CN105907862A - 一种检测与千粒重相关的TaAGPS基因等位变异的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用CAPS标记检测与千粒重相关的小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因（TaAGPS）优异等位变异的方法。本发明中两种等位变异（TaAGPS‑7A‑T和TaAGPS‑7A‑G）在TaAGPS‑7A外显子区5092位对应的碱基分别为T和G，其相应的氨基酸为丝氨酸（Ser）和丙氨酸（Ala），首先利用引物对SEQ ID No：1和SEQ ID No：2进行PCR扩增，经DdeI内切酶进行酶切后电泳检测，可以方便有效地实现TaAGPS基因不同等位变异在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定。本发明通过常规的PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法就可以完成，操作方便，且稳定可行。

Description

一种检测与千粒重相关的TaAGPS基因等位变异的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体是关于一种使用CAPS（Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequence）标记检测与千粒重相关的TaAGPS基因优良等位变异的方法。

背景技术

小麦的基因组为异源六倍体，由A、B和D三个同源性极高的基因组组成，基因组庞大且复杂，这为小麦遗传育种研究的发展提供了挑战。小麦是世界上最重要的粮食作物之一，在全球各地广泛种植。Rajaram等研究表明：随着世界人口的增加，预计全球对小麦的需求量将在2020年进一步增长40%，因此培育高产的小麦品种成为当前育种家的主要育种目标之一。小麦的产量由小穗数、穗粒数和千粒重等三要素构成，中国小麦产量的提高主要是依靠增加穗粒数和千粒重（王兰芬等）；而淀粉占小麦籽粒干重的65-75%，淀粉合成的量及所占比例显著影响小麦千粒重，从而影响小麦产量。

淀粉的合成是一个复杂的过程，目前已经确认参与胚乳淀粉合成的酶主要由六种，包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SS）、分支酶（BE）、去分支酶（DBE）和葡萄糖-6磷酸转移酶（GPT1）等。由于这些酶的相互作用，保证了植物体合成新的淀粉从而满足自身需求，其中AGPase在高等植物中催化1-磷酸葡萄糖（G-1-P）与腺苷三磷酸（ATP）形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和焦磷酸（PPi），而ADPG是直链和支链淀粉合成的底物，同时其浓度直接影响淀粉合成的速率和效率，因此AGPase是小麦、水稻和玉米等高等植物中淀粉合成途径中的关键酶。王月福等研究表明AGPase的活性变化与籽粒灌浆速率和淀粉含量的积累呈显著地正相关。Smidansky等人将含有特异位点突变的玉米AGPase基因转入小麦中，能够显著增加籽粒的重量及其淀粉含量；但如果该基因发生突变或进行人工敲除，则该酶的活性会随之降低或消失，从而抑制淀粉的合成。

小麦等禾本科作物中的AGPase是由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体，根据其在胚乳细胞内的分布，可分为胞质型和质体型两种，因此AGPase存在着四种亚基，包括胞质型小亚基、质体型小亚基、胞质型大亚基和质体型大亚基。有研究表明AGPase小亚基保守型相对较高，且同时具有催化活性和调节活性，对淀粉的合成起关键作用，而胞质型的AGPase占总酶活性的65-95%，因此胞质型的AGPase小亚基在淀粉合成中尤为重要。Yano等研究表明水稻AGPS2基因的突变导致AGPase酶活性降低和胚乳淀粉积累减少，Ventriglia等分析拟南芥中AGPase小亚基(APS1）的T-DNA插入突变体aps1发现AGPase活性完全缺失，且叶片中瞬时淀粉的合成量几乎没有。因此在小麦中研究胞质型AGPase小亚基（TaAGPS）显得尤为重要，但到目前为止，在小麦中对于TaAGPS基因的优良等位变异筛选及其分子标记几乎没有报道，这极大阻碍了小麦淀粉合成关键基因AGPase在小麦产量性状改良中的应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决普通小麦中胞质型AGPase小亚基基因（TaAGPS）的优良等位变异检测的技术问题，提供了一种检测小麦TaAGPS基因优良等位变异的方法并可直接用于产量改良中对优良等位基因的选择。

