CN109706261B - 一种鉴定西瓜品种真实性的方法及其专用snp引物组合 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定西瓜品种真实性的方法及其专用SNP引物组合。本发明所提供的SNP引物组合由32个引物组组成。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。32个引物组中各个引物的核苷酸序列依次如序列表中序列1至序列96所示。本发明提供的SNP引物组合可用于对西瓜品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为西瓜种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知西瓜品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种鉴定西瓜品种真实性的方法及其专用SNP引物组合

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定西瓜品种真实性的方法及其专用引物组合。

背景技术

我国是西瓜生产和消费第一大国，年播种面积达182.8万公顷，占所有蔬菜栽培面积的7.9％。我国的西瓜育种从20世纪50年代开始到现在，已经实现了至少5次品种更新换代，育成了不同时期的西瓜主栽品种，大大推动了我国西瓜产业的发展。但问题也接踵而来，由于各省市之间的品种审定不协调，西瓜的品种管理和种质监测未能及时跟进，导致市场上出现了大量的同种异名及同名异种的现象，种子质量得不到保障，导致种子市场受到严重影响。根据《非主要农作物品种登记指南》的要求，品种特性说明和品种DUS测试报告中涉及的有关性状如有明确关联基因，可以直接提交DNA检测结果。因此，建立一套基于DNA指纹有效进行西瓜品种真实性和纯度鉴定的分子标记显得尤为重要。这一套分子标记要能够覆盖全基因组、尽可能多的代表全基因组遗传背景的变异位点；而且能够组合尽可能少的遗传变异位点，最大限度地反映品种的遗传多样性。

SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)是指在基因组上单个核苷酸的变异。近年来，SNP作为第三代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着第二代测序技术的发展和测序成本的降低，大规模西瓜重测序成为可能。基于分析西瓜变异组数据，可以挖掘更加稳定高效的SNP位点。采用等位基因竞争性特异PCR法，可以开发其特异性引物，最终获得样本在SNP位点的基因型。

目前，我国西瓜品种鉴定DNA分子检测主要依据SSR分子标记法,但是SSR引物的研发没有参考西瓜基因组变异组信息，存在不真实变异情况；SSR引物筛选所用的品种数量较少，且不能代表我国当前市场的销售品种；另外受限于SSR检测方式极易导致不真实、假阳性、假阴性结果；不能适应自动化、高通量、大规模的要求。与SSR标记相比，SNP具有多个方面的优势：变异清晰稳定容易检测，真实性准确性高；每个作物均有数以百万计SNP可供选择；适宜于高通量、低成本、自动化快速检测，可减少人为误差；SNP分型无需对照品种，以准确的碱基呈现结果。

发明内容

本发明的目的是鉴定西瓜品种。

本发明首先保护SNP位点组合，可包括西瓜基因组的32个SNP位点；所述32个SNP位点如下：WmSNP01位点为1号染色体上的第1122位核苷酸；WmSNP02位点为1号染色体上的第10817435位核苷酸；WmSNP03位点为1号染色体上的第21348158位核苷酸；WmSNP04位点为2号染色体上的第2127559位核苷酸；WmSNP05位点为2号染色体上的第4230860位核苷酸；WmSNP06位点为2号染色体上的第20693304位核苷酸；WmSNP07位点为2号染色体上的第29349735位核苷酸；WmSNP08位点为3号染色体上的第1709047位核苷酸；WmSNP09位点为3号染色体上的第11005823位核苷酸；WmSNP10位点为3号染色体上的第12844014位核苷酸；WmSNP11位点为3号染色体上的第18643310位核苷酸；WmSNP12位点为3号染色体上的第22502999位核苷酸；WmSNP13位点为4号染色体上的第2957012位核苷酸；WmSNP14位点为4号染色体上的第5681783位核苷酸；WmSNP15位点为4号染色体上的第16905245位核苷酸；WmSNP16位点为5号染色体上的第340755位核苷酸；WmSNP17位点为5号染色体上的第15995147位核苷酸；WmSNP18位点为6号染色体上的第13390860位核苷酸；WmSNP19位点为6号染色体上的第17247806位核苷酸；WmSNP20位点为7号染色体上的第5566096位核苷酸；WmSNP21位点为7号染色体上的第7476047位核苷酸；WmSNP22位点为7号染色体上的第29615402位核苷酸；WmSNP23位点为8号染色体上的第8744123位核苷酸；WmSNP24位点为8号染色体上的第16953730位核苷酸；WmSNP25位点为9号染色体上的第2062377位核苷酸；WmSNP26位点为9号染色体上的第17645415位核苷酸；WmSNP27位点为10号染色体上的第381513位核苷酸；WmSNP28位点为10号染色体上的第3501753位核苷酸；WmSNP29位点为10号染色体上的第10725827位核苷酸；WmSNP30位点为11号染色体上的第7776633位核苷酸；WmSNP31位点为11号染色体上的第10129918位核苷酸；WmSNP32位点为11号染色体上的第21777635位核苷酸。

所述SNP位点组合具体可由上述32个SNP位点组成。

本发明还保护SNP引物组合，可包括用于扩增所述WmSNP01的引物组1、用于扩增所述WmSNP02的引物组2、用于扩增所述WmSNP03的引物组3、用于扩增所述WmSNP04的引物组4、用于扩增所述WmSNP05的引物组5、用于扩增所述WmSNP06的引物组6、用于扩增所述WmSNP07的引物组7、用于扩增所述WmSNP08的引物组8、用于扩增所述WmSNP09的引物组9、用于扩增所述WmSNP010的引物组10、用于扩增所述WmSNP11的引物组11、用于扩增所述WmSNP12的引物组12、用于扩增所述WmSNP13的引物组13、用于扩增所述WmSNP14的引物组14、用于扩增所述WmSNP15的引物组15、用于扩增所述WmSNP16的引物组16、用于扩增所述WmSNP17的引物组17、用于扩增所述WmSNP18的引物组18、用于扩增所述WmSNP19的引物组19、用于扩增所述WmSNP20的引物组20、用于扩增所述WmSNP21的引物组21、用于扩增所述WmSNP22的引物组22、用于扩增所述WmSNP23的引物组23、用于扩增所述WmSNP24的引物组24、用于扩增所述WmSNP25的引物组25、用于扩增所述WmSNP26的引物组26、用于扩增所述WmSNP27的引物组27、用于扩增所述WmSNP28的引物组28、用于扩增所述WmSNP29的引物组29、用于扩增所述WmSNP30的引物组30、用于扩增所述WmSNP31的引物组31和用于扩增所述WmSNP32的引物组32。

