatgaa agcctttcat cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tccattagtt gcttgcactg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
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<212> DNA
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agtagttgca gggtccagtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aaagctcgag atgctgcagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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tccgagtggg acaagttcag 20
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<211> 22
<212> DNA
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cacaggagag gaaaatgaac ca 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
caagaaggag aaaacacgac g 21
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<212> DNA
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tgtggctagg gatgaaacac 20
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catcatatgg tccttcctcg 20
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gcaaaatgtg atggcttacc ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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actagtgttt catccctagc 20
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tgtgcactgt ctttgcaagc 20
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gtgtagtccc aaacgacgtg 20
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gagtggagac attggacgct 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gatgaagata gggatgccgg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
agaacttctg tctcagcgcc 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tagaacaaca tagttgggtg c 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gtgtcggaga ctttcaagtc 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gatgtcggcc ctgtgagaa 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tttctgcttc ggggactgtg 20
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aacagaaaca attcaccatg gc 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
agcgagtgat atagatgcgc 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
tgcaaatggc cagagttcac 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
cttcacatgt gcacatgtcc 20
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
tattcataca atagcacacg ctc 23
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tctgcaagag cacccatagc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
aaaatcactt ccgggcaagc 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gtcaaataat acagtcgggg c 21
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tgaaggtatg caagagcttt gca 23
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
acacaggtat gacacgcacc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
caagcctgcg agcttgattg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tatgccagcg gtcgaacaac 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ggaacagcac ctcagggcac 20
<210> 61
<211> 727
<212> DNA
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 61
tgtgtcatgt ttggtcgata ggtgctacgc acgacaaatc ctttgcgtct ggatggacga 60
gcgcaggacg atagcgtcgt cgggcgtcgt ggtggcatcg acggaccggt aaggatgatg 120
cggatctatc tcctgaagat gggtcagcgg tccgatgatg atggcggctt ctaaaacgtg 180
tgcatgtgtt gtacgcattt tgtctgctgc gccggtgtta gttctgatac attatgtgga 240
tggatcggcg acgacactgg ttttagatat gggagtgaga gccctccaca ttatcgagtt 300
ttttagatgt gagtagtggt ttcgggtggc ttgatgtata ttcctgttcg acctttgttg 360
aataataaat aaagatgacc gtatgcatcg attgatgcag aggccggtgt tttaacctcc 420
tttttgaaag gaaaagtact atgttagtag agtgcttagc tgattaagga tgaaaactgc 480
aatagctcct tactttccct ggtaaaacta caaatatcac aaatgcaaac ccacccatcc 540
cggtagcctc gtcaaattaa aataaaaaaa aatataagaa aaggaaaatg cgaccggcgg 600
ctagcagctc cacctaccgc agctggccgg tcgtcggtcc ttgcatcgca tccaaggcga 660
cgccggctcc accactgccg ccaccactga ttggtacctt aagctcccgt gaagctacaa 720
gggagga 727
<210> 62
<211> 361
<212> DNA
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 62
gcttccttga cttaaatttc accgtaacac gagttcatca agtttgtata tgaaattagg 60
aagatattaa acaatatttt catttgtatg catgatgtac ggcttctcaa tttgtggatt 120
attccggact taagtttagc aattatcagg gattgcatcc agcttctcaa ttagtttcta 180
cttgcaggta gtcacaggag aggaaaatga accagaagtt gatatgctag aagatattgg 240
gctgcagatt atagcaaaat gtgatggctt accacttgct gtaaaagtta tgggtggact 300