本发明所提供的技术方案是：一种检测小麦中与千粒重相关的胞质型AGPS小亚基基因等位变异的引物对，所述引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。

本发明人根据TaAGPS基因的基因组序列，在外显子区和外显子区的保守序列位置设计引物对，外显子区和外显子区之间的序列在不同小麦材料的基因间存在多态性，所述引物对中的一条引物序列位于所述外显子区中，所述引物对的另一条引物序列位于所述外显子区中。

本发明还提供一种小麦中辅助检测与千粒重相关的胞质型AGPase小亚基基因等位变异的方法，包括如下步骤：

1） 用所述的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2）用限制性内切酶DdeI对步骤1）得到的PCR扩增产物进行酶切，从而得到酶切产物；

3）检测所述酶切产物的多态性，其中对于TaAGPS-7A-T等位变异类型，经酶切后产生234bp和402bp的两个短片段，而对于TaAGPS-7A-G等位变异类型，则没有短片段产生。

所述的方法，采用琼脂糖凝胶中电泳后，根据有无234bp和402bp的短片段的条带有无来区分TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T两种等位变异。

上述方法中，所述AGPase为小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。

上述方法中，所述TaAGPS基因为小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因。

上述方法中，所述多态性为234bp和402bp两个短片段的有无。

上述方法中，所述外显子区和外显子区之间的序列是具有单碱基差异序列。

上述方法中，所述根据酶切产物的多态性确定所述待测材料中待测TaAGPS基因的等位变异的方法为：将所述PCR扩增产物经DdeI内切酶酶切后分析是否能产生234bp和402bp两个短片段（即新的短片段的有无分别对应不同的等位变异类型）。

本发明还提供所述的引物，或所述的方法在小麦培育中的应用：培育高千粒重的小麦品种，筛选具有TaAGPS-7A-G等位变异类型的品种。

所述的应用是在筛选高千粒重小麦和低千粒重的小麦中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明为解决普通小麦胞质型AGPase小亚基基因（TaAGPS）的优良等位变异检测的技术问题，提供一种检测方法，有助于快速有效地鉴定小麦TaAGPS基因等位变异类型及应用于分子标记辅助育种。该方法基于普通小麦品种中TaAGPS基因的特点：在外显子区域设计特异的PCR引物，通过PCR的方法扩增得到TaGAPS基因的DNA片段，将所述PCR扩增产物经DdeI内切酶酶切后得到酶切产物，通过一定的鉴定方法（琼脂糖凝胶电泳）来检测这些酶切产物之间的多态性，进而可以达到鉴定一个小麦品种中TaAGPS基因等位变异的目的。应用该策略可以建立分子标记检测体系，对TaAGPS基因的优良等位变异进行有效的分离鉴定，也可以对构建的近等基因系或重组自交系群体材料的TaAGPS基因的等位变异类型进行鉴定；这种分子标记体系构建策略也可以进一步推广到对具有类似序列特征功能基因的等位变异的分离鉴定。

本发明方法中，根据实验室前期研究的结果以及Genbank中的TaAGPS基因序列所设计的引物，用保守引物进行TaAGPS基因分离鉴定的验证试验证明了该引物的保守性和有效性，也表明了该分子标记体系的准确性和可靠性。

本发明方法无需昂贵的仪器和试剂，通过常规的PCR仪和琼脂糖凝胶电泳仪就可以完成，易于操作。本发明方法基于DdeI内切酶可以识别特异碱基位点（CTNAG），并进行切割，通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行片段分型，可以有效分离并准确鉴定TaAGPS基因不同的等位变异。在本发明方法中，通过一次PCR反应和一次酶切反应就可以检测一个小麦品种中TaAGPS基因的等位变异类型，而且PCR仪和琼脂糖凝胶电泳仪都是自动化和高通量的仪器。本发明方法极大地提高了TaAGPS基因鉴定的效率和准确性。

本发明的基于CAPS分子标记构建策略，不仅适用于TaAGPS基因分子标记检测体系的构建，同样适用于序列中含有特异酶切位点识别碱基的、控制重要性状基因的分子标记检测体系的构建。该发明将直接促进TaAGPS基因的等位变异鉴定以及在小麦遗传育种中对优异等位基因的应用。