所述SNP引物组合中，所述引物组1可由序列1所示的正向引物01F1、序列2所示的正向引物01F2和序列3所示的反向引物01R组成。所述引物组2可由序列4所示的正向引物02F1、序列5所示的正向引物02F2和序列6所示的反向引物02R组成。所述引物组3可由序列7所示的正向引物03F1、序列8所示的正向引物03F2和序列9所示的反向引物03R组成。所述引物组4可由序列10所示的正向引物04F1、序列11所示的正向引物04F2和序列12所示的反向引物04R组成。所述引物组5可由序列13所示的正向引物05F1、序列14所示的正向引物05F2和序列15所示的反向引物05R组成。所述引物组6可由序列16所示的正向引物06F1、序列17所示的正向引物06F2和序列18所示的反向引物06R组成。所述引物组7可由序列19所示的正向引物07F1、序列20所示的正向引物07F2和序列21所示的反向引物07R组成。所述引物组8可由序列22所示的正向引物08F1、序列23所示的正向引物08F2和序列24所示的反向引物08R组成。所述引物组9可由序列25所示的正向引物09F1、序列26所示的正向引物09F2和序列27所示的反向引物09R组成。所述引物组10可由序列28所示的正向引物10F1、序列29所示的正向引物10F2和序列30所示的反向引物10R组成。所述引物组11可由序列31所示的正向引物11F1、序列32所示的正向引物11F2和序列33所示的反向引物11R组成。所述引物组12可由序列34所示的正向引物12F1、序列35所示的正向引物12F2和序列36所示的反向引物12R组成。所述引物组13可由序列37所示的正向引物13F1、序列38所示的正向引物13F2和序列39所示的反向引物13R组成。所述引物组14可由序列40所示的正向引物14F1、序列41所示的正向引物14F2和序列42所示的反向引物14R组成。所述引物组15可由序列43所示的正向引物15F1、序列44所示的正向引物15F2和序列45所示的反向引物15R组成。所述引物组16可由序列46所示的正向引物16F1、序列47所示的正向引物16F2和序列48所示的反向引物16R组成。所述引物组17可由序列49所示的正向引物17F1、序列50所示的正向引物17F2和序列51所示的反向引物17R组成。所述引物组18可由序列52所示的正向引物18F1、序列53所示的正向引物18F2和序列54所示的反向引物18R组成。所述引物组19可由序列55所示的正向引物19F1、序列56所示的正向引物19F2和序列57所示的反向引物19R组成。所述引物组20可由序列58所示的正向引物20F1、序列59所示的正向引物20F2和序列60所示的反向引物20R组成。所述引物组21可由序列61所示的正向引物21F1、序列62所示的正向引物21F2和序列63所示的反向引物21R组成。所述引物组22可由序列64所示的正向引物22F1、序列65所示的正向引物22F2和序列66所示的反向引物22R组成。所述引物组23可由序列67所示的正向引物23F1、序列68所示的正向引物23F2和序列69所示的反向引物23R组成。所述引物组24可由序列70所示的正向引物24F1、序列71所示的正向引物24F2和序列72所示的反向引物24R组成。所述引物组25可由序列73所示的正向引物25F1、序列74所示的正向引物25F2和序列75所示的反向引物25R组成。所述引物组26可由序列76所示的正向引物26F1、序列77所示的正向引物26F2和序列78所示的反向引物26R组成。所述引物组27可由序列79所示的正向引物27F1、序列80所示的正向引物27F2和序列81所示的反向引物27R组成。所述引物组28可由序列82所示的正向引物28F1、序列83所示的正向引物28F2和序列84所示的反向引物28R组成。所述引物组29可由序列85所示的正向引物29F1、序列86所示的正向引物29F2和序列87所示的反向引物29R组成。所述引物组30可由序列88所示的正向引物30F1、序列89所示的正向引物30F2和序列90所示的反向引物30R组成。所述引物组31可由序列91所示的正向引物31F1、序列92所示的正向引物31F2和序列93所示的反向引物31R组成。所述引物组32可由序列94所示的正向引物32F1、序列95所示的正向引物32F2和序列96所示的反向引物32R组成。