cctatgcaag aaggagaaaa cacgacgtga ttggcaagac gtcttgaatg atgatatgtg 360
g 361
<210> 63
<211> 858
<212> DNA
<213> 粗山羊草 'PI511383'（Aegilops tauschii'PI511383'）
<400> 63
agatgagaag aaatggcacg tgttctacac atctgaatcc tgcaacatac tttggtttcc 60
ctctctttca atctactagc taataatatt cttccttaat gtaatctttg ttggttccat 120
gcatattgtt atcatcagta ttatatagga tagctgaatg tatctcccac tattttgttt 180
tgcttgccag gatcgattgg tggaagaaga ggactagacc gaaactccta cggaacgagt 240
ttaggcgaaa ggaccatatg atgcaaggat atacgtatgt ctactgttat agcttctact 300
agttttgggt attcttacct agtgccatga ccattggaat ctcatgttta atattatgat 360
cgaatccatg cagggatacc tggaaagcat cagccataat gccatataca cttaacctgc 420
agagattcgg acaccacact aatttcttgc gaagtgtgac atatacactt actaattttg 480
agatgtaaac ttcttggcgt actatctagc tggtgaagaa acatggtgac cttggcaagg 540
ctgtcctttg tgcagtgcaa gcaactaatg gagtttatgc tactctgctc tgctctgctc 600
tgttctctga aagcagctca ggttgcagct tctccattgt ggcgtttttc tttttctttt 660
tcacgggtgt tttgcgttgg ttctctgaaa aactatgttt tttttgatag accagtcaat 720
agtgtactgg tatttcagct tttaatttgt actgcaacca cacaaatgac tgtcagagag 780
tgtagtttat tcaagcttcc ggctgctgat ttgtaactgt atgtcatagg aattccgaat 840
cagagtgatg tatactgg 858

Claims (13)

1.一种抗条锈病基因，其特征在于，为以下a)-j)中任一项所述的核酸：
a)核酸，其由SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成；
b)核酸，其由SEQ ID NO.3所示的碱基序列组成；
c)核酸，其由SEQ ID NO.5所示的碱基序列组成；
d)核酸，其由SEQ ID NO.7所示的碱基序列组成；
e)核酸，其由SEQ ID NO.9所示的碱基序列组成；
f)核酸，其由SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成；
g)核酸，其由编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的碱基序列组成；
h)核酸，其由编码SEQ ID NO.4所示蛋白质的碱基序列组成；
i)核酸，其由编码SEQ ID NO.6所示蛋白质的碱基序列组成；
j)核酸，其由编码SEQ ID NO.8所示蛋白质的碱基序列组成。
2.一种由权利要求1所述的抗条锈基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
3.携带权利要求1所述的抗条锈病基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。
4.如下a)-f)中任一项所述的DNA片段作为抗条锈病基因在植物育种或小麦条锈病防治中的应用；
a)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的cDNA片段；
b)编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的cDNA片段；
c)SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的DNA片段；
d)编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的DNA片段；
e)cDNA片段或DNA片段，其编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8所示的蛋白等价，但在氨基酸序列上存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入；
f)cDNA片段或DNA片段，其在严格条件下与a)或c)的DNA片段杂交，且编码SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的蛋白。
5.如下1)-4)中任一项所述的DNA片段通过调控抗条锈病基因表达在植物育种或麦族植物条锈病防治中的应用；
1)DNA片段，其转录产物在植物细胞中上调SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达；
2)DNA片段，其翻译产物在植物细胞中上调SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达；
3)DNA片段，其转录产物在植物细胞中对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的转录RNA具有上调作用；
4)DNA片段，其翻译产物在植物细胞中对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因编码的蛋白具有上调作用。
6.含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌或权利要求2所述的蛋白在培育条锈病抗性提高或降低的麦族植物中的应用；优选的，所述麦族植物为小麦或大麦。
7.一种抗条锈病小麦或大麦的培育方法，其特征在于，所述培育方法包括：将SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因转入小麦或大麦中，获得抗条锈病小麦或大麦；或者上调小麦或大麦基因组中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达，筛选得到条锈病抗性提高的小麦或大麦植株；
优选的，将抗条锈病基因转入小麦或大麦中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法；
优选的，上调小麦或大麦基因组中的抗条锈病基因的表达的方法包括：导入能够激活或提高抗条锈病基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性的DNA片段；或者控制特异小RNA分子的合成，上调抗条锈病基因mRNA的积累。
8.一种培育条锈病抗性降低的小麦或大麦的方法，其特征在于，所述方法包括：抑制小麦或大麦基因组中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示的抗条锈病基因的表达，筛选得到条锈病抗性降低的小麦或大麦植株；
优选的，抑制小麦或大麦基因组中的抗条锈病基因的表达的方法包括：突变或敲除小麦或大麦中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10中至少一项所示基因的全部或者部分序列；或者使用干扰RNA干扰SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示基因的表达；或者使用基因沉默系统使SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中至少一项所示基因沉默。
9.一种用于鉴定权利要求1所述小麦抗条锈病基因的PCR标记，其特征在于，所述分子标记有三个，分别命名命名为Yr4DS-PM、Yr4DS-GM和Yr4DS-TM，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示。
10.用于扩增权利要求8所述PCR标记的引物，其特征在于，扩增Yr4DS-PM的引物的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；扩增Yr4DS-GM的引物的序列如SEQ ID NO.13和SEQID NO.14所示；扩增Yr4DS-TM的引物的序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
11.权利要求9所述的PCR标记或权利要求10所述的引物在如下任一项中的应用：
1)小麦或大麦抗条锈病基因的鉴定；
2)植物育种；
3)小麦或大麦条锈病防治。
12.一种获得携带权利要求1所述抗条锈病基因的植物细胞的方法，其特征在于，通过转基因或基因组编辑手段而获得。
13.一种获得携带权利要求1所述抗条锈病基因的植株的方法，其特征在于，由权利要求12所述的方法获得的植物细胞再生成苗。
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