附图说明

图1 中国春TaAGPS基因的核苷酸序列差异性比较。

不同背景颜色表示不同的核苷酸相似性。图中背景颜色越深表示核苷酸相似性越高。黑色：核苷酸相似性为100%；深灰色：核苷酸相似性为50%；灰色：核苷酸相似性为30%；白色：核苷酸相似性为0%。

图2 中国春TaAGPS基因序列中外显子与外显子上引物的位置。

Exon , 外显子区；Intron ，内含子区；Exon ，外显子区。保守引物对由ScytoABDF3和Scyto3R组成

图3 高、低千粒重的两组品种酶切后2%琼脂糖凝胶电泳检测。

TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T代表TaAGPS-7A上的两种等位变异。

1-7分别代表材料小偃81、郑麦9023、敌锈早、中优9507、有芒白稃、猪毛元字头和火麦，M为Marker 。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、不同千粒重材料TaAGPS基因序列差异性分析

一、引物设计

通过利用MegAlign软件将普通小麦中国春的TaAGPS的不同染色体上的基因组DNA序列和cDNA序列进行多序列比对，发现这些基因序列存在如下特点：（1）三个同源基因TaAGPS-7A、TaAGPS-7B和TaAGPS-7D在外显子区域存在一些SNP多态性；（2）三个同源基因TaAGPS-7A、TaAGPS-7B和TaAGPS-7D的外显子和内含子密集区分布在基因的后半部分（图1）。因此，我们提出了一种分析不同千粒重材料TaAGPS基因序列差异的方案：选择覆盖TaAGPS基因外显子和内含子密集区的后半部分区域设计基因间保守的PCR引物，通过基因克隆的方法得到含有不同TaAGPS基因的序列信息，通过对不同材料的不同基因组序列进行多序列比对分析期望在外显子区找到一些等位变异，从而实现对TaAGPS基因优异等位变异筛选的目的。

将中国春中的TaAGPS基因进行了多序列比对，根据其保守的区域（外显子和内含子）的序列设计PCR引物对SEQ ID No：3和SEQ ID No：4。理论上此引物对可以扩增一个小麦品种中所有的TaAGPS基因。

为了进一步验证所设计PCR引物的保守性，将中国春中的TaAGPS基因与乌拉尔图小麦和山羊草中的AGPS进行了多序列比对，通过对引物序列比对搜索，发现此引物对在所使用的序列中都一致，说明此引物具有很高的保守性。

二、不同小麦材料中TaAGPS基因的克隆

千粒重差异明显的7份小麦品种（小偃81、郑麦9023、敌锈早、中优9507、有芒白稃、猪毛元字头和火麦）来自中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室。

利用CTAB法从小麦材料的叶片中提取基因组DNA。

利引物对（SEQ ID No：3和SEQ ID No：4）（见表1）以小偃81、郑麦9023、敌锈早、中优9507、有芒白稃、猪毛元字头和火麦的基因组DNA为模板进行PCR，反应体系如下：

LA Taq （5 U/μL）（Takara公司）	0.2 μL
		2 × buffer I	10 μL
dNTP （10 mM）	0.8 μL
		上游引物（10 μM）	0.5 μL
下游引物（10 μM）	0.5 μL
		ddH2O	7 μL
模板DNA（100 ng/μL）	1 μL
		反应总体积	20 μL

PCR扩增得到的特异性产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离后，回收预期大小目的条带，将回收产物与PGEM®-T质粒连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中得到转化子，并用原来相应的引物组合鉴定得到阳性克隆。

三、对7份小麦品种中TaAGPS基因的Sanger法测序分析

通过对阳性单克隆进行测序分析表明：每个小麦品种得到三类序列信息，分别为TaAGPS-7A、TaAGPS-7B和TaAGPS-7D序列，并且高、低千粒重的两组小麦品种在TaAGPS基因上的序列存在差异。具体结果表明这些小麦品种在TaAGPS-7B和TaAGPS-7D上各检测到一种序列，而在TaAGPS-7A上的外显子区5092位置（起始位置从ATG开始算起）存在两种等位变异（见表2）。在TaAGPS-7A上的外显子区5092bp位置高千粒重品种为G，而低千粒重品种为T，而在TaAGPS-7B和TaAGPS-7D相应位置上均为G。因此，根据高、低千粒重两组小麦品种TaAGPS-7A基因在外显子区上的碱基差异分别命名为TaAGPS-7A-G 和TaAGPS-7A-T。