所述SNP引物组合中，所述引物组1可由序列1自5’末端起第22至44位所示的正向引物01F1、序列2自5’末端起第22至46位所示的正向引物01F2和序列3所示的反向引物01R组成。所述引物组2可由序列4自5’末端起第22至46位所示的正向引物02F1、序列5自5’末端起第22至46位所示的正向引物02F2和序列6所示的反向引物02R组成。所述引物组3可由序列7自5’末端起第22至52位所示的正向引物03F1、序列8自5’末端起第22至54位所示的正向引物03F2和序列9所示的反向引物03R组成。所述引物组4可由序列10自5’末端起第22至49位所示的正向引物04F1、序列11自5’末端起第22至49位所示的正向引物04F2和序列12所示的反向引物04R组成。所述引物组5可由序列13自5’末端起第22至48位所示的正向引物05F1、序列14自5’末端起第22至47位所示的正向引物05F2和序列15所示的反向引物05R组成。所述引物组6可由序列16自5’末端起第22至50位所示的正向引物06F1、序列17自5’末端起第22至51位所示的正向引物06F2和序列18所示的反向引物06R组成。所述引物组7可由序列19自5’末端起第22至45位所示的正向引物07F1、序列20自5’末端起第22至46位所示的正向引物07F2和序列21所示的反向引物07R组成。所述引物组8可由序列22自5’末端起第22至57位所示的正向引物08F1、序列23自5’末端起第22至56位所示的正向引物08F2和序列24所示的反向引物08R组成。所述引物组9可由序列25自5’末端起第22至49位所示的正向引物09F1、序列26自5’末端起第22至49位所示的正向引物09F2和序列27所示的反向引物09R组成。所述引物组10可由序列28自5’末端起第22至46位所示的正向引物10F1、序列29自5’末端起第22至48位所示的正向引物10F2和序列30所示的反向引物10R组成。所述引物组11可由序列31自5’末端起第22至47位所示的正向引物11F1、序列32自5’末端起第22至46位所示的正向引物11F2和序列33所示的反向引物11R组成。所述引物组12可由序列34自5’末端起第22至49位所示的正向引物12F1、序列35自5’末端起第22至49位所示的正向引物12F2和序列36所示的反向引物12R组成。所述引物组13可由序列37自5’末端起第22至53位所示的正向引物13F1、序列38自5’末端起第22至54位所示的正向引物13F2和序列39所示的反向引物13R组成。所述引物组14可由序列40自5’末端起第22至53位所示的正向引物14F1、序列41自5’末端起第22至53位所示的正向引物14F2和序列42所示的反向引物14R组成。所述引物组15可由序列43自5’末端起第22至49位所示的正向引物15F1、序列44自5’末端起第22至49位所示的正向引物15F2和序列45所示的反向引物15R组成。所述引物组16可由序列46自5’末端起第22至48位所示的正向引物16F1、序列47自5’末端起第22至49位所示的正向引物16F2和序列48所示的反向引物16R组成。所述引物组17可由序列49自5’末端起第22至52位所示的正向引物17F1、序列50自5’末端起第22至54位所示的正向引物17F2和序列51所示的反向引物17R组成。所述引物组18可由序列52自5’末端起第22至48位所示的正向引物18F1、序列53自5’末端起第22至47位所示的正向引物18F2和序列54所示的反向引物18R组成。所述引物组19可由序列55自5’末端起第22至46位所示的正向引物19F1、序列56自5’末端起第22至45位所示的正向引物19F2和序列57所示的反向引物19R组成。所述引物组20可由序列58自5’末端起第22至46位所示的正向引物20F1、序列59自5’末端起第22至46位所示的正向引物20F2和序列60所示的反向引物20R组成。所述引物组21可由序列61自5’末端起第22至45位所示的正向引物21F1、序列62自5’末端起第22至43位所示的正向引物21F2和序列63所示的反向引物21R组成。所述引物组22可由序列64自5’末端起第22至52位所示的正向引物22F1、序列65自5’末端起第22至54位所示的正向引物22F2和序列66所示的反向引物22R组成。所述引物组23可由序列67自5’末端起第22至44位所示的正向引物23F1、序列68自5’末端起第22至43位所示的正向引物23F2和序列69所示的反向引物23R组成。所述引物组24可由序列70自5’末端起第22至48位所示的正向引物24F1、序列71自5’末端起第22至49位所示的正向引物24F2和序列72所示的反向引物24R组成。所述引物组25可由序列73自5’末端起第22至47位所示的正向引物25F1、序列74自5’末端起第22至46位所示的正向引物25F2和序列75所示的反向引物25R组成。所述引物组26可由序列76自5’末端起第22至51位所示的正向引物26F1、序列77自5’末端起第22至50位所示的正向引物26F2和序列78所示的反向引物26R组成。所述引物组27可由序列79自5’末端起第22至48位所示的正向引物27F1、序列80自5’末端起第22至47位所示的正向引物27F2和序列81所示的反向引物27R组成。所述引物组28可由序列82自5’末端起第22至51位所示的正向引物28F1、序列83自5’末端起第22至49位所示的正向引物28F2和序列84所示的反向引物28R组成。所述引物组29可由序列85自5’末端起第22至51位所示的正向引物29F1、序列86自5’末端起第22至51位所示的正向引物29F2和序列87所示的反向引物29R组成。所述引物组30可由序列88自5’末端起第22至46位所示的正向引物30F1、序列89自5’末端起第22至47位所示的正向引物30F2和序列90所示的反向引物30R组成。所述引物组31可由序列91自5’末端起第22至51位所示的正向引物31F1、序列92自5’末端起第22至49位所示的正向引物31F2和序列93所示的反向引物31R组成。所述引物组32可由序列94自5’末端起第22至54位所示的正向引物32F1、序列95自5’末端起第22至54位所示的正向引物32F2和序列96所示的反向引物32R组成。

上述任一所述引物组中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。

上述任一所述SNP引物组合具体可由所述引物组1、所述引物组2、所述引物组3、所述引物组4、所述引物组5、所述引物组6、所述引物组7、所述引物组8、所述引物组9、所述引物组10、所述引物组11、所述引物组12、所述引物组13、所述引物组14、所述引物组15、所述引物组16、所述引物组17、所述引物组18、所述引物组19、所述引物组20、所述引物组21、所述引物组22、所述引物组23、所述引物组24、所述引物组25、所述引物组26、所述引物组27、所述引物组28、所述引物组29、所述引物组30、所述引物组31和所述引物组32组成。

上文中，序列表中序列1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即FAM荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。序列表中序列2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即HEX荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。

含有上述任一所述SNP引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为x3)或x4)：x3)鉴定西瓜品种；x4)鉴别西瓜品种真伪性。

上述任一所述SNP位点组合或上述任一所述SNP引物组合的应用，可为x1)至x4)中的任一种：x1)制备用于鉴定西瓜品种的试剂盒；x2)制备用于鉴别西瓜品种真伪性的试剂盒；x3)鉴定西瓜品种；x4)鉴别西瓜品种真伪性。

本发明还保护一种鉴定待测西瓜属于214个西瓜品种中哪个品种的方法，可包括如下步骤：分别检测待测西瓜和214个西瓜品种基于所述32个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测西瓜基于所述32个SNP位点的基因型和214个西瓜品种中某品种基于所述32个SNP位点的基因型完全一致，则待测西瓜与该西瓜品种属于同一个品种；如果待测西瓜基于所述32个SNP位点的基因型和214个西瓜品种中各个品种基于所述32个SNP位点的基因型均不一致，则待测西瓜与214个西瓜品种的品种均不相同。

上述方法中，所述“检测待测西瓜和214个西瓜品种基于所述32个SNP位点的基因型”的步骤可如下：

(1)分别以待测西瓜的基因组DNA和214个西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述SNP引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测西瓜和214个西瓜品种基于所述32个SNP位点的基因型。

上述方法中，所述“检测检测待测西瓜和214个西瓜品种基于所述32个SNP位点的基因型”的步骤可如下：

(1)分别以待测西瓜的基因组DNA和214个西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述SNP引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；

(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测西瓜和214个西瓜品种基于所述32个SNP位点的基因型。

本发明还保护一种鉴定待测西瓜属于214个西瓜品种中哪个品种的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测西瓜的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述SNP引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准西瓜品种群中的各个西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述SNP引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准西瓜品种群由214个西瓜品种组成；

(2)将待测西瓜得到的各个PCR扩增产物与每个标准西瓜品种对应的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测西瓜与哪个标准西瓜品种为同一类，该待测西瓜与该标准西瓜品种即属于同一个品种。

上述任一所述的方法中，214个西瓜品种可为8424、墨玉二号、平优5号、极品京欣、新机遇、郑抗无籽四号、绿凤凰、绿圆095、华雷一号、美欣101、金宝、申选958、农科大11号、北农天骄4号、华欣-8、冬喜2号、盈克、泰科翠宝3号、绿龙788、圣女红3号、黄晶、佳美1号、美惠、胜欣、勇凤1号、羞月4号、航兴1号、莎蜜佳一号、航兴1号母本、航兴1号父本、红小玉、黄小玉、喜春、申蜜968、京秀、中兴红1号、婉悦一号、国凤、中选12号、春雷、京欣1号、羞月6号、航兴三号、航兴三号母本、航兴三号父本、众天6211、景欣2号、早春翠玉、景龙宝、黑美人、嘉华、永丰1号、艺甜2号、京欣3号、RN-35A、京欣2号、甜王三号、京欣4号、庆发十二号、创研红元帅、WW150、红小帅、创研龙旋风、天海宏丰、天海宏丰父本、甜宝小无籽、创研金砂王、W14039、国蜜二号、美都、天泉、佳丽、绿之秀、雪峰新二号、黄晶一号、京嘉2号、世农真美、京美、香秀、龙盛佳甜、农科大3号、昂达甜王、雪峰小玉7号、甬蜜3号、美秀、甬蜜2号、圣女红2号、龙盛佳美、春红玉、京抗2号、RX2、甜蜜蜜、京欣8号、长佳、宝凤、羞月、北农豪杰、福运来母本、福运来父本、红富士、瑞鑫、暑宝、北农天骄、冬喜3号、蜜童、暑宝(无籽)、黑蛮2号、欣祥1号、黑宝2号、暑宝6号、黑巨冠、春秀、春秀母本、春秀父本、暑宝六号、航兴天秀2号、瑞福、瑞宏、北农福田、中京1号、富莱特、金冠一号、超越梦想、佳美、京冠一号F1、北农世嘉、凯瑞达、华欣-228-D、京玲、安琪儿、国蜜一号、黑晶、(901)4-1-1-M、金帅2号、中联58、中联黑将军、农科大10号、京雪、泰科翠宝2号、京抗二号、欣锐、京珑、朝霞、抗病将军、京阑、京颖、华欣2号、林籽大片88708、金宝、红小帅6号、北农锦绣、北农天骄2号、大农、雷克、珍奇、众天红、夏橙、豫西瓜八号、林籽一号、金星、金城王子？、圣女红二号、华耐0901、农科大6号、金花1号、西农八号、绿宝518、美丰、丰乐秀华、火洲三号、丰乐玉玲珑、荃R701、丰乐黑宝公、丰乐无籽三号、时代、新星、苏蜜6号、申抗988、黑珍珠、陇抗9号、嘉抗蜜宝、京欣一号、旺嘉欣兰、丰甜花冠、浙蜜3号、秀妃、新金兰、金玉玲珑、旺嘉福春、嘉新、新一号、双星99K、京欣父、寿菜XG1号、京欣二号、世纪、秀色、硬京欣、甜王7号、众天5318、京嘉、京凤6号、金妈妈九号、玉麒麟、国秀、苏蜜8号、卫星2号、秀雅、格美、郑抗三号、羞月5号、特小凤、黄凤凰和博丽一号。。

上述任一所述的方法中，“分别采用上述任一所述SNP引物组合中引物组的进行PCR扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

本发明建立了基于高通量测序鉴定西瓜品种真实性的DNA指纹数据库，可用于对西瓜品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为西瓜种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知西瓜品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1为建立在32个SNP引物组上的214个供试西瓜品种的聚类图。

图2为SNP标记个数(即SNP位点个数)与区分214个供试西瓜品种的关系图。

图3为32个引物组在部分供试西瓜品种中的SNP分型效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于鉴定西瓜品种真实性的引物组合的获得

一、32个SNP位点的发现

本发明基于17份西瓜代表资源的重测序数据，获得32个SNP位点。这17份西瓜资源类型丰富，涵盖东亚型(6份)、美洲型(5份)及野生型(6份)，基本包括了西瓜主要的生态类型，在生育期、果形、果皮厚度、瓤色、种子大小、含糖量等农艺性状方面具有较高的遗传多样性，具备西瓜种质的代表性。

具体的，SNP位点的筛选标准如下：在全基因组范围内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、MAF>0.3、PCA聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SNP)的SNP位点。