表 1 TaAGPS基因保守引物序列

引物名称	序列(5'->3')	引物编号
			ScytoABDF3	CAGGGTACTGCAGATGCTGT	SEQ ID No：1
Scyto3R	CGGAGAAGCTGAAGCATCA	SEQ ID No：2
			Scyto4F	CAACTGCATTTGGCCTTATG	SEQ ID No：3
ScytoR2a	GGCAAGGCCTAAAGCTTG	SEQ ID No：4

表 2 TaAGPS基因不同等位变异

样品名称	千粒重 (g)	TaAGPS-7A (5092)
			小偃81	43.88	G
郑麦9023	51.76	G
			敌锈早	47.73	G
中优9507	48.85	G
			有芒白稃	21.57	T
猪毛元字头	27.14	T
			火麦	22.95	T

实施例2、检测其他小麦品种TaAGPS基因等位变异

通过比较两种等位基因的序列差异发现，低千粒重等位基因与高千粒重等位基因相比，由于5092位置碱基的不同，使得低千粒重等位基因TaAGPS-7A-T在此位点含有一个DdeI内切酶位点（CTCAG）而高千粒重等位基因TaAGPS-7A-G（CGCAG）无此内切酶位点。因此，根据5092位置的SNP开发了以DdeI内切酶为工具的CAPS标记来区分TaAGPS-7A的两种等位变异。为了方便操作，利用保守引物对（SEQ ID No：1和SEQ ID No：2）扩增包含三个同源基因的636bp的片段，经DdeI酶切后，TaAGPS-7A-T类型产生234bp和402bp两个短片段，而TaAGPS-7A-G类型没有短片段产生。在2%的琼脂糖凝胶中电泳后，可根据234bp和402bp的短片段的有无来区分TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T两种等位变异。

利用本发明方法已经有效分析了小麦微核心种质部分材料（200多份）的TaAGPS-7A等位变异类型，选取7份小麦品种进行展示。

一、引物设计

根据TaAGPS等位基因的序列信息，在外显子区和外显子区的保守序列位置设计的引物对SEQ ID No：1和SEQ ID No：2（表1），且此引物对扩增的DNA序列包含高、低千粒重两组小麦品种在TaAGPS-7A上存在的两种等位变异，所述引物对中的一条引物序列位于所述外显子区中，所述引物对的另一条引物序列位于所述外显子区中（图2）。

二、PCR扩增

利用实施例1中所提的千粒重差异明显的7份小麦品种的基因组DNA作为模板。

利用引物对SEQ ID：1和SEQ ID：2进行PCR，反应体系如下：

LA Taq （5 U/μL）（Takara公司）	0.2 μL
		2 × buffer I	10 μL
dNTP （10 mM）	0.8 μL
		上游引物（10 μM）	0.5 μL
下游引物（10 μM）	0.5 μL
		ddH2O	7 μL
模板DNA（100 ng/μL）	1 μL
		反应总体积	20 μL

三、PCR扩增产物的酶切

利用DdeI内切酶（NEB公司产品）对PCR扩增产物进行酶切，酶切体系如下：

DdeI （10U/μL）	0.5 μL
		10× CutSmart NEBuffer	2 μL
PCR产物	10 μL
		ddH2O	7.5 μL
反应总体积	20μL

将混合物在37℃条件下孵育3小时，然后再65℃条件下孵育20分钟使DdeI内切酶失活。

四、酶切产物类型检测

利用琼脂糖凝胶电泳的方法对千粒重差异明显的7份小麦品种的酶切产物进行检测。分析结果表明：低千粒重材料（有芒白稃、猪毛元字头、火麦）酶切后产生234bp和402bp两个短片段，而高千粒重材料（小偃81、郑麦9023、敌锈早和中优9507）没有新的短片段产生（图3）。因此，可根据234bp和402bp两个短片段的有无来区分TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T两种等位变异。