32个SNP位点的基本信息详见表1中第1至4列。其中SNP位点在染色体上的位置是基于西瓜97103参考基因组序列比对确定的，所述西瓜97103参考基因组序列的版本号为V1(下载地址为：ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/watermelon/97103/v1/)。

表1. 32个SNP位点的基本信息

二、用于鉴定西瓜品种真实性的引物组合的获得

根据步骤一发现的32个SNP位点，开发出具有较高的多态性信息量(PIC值)(见表1中第5列)且适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定西瓜品种真实性的引物组合。

SNP引物组合由32个引物组组成，每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。32个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。

表2. 32个引物组的名称及核苷酸序列

注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。

实施例2、实施例1开发的引物组合的有效性检验

本实施例中的214个供试西瓜品种的基本信息见表3。214个供试西瓜品种均为常见的优良品种或部分国外引进品种。

表3. 214个供试西瓜品种的基本信息

1、供试西瓜品种的基因组DNA的获得

采用CTAB法分别提取214个供试西瓜品种的叶片(混取30粒种子的真叶)的基因组DNA，得到供试西瓜品种的基因组DNA。

供试西瓜品种的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试西瓜品种的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。

2、分别以214个供试西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用32个引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的浓度比为2:2:5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。

3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断214个供试西瓜品种基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试西瓜品种基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试西瓜品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试西瓜品种基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试西瓜品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试西瓜品种基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试西瓜品种基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

部分结果见图3。结果表明，各个引物组在供试西瓜品种中可以得到很好的分型效果。

4、聚类分析

根据214个供试西瓜品种基于32个SNP位点的基因型，利用MiniMarker和MEGA7软件对214个供试西瓜品种进行聚类分析。

建立在32个引物组上的214个供试西瓜品种的聚类图如图1所示。结果表明，32个引物组可以完全区分表3中的214个供试西瓜品种。由此可见，实施例1开发的SNP引物组合可以应用于西瓜品种DNA指纹数据库构建和品种真实性鉴定。

5、效率评价

品种真实性鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。本发明的发明人比较了SNP标记个数(即引物组数)与区分214个供试西瓜品种区分率的关系。

实验结果表明(图2)，32个引物组(即32个SNP标记个数)在214个供试西瓜品种中的区分率达到100％。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鉴定西瓜品种真实性的方法及其专用SNP引物组合

<160> 96

<170> PatentIn version 3.5

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<223>

<400> 56

gaaggtcgga gtcaacggat ttcccaatac tcatagctgg gaaac 45

<210> 57

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 57

gctgagatga agaaataatt tctggagaaa t 31

<210> 58

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 58

gaaggtgacc aagttcatgc ttcagtgtct aatgttttgg ctcagg 46

<210> 59

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 59

gaaggtcgga gtcaacggat ttcagtgtct aatgttttgg ctcagc 46

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 60

ctccctctca aataacgagt agtggaa 27

<210> 61

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 61

gaaggtgacc aagttcatgc tttctttgcg agctccacga acttt 45

<210> 62

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 62

gaaggtcgga gtcaacggat tctttgcgag ctccacgaac ttc 43

<210> 63

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 63

ggaacttgca gagaaaaatg gaagaagaa 29

<210> 64

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 64

gaaggtgacc aagttcatgc ttgctatatt tgcaattctt tctaaatgtt gc 52

<210> 65

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 65

gaaggtcgga gtcaacggat ttttgctata tttgcaattc tttctaaatg ttgt 54

<210> 66

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 66

tgtatagcac tttaggctaa taattaggta tata 34

<210> 67

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 67

gaaggtgacc aagttcatgc tgagacctta tggaggatgc aaga 44

<210> 68

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 68

gaaggtcgga gtcaacggat tagaccttat ggaggatgca agg 43

<210> 69

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 69

cttcagtcat ttgaacgcac caattgat 28

<210> 70

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 70

gaaggtgacc aagttcatgc taatcgaaaa actccaggca tacttaag 48

<210> 71

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 71

gaaggtcgga gtcaacggat tcaatcgaaa aactccaggc atacttaaa 49

<210> 72

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 72

atataatgta cctcccaaga aagtatctgt a 31

<210> 73

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 73

gaaggtgacc aagttcatgc tcacctatag atatcactca ccctcat 47

<210> 74

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 74

gaaggtcgga gtcaacggat tacctataga tatcactcac cctcac 46

<210> 75

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 75

ccatttggac attagtgtca gacccat 27

<210> 76

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 76

gaaggtgacc aagttcatgc tagatgagat tggagaagta gaaacattta a 51

<210> 77

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 77

gaaggtcgga gtcaacggat tgatgagatt ggagaagtag aaacatttac 50

<210> 78

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 78

atttccaatc caacgaatct ctattcattt taaa 34

<210> 79

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 79

gaaggtgacc aagttcatgc tcacgaatcg agcaaatgaa gttgaatt 48

<210> 80

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 80

gaaggtcgga gtcaacggat tacgaatcga gcaaatgaag ttgaatc 47

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 81

gcagccttga tagctctctc caatt 25

<210> 82

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 82

gaaggtgacc aagttcatgc tataactata ataaactcaa caccccaaac a 51

<210> 83

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 83

gaaggtcgga gtcaacggat taactataat aaactcaaca ccccaaacg 49

<210> 84

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 84

atgttttgct atagtaccac tatttacaat ttaaa 35

<210> 85

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 85

gaaggtgacc aagttcatgc taaattttcg tattttctat ccctatgtgc a 51

<210> 86

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 86

gaaggtcgga gtcaacggat taaattttcg tattttctat ccctatgtgc t 51

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 87

cttagcttct gatcctcaaa gataaggtta 30

<210> 88

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 88

gaaggtgacc aagttcatgc tactgacgtt cttcgattgt ttctcg 46

<210> 89

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 89

gaaggtcgga gtcaacggat tcactgacgt tcttcgattg tttctca 47

<210> 90

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 90

atgacccacc cggcagcaga aa 22

<210> 91

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 91

gaaggtgacc aagttcatgc tatagagccc tattttcaga atttgtacta t 51

<210> 92

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 92

gaaggtcgga gtcaacggat tagagcccta ttttcagaat ttgtactag 49

<210> 93

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 93

ctttgttgga aataatttag tctcttgttg caa 33

<210> 94

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 94

gaaggtgacc aagttcatgc tacgattcaa aagaaatcaa gtaaataact tttg 54

<210> 95

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 95

gaaggtcgga gtcaacggat tacgattcaa aagaaatcaa gtaaataact tttc 54

<210> 96

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 96

caagtagttg aaggctaaat accatcgaa 29

序列表

1

Claims (7)

1.引物组合甲，包括引物组1—引物组32；

所述引物组1由序列1所示的正向引物01F1、序列2所示的正向引物01F2和序列3所示的反向引物01R组成；所述引物组2由序列4所示的正向引物02F1、序列5所示的正向引物02F2和序列6所示的反向引物02R组成；所述引物组3由序列7所示的正向引物03F1、序列8所示的正向引物03F2和序列9所示的反向引物03R组成；所述引物组4由序列10所示的正向引物04F1、序列11所示的正向引物04F2和序列12所示的反向引物04R组成；所述引物组5由序列13所示的正向引物05F1、序列14所示的正向引物05F2和序列15所示的反向引物05R组成；所述引物组6由序列16所示的正向引物06F1、序列17所示的正向引物06F2和序列18所示的反向引物06R组成；所述引物组7由序列19所示的正向引物07F1、序列20所示的正向引物07F2和序列21所示的反向引物07R组成；所述引物组8由序列22所示的正向引物08F1、序列23所示的正向引物08F2和序列24所示的反向引物08R组成；所述引物组9由序列25所示的正向引物09F1、序列26所示的正向引物09F2和序列27所示的反向引物09R组成；所述引物组10由序列28所示的正向引物10F1、序列29所示的正向引物10F2和序列30所示的反向引物10R组成；所述引物组11由序列31所示的正向引物11F1、序列32所示的正向引物11F2和序列33所示的反向引物11R组成；所述引物组12由序列34所示的正向引物12F1、序列35所示的正向引物12F2和序列36所示的反向引物12R组成；所述引物组13由序列37所示的正向引物13F1、序列38所示的正向引物13F2和序列39所示的反向引物13R组成；所述引物组14由序列40所示的正向引物14F1、序列41所示的正向引物14F2和序列42所示的反向引物14R组成；所述引物组15由序列43所示的正向引物15F1、序列44所示的正向引物15F2和序列45所示的反向引物15R组成；所述引物组16由序列46所示的正向引物16F1、序列47所示的正向引物16F2和序列48所示的反向引物16R组成；所述引物组17由序列49所示的正向引物17F1、序列50所示的正向引物17F2和序列51所示的反向引物17R组成；所述引物组18由序列52所示的正向引物18F1、序列53所示的正向引物18F2和序列54所示的反向引物18R组成；所述引物组19由序列55所示的正向引物19F1、序列56所示的正向引物19F2和序列57所示的反向引物19R组成；所述引物组20由序列58所示的正向引物20F1、序列59所示的正向引物20F2和序列60所示的反向引物20R组成；所述引物组21由序列61所示的正向引物21F1、序列62所示的正向引物21F2和序列63所示的反向引物21R组成；所述引物组22由序列64所示的正向引物22F1、序列65所示的正向引物22F2和序列66所示的反向引物22R组成；所述引物组23由序列67所示的正向引物23F1、序列68所示的正向引物23F2和序列69所示的反向引物23R组成；所述引物组24由序列70所示的正向引物24F1、序列71所示的正向引物24F2和序列72所示的反向引物24R组成；所述引物组25由序列73所示的正向引物25F1、序列74所示的正向引物25F2和序列75所示的反向引物25R组成；所述引物组26由序列76所示的正向引物26F1、序列77所示的正向引物26F2和序列78所示的反向引物26R组成；所述引物组27由序列79所示的正向引物27F1、序列80所示的正向引物27F2和序列81所示的反向引物27R组成；所述引物组28由序列82所示的正向引物28F1、序列83所示的正向引物28F2和序列84所示的反向引物28R组成；所述引物组29由序列85所示的正向引物29F1、序列86所示的正向引物29F2和序列87所示的反向引物29R组成；所述引物组30由序列88所示的正向引物30F1、序列89所示的正向引物30F2和序列90所示的反向引物30R组成；所述引物组31由序列91所示的正向引物31F1、序列92所示的正向引物31F2和序列93所示的反向引物31R 组成；所述引物组32由序列94所示的正向引物32F1、序列95所示的正向引物32F2和序列96所示的反向引物32R组成。