五、不同等位变异与千粒重的关联分析

通过比较不同粒重材料TaAGPS基因序列的差异性，发现在TaAGPS-7A上的5092位存在两种等位变异是可能造成千粒重差异的功能位点。因此，利用5092位点开发的TaAGPS-7A的CAPS标记对我国小麦微核心种质部分材料（217份）进行群体扫描，通过与这些材料的三年千粒重数据进行关联分析验证该基因的功能。

首先利用TaAGPS-7A的CAPS标记对我国小麦微核心种质部分材料（217份）进行基因型鉴定，其中包括现代品种（78份）和地方品种（139份）。结果发现，含有TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T等位变异的材料数目分别为82和135。将待测材料按照现代品种和地方品种分别进行分析后，显示含有TaAGPS-7A-G等位变异的材料在现代品种中占的比例较高（71.79%），而含有TaAGPS-7A-T等位变异的材料在地方品种中占的比例较高（81.29%）（表3）。这个结果表明TaAGPS-7A-G等位变异是TaAGPS-7A基因的一个优异等位基因，在现代育种中得到了选择，结果也暗示了在现代品种中一些与产量或品质相关的主要基因在育种过程中已经得到了选择，很多等位变异已被淘汰，而在地方品种中这些基因资源还有可能被保留着，需要对其进一步鉴定和挖掘。

根据TaAGPS-7A的等位变异，对我国小麦微核心种质部分材料（217份）的三年千粒重数据进行了分析（表4）。结果表明，分别含有TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T等位变异的品种的平均千粒重在三年间均达到了极显著水平（P<0.001）。在现代品种中，含有TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T等位变异的品种间千粒重在2005和2006年两年间均达到了极显著水平（P<0.01），而在地方品种中，含有TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T等位变异的品种间千粒重在三年间均达到了极显著水平（P<0.01）（表4）。总之，TaAGPS-7A不同等位变异与千粒重显著相关，含有TaAGPS-7A-G等位变异品种的千粒重显著高于TaAGPS-7A-T的，TaAGPS-7A-G属于TaAGPS-7A基因的优异等位基因类型；该结果同时表明TaAGPS-7A的CAPS标记可作为小麦千粒重的功能标记在小麦产量改良中加以应用。

表 3 TaAGPS-7A等位变异的分布频率

基因型	现代品种数目	现代品种比例（%）	地方品种数目	地方品种比例（%）	材料总和
						TaAGPS-7A-G	56	71.79%	26	18.71%	82
TaAGPS-7A-T	22	28.21%	113	81.29%	135

表 4 TaAGPS-7A等位变异与千粒重的关联分析

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种检测与千粒重相关的TaAGPS基因等位变异的方法

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<400> 1

CAGGGTACTGCAGATGCTGT

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<400> 2

CGGAGAAGCTGAAGCATCA

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<400> 3

CAACTGCATTTGGCCTTATG

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<400> 4

GGCAAGGCCTAAAGCTTG

Claims (5)

1.一种检测小麦中与千粒重相关的胞质型AGPS小亚基基因等位变异的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。

2.一种小麦中辅助检测与千粒重相关的胞质型AGPase小亚基基因等位变异的方法，包括如下步骤：

1） 权利要求1所述的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2）用限制性内切酶DdeI对步骤1）得到的PCR扩增产物进行酶切，从而得到酶切产物；

3）检测所述酶切产物的多态性，其中对于TaAGPS-7A-T等位变异类型，经酶切后产生234bp和402bp的两个短片段，而对于TaAGPS-7A-G等位变异类型，则没有短片段产生。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：采用琼脂糖凝胶中电泳后，根据有无234bp和402bp的短片段的条带有无来区分TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T两种等位变异。

4.如权利要求1所述的引物，或权利要求2所述的方法在小麦培育中的应用，其特征在于，培育高千粒重的小麦品种，筛选具有TaAGPS-7A-G等位变异类型的品种。

5.如权利要求1所述的引物，或权利要求2所述的方法在筛选高千粒重小麦和低千粒重的小麦中的应用。