2.引物组合乙，包括引物组1—引物组32；

所述引物组1由序列1自5’末端起第22至44位所示的正向引物01F1、序列2自5’末端起第22至46位所示的正向引物01F2和序列3所示的反向引物01R组成；所述引物组2由序列4自5’末端起第22至46位所示的正向引物02F1、序列5自5’末端起第22至46位所示的正向引物02F2和序列6所示的反向引物02R组成；所述引物组3由序列7自5’末端起第22至52位所示的正向引物03F1、序列8自5’末端起第22至54位所示的正向引物03F2和序列9所示的反向引物03R组成；所述引物组4由序列10自5’末端起第22至49位所示的正向引物04F1、序列11自5’末端起第22至49位所示的正向引物04F2和序列12所示的反向引物04R组成；所述引物组5由序列13自5’末端起第22至48位所示的正向引物05F1、序列14自5’末端起第22至47位所示的正向引物05F2和序列15所示的反向引物05R组成；所述引物组6由序列16自5’末端起第22至50位所示的正向引物06F1、序列17自5’末端起第22至51位所示的正向引物06F2和序列18所示的反向引物06R组成；所述引物组7由序列19自5’末端起第22至45位所示的正向引物07F1、序列20自5’末端起第22至46位所示的正向引物07F2和序列21所示的反向引物07R组成；所述引物组8由序列22自5’末端起第22至57位所示的正向引物08F1、序列23自5’末端起第22至56位所示的正向引物08F2和序列24所示的反向引物08R组成；所述引物组9由序列25自5’末端起第22至49位所示的正向引物09F1、序列26自5’末端起第22至49位所示的正向引物09F2和序列27所示的反向引物09R组成；所述引物组10由序列28自5’末端起第22至46位所示的正向引物10F1、序列29自5’末端起第22至48位所示的正向引物10F2和序列30所示的反向引物10R组成；所述引物组11由序列31自5’末端起第22至47位所示的正向引物11F1、序列32自5’末端起第22至46位所示的正向引物11F2和序列33所示的反向引物11R组成；所述引物组12由序列34自5’末端起第22至49位所示的正向引物12F1、序列35自5’末端起第22至49位所示的正向引物12F2和序列36所示的反向引物12R组成；所述引物组13由序列37自5’末端起第22至53位所示的正向引物13F1、序列38自5’末端起第22至54位所示的正向引物13F2和序列39所示的反向引物13R组成；所述引物组14由序列40自5’末端起第22至53位所示的正向引物14F1、序列41自5’末端起第22至53位所示的正向引物14F2和序列42所示的反向引物14R组成；所述引物组15由序列43自5’末端起第22至49位所示的正向引物15F1、序列44自5’末端起第22至49位所示的正向引物15F2和序列45所示的反向引物15R组成；所述引物组16由序列46自5’末端起第22至48位所示的正向引物16F1、序列47自5’末端起第22至49位所示的正向引物16F2和序列48所示的反向引物16R组成；所述引物组17由序列49自5’末端起第22至52位所示的正向引物17F1、序列50自5’末端起第22至54位所示的正向引物17F2和序列51所示的反向引物17R组成；所述引物组18由序列52自5’末端起第22至48位所示的正向引物18F1、序列53自5’末端起第22至47位所示的正向引物18F2和序列54所示的反向引物18R组成；所述引物组19由序列55自5’末端起第22至46位所示的正向引物19F1、序列56自5’末端起第22至45位所示的正向引物19F2和序列57所示的反向引物19R组成；所述引物组20由序列58自5’末端起第22至46位所示的正向引物20F1、序列59自5’末端起第22至46位所示的正向引物20F2和序列60所示的反向引物20R组成；所述引物组21由序列61自5’末端起第22至45位所示的正向引物21F1、序列62自5’末端起第22至43位所示的正向引物21F2和序列63所示的反向引物21R组成；所述引物组22由序列64自5’末端起第22至52位所示的正向引物22F1、序列65自5’末端起第22至54位所示的正向引物22F2和序列66所示的反向引物22R组成；所述引物组23由序列67自5’末端起第22至44位所示的正向引物23F1、序列68自5’末端起第22至43位所示的正向引物23F2和序列69所示的反向引物23R组成；所述引物组24由序列70自5’末端起第22至48位所示的正向引物24F1、序列71自5’末端起第22至49位所示的正向引物24F2和序列72所示的反向引物24R组成；所述引物组25由序列73自5’末端起第22至47位所示的正向引物25F1、序列74自5’末端起第22至46位所示的正向引物25F2和序列75所示的反向引物25R组成；所述引物组26由序列76自5’末端起第22至51位所示的正向引物26F1、序列77自5’末端起第22至50位所示的正向引物26F2和序列78所示的反向引物26R组成；所述引物组27由序列79自5’末端起第22至48位所示的正向引物27F1、序列80自5’末端起第22至47位所示的正向引物27F2和序列81所示的反向引物27R组成；所述引物组28由序列82自5’末端起第22至51位所示的正向引物28F1、序列83自5’末端起第22至49位所示的正向引物28F2和序列84所示的反向引物28R组成；所述引物组29由序列85自5’末端起第22至51位所示的正向引物29F1、序列86自5’末端起第22至51位所示的正向引物29F2和序列87所示的反向引物29R组成；所述引物组30由序列88自5’末端起第22至46位所示的正向引物30F1、序列89自5’末端起第22至47位所示的正向引物30F2和序列90所示的反向引物30R组成；所述引物组31由序列91自5’末端起第22至51位所示的正向引物31F1、序列92自5’末端起第22至49位所示的正向引物31F2和序列93所示的反向引物31R组成；所述引物组32由序列94自5’末端起第22至54位所示的正向引物32F1、序列95自5’末端起第22至54位所示的正向引物32F2和序列96所示的反向引物32R组成。

3.权利要求1所述引物组合甲或权利要求2所述引物组合乙的应用，为x1)至x4)中的任一种：x1)制备用于鉴定214个西瓜品种的试剂盒；x2)制备用于鉴别214个西瓜品种真伪性的试剂盒；x3)鉴定214个西瓜品种；x4)鉴别214个西瓜品种真伪性；

所述214个西瓜品种为8424、墨玉二号、平优5号、极品京欣、新机遇、郑抗无籽四号、绿凤凰、绿圆095、华雷一号、美欣101、金宝、申选958、农科大11号、北农天骄4号、华欣-8、冬喜2号、盈克、泰科翠宝3号、绿龙788、圣女红3号、黄晶、佳美1号、美惠、胜欣、勇凤1号、羞月4号、航兴1号、莎蜜佳一号、航兴1号母本、航兴1号父本、红小玉、黄小玉、喜春、申蜜968、京秀、中兴红1号、婉悦一号、国凤、中选12号、春雷、京欣1号、羞月6号、航兴三号、航兴三号母本、航兴三号父本、众天6211、景欣2号、早春翠玉、景龙宝、黑美人、嘉华、永丰1号、艺甜2号、京欣3号、RN-35A、京欣2号、甜王三号、京欣4号、庆发十二号、创研红元帅、WW150、红小帅、创研龙旋风、天海宏丰、天海宏丰父本、甜宝小无籽、创研金砂王、W14039、国蜜二号、美都、天泉、佳丽、绿之秀、雪峰新二号、黄晶一号、京嘉2号、世农真美、京美、香秀、龙盛佳甜、农科大3号、昂达甜王、雪峰小玉7号、甬蜜3号、美秀、甬蜜2号、圣女红2号、龙盛佳美、春红玉、京抗2号、RX2、甜蜜蜜、京欣8号、长佳、宝凤、羞月、北农豪杰、福运来母本、福运来父本、红富士、瑞鑫、暑宝、北农天骄、冬喜3号、蜜童、暑宝(无籽)、黑蛮2号、欣祥1号、黑宝2号、暑宝6号、黑巨冠、春秀、春秀母本、春秀父本、暑宝六号、航兴天秀2号、瑞福、瑞宏、北农福田、中京1号、富莱特、金冠一号、超越梦想、佳美、京冠一号F1、北农世嘉、凯瑞达、华欣-228-D、京玲、安琪儿、国蜜一号、黑晶、(901)4-1-1-M、金帅2号、中联58、中联黑将军、农科大10号、京雪、泰科翠宝2号、京抗二号、欣锐、京珑、朝霞、抗病将军、京阑、京颖、华欣2号、林籽大片88708、红小帅6号、北农锦绣、北农天骄2号、大农、雷克、珍奇、众天红、夏橙、豫西瓜八号、林籽一号、金星、金城王子、圣女红二号、华耐0901、农科大6号、金花1号、西农八号、绿宝518、美丰、丰乐秀华、火洲三号、丰乐玉玲珑、荃R701、丰乐黑宝公、丰乐无籽三号、时代、新星、苏蜜6号、申抗988、黑珍珠、陇抗9号、嘉抗蜜宝、京欣一号、旺嘉欣兰、丰甜花冠、浙蜜3号、秀妃、新金兰、金玉玲珑、旺嘉福春、嘉新、新一号、双星99K、京欣父、寿菜XG1号、京欣二号、世纪、秀色、硬京欣、甜王7号、众天5318、京嘉、京凤6号、金妈妈九号、玉麒麟、国秀、苏蜜8号、卫星2号、秀雅、格美、郑抗三号、羞月5号、特小凤、黄凤凰和博丽一号。

4.一种鉴定待测西瓜属于权利要求3中所述214个西瓜品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：分别检测待测西瓜和214个西瓜品种基于32个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测西瓜基于32个SNP位点的基因型和214个西瓜品种中某品种基于32个SNP位点的基因型完全一致，则待测西瓜与该西瓜品种属于同一个品种；如果待测西瓜基于32个SNP位点的基因型和214个西瓜品种中各个品种基于32个SNP位点的基因型均不一致，则待测西瓜与214个西瓜品种的品种均不相同；

32个SNP位点如下：WmSNP01位点为1号染色体上的第1122位核苷酸；WmSNP02位点为1号染色体上的第10817435位核苷酸；WmSNP03位点为1号染色体上的第21348158位核苷酸；WmSNP04位点为2号染色体上的第2127559位核苷酸；WmSNP05位点为2号染色体上的第4230860位核苷酸；WmSNP06位点为2号染色体上的第20693304位核苷酸；WmSNP07位点为2号染色体上的第29349735位核苷酸；WmSNP08位点为3号染色体上的第1709047位核苷酸；WmSNP09位点为3号染色体上的第11005823位核苷酸；WmSNP10位点为3号染色体上的第12844014位核苷酸；WmSNP11位点为3号染色体上的第18643310位核苷酸；WmSNP12位点为3号染色体上的第22502999位核苷酸；WmSNP13位点为4号染色体上的第2957012位核苷酸；WmSNP14位点为4号染色体上的第5681783位核苷酸；WmSNP15位点为4号染色体上的第16905245位核苷酸；WmSNP16位点为5号染色体上的第340755位核苷酸；WmSNP17位点为5号染色体上的第15995147位核苷酸；WmSNP18位点为6号染色体上的第13390860位核苷酸；WmSNP19位点为6号染色体上的第17247806位核苷酸；WmSNP20位点为7号染色体上的第5566096位核苷酸；WmSNP21位点为7号染色体上的第7476047位核苷酸；WmSNP22位点为7号染色体上的第29615402位核苷酸；WmSNP23位点为8号染色体上的第8744123位核苷酸；WmSNP24位点为8号染色体上的第16953730位核苷酸；WmSNP25位点为9号染色体上的第2062377位核苷酸；WmSNP26位点为9号染色体上的第17645415位核苷酸；WmSNP27位点为10号染色体上的第381513位核苷酸；WmSNP28位点为10号染色体上的第3501753位核苷酸；WmSNP29位点为10号染色体上的第10725827位核苷酸；WmSNP30位点为11号染色体上的第7776633位核苷酸；WmSNP31位点为11号染色体上的第10129918位核苷酸；WmSNP32位点为11号染色体上的第21777635位核苷酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述“检测待测西瓜和214个西瓜品种基于32个SNP位点的基因型”的步骤如下：

(1)分别以待测西瓜的基因组DNA和214个西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合甲中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测西瓜和214个西瓜品种基于32个SNP位点的基因型。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述“检测待测西瓜和214个西瓜品种基于32个SNP位点的基因型”的步骤如下：

(1)分别以待测西瓜的基因组DNA和214个西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；

(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测西瓜和214个西瓜品种基于32个SNP位点的基因型。

7.一种鉴定待测西瓜属于权利要求3中所述214个西瓜品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：

(1)以待测西瓜的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准西瓜品种群中的各个西瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准西瓜品种群由214个西瓜品种组成；

(2)将待测西瓜得到的各个PCR扩增产物与每个标准西瓜品种对应的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测西瓜与哪个标准西瓜品种为同一类，该待测西瓜与该标准西瓜品种即属于同一个品种。

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