CN112143828B - 一种鉴定待测甘蓝属于哪个甘蓝品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定待测甘蓝属于哪个甘蓝品种的方法。该方法包括如下步骤：分别检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测甘蓝基于32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中某品种完全一致，则待测甘蓝与该甘蓝品种属于同一个品种。本发明提供的方法可用于对甘蓝品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为甘蓝种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知甘蓝品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种鉴定待测甘蓝属于哪个甘蓝品种的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定待测甘蓝属于哪个甘蓝品种的方法，即鉴定待测甘蓝属于76个甘蓝品种(表3所示)中哪个品种的方法，该方法可应用于生物技术推广服务，为甘蓝种质资源和品种保护提供技术支持。
背景技术
甘蓝为十字花科、芸薹属的一年生或两年生草本植物，甘蓝具有耐寒、抗病、适应性强、易贮耐运、产量高、品质好等特点，在中国各地栽培，作蔬菜及饲料用。结球甘蓝是我国东北、西北、华北等地区春、夏、秋季的主要蔬菜之一，年种植面积约40万公顷，占全国蔬菜栽培面积的25％。甘蓝产业的发展为实现农民增收和提高居民的生活水平发挥了重要作用。依据《非主要农作物品种登记办法》，2017年4月农业部公布了第一批非主要农作物品种登记目录，甘蓝位列其中。但各省市之间品种审定不能及时沟通和协调，导致甘蓝的品种等级管理未能有效跟进。甘蓝育种企业比较分散，存在较多假冒伪劣品种，其中多为衍生、派生近似品种。加之良种生产基地管理不严，盗育、套购品种、同名异种现象频频出现，种子生产质量事故时有发生。根据《非主要农作物品种登记指南》的要求，品种特性说明和品种DUS测试报告中涉及的有关性状如有明确关联基因，可以直接提交DNA检测结果。因此，建立一套基于DNA指纹有效进行甘蓝品种真实性鉴定的标准显得尤为重要。
近年来，SNP作为第三代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着测序技术的发展和测序成本的降低，获得大量甘蓝重测序数据。基于分析甘蓝的变异组信息，可以挖掘更加稳定高效的SNP位点。采用等位基因竞争性特异PCR法，可以开发其特异性引物，最终获得样本在SNP位点的基因型。
目前，我国还没有专用于甘蓝品种鉴定的DNA分子标记方法。目前，其它作物多采用SSR分子标记，但是SSR检测方式极易导致不真实、假阳性、假阴性结果；不能适应自动化、高通量、大规模的要求。与SSR标记相比，SNP具有多个方面的优势：变异清晰稳定容易检测，真实性准确性高；每个作物均有数以百万计SNP可供选择；适宜于高通量、低成本、自动化快速检测；SNP分型无需对照品种，以准确的碱基呈现结果，可减少人为误差。
发明内容
本发明的目的是鉴定甘蓝品种，尤其是76个甘蓝品种。
本发明首先保护SNP位点组合，可包括甘蓝基因组的32个SNP位点；所述32个SNP位点如下：BoSNP002位点为C1号染色体上的第296793位核苷酸；BoSNP007位点为C1号染色体上的第12611358位核苷酸；BoSNP016位点为C1号染色体上的第33551451位核苷酸；BoSNP021位点为C2号染色体上的第3113051位核苷酸；BoSNP028位点为C2号染色体上的第24698163位核苷酸；BoSNP033位点为C2号染色体上的第38326491位核苷酸；BoSNP037位点为C2号染色体上的第47456879位核苷酸；BoSNP041位点为C3号染色体上的第868203位核苷酸；BoSNP047位点为C3号染色体上的第23728120位核苷酸；BoSNP052位点为C3号染色体上的第36143953位核苷酸；BoSNP059位点为C3号染色体上的第64930308位核苷酸；BoSNP060位点为C4号染色体上的第2841333位核苷酸；BoSNP062位点为C4号染色体上的第10298943位核苷酸；BoSNP075位点为C4号染色体上的第37791656位核苷酸；BoSNP076位点为C4号染色体上的第48134351位核苷酸；BoSNP091位点为C5号染色体上的第13820140位核苷酸；BoSNP101位点为C5号染色体上的第39273578位核苷酸；BoSNP105位点为C5号染色体上的第44036189位核苷酸；BoSNP106位点为C6号染色体上的第8309925位核苷酸；BoSNP110位点为C6号染色体上的第14463074位核苷酸；BoSNP114位点为C6号染色体上的第26140487位核苷酸；BoSNP118位点为C6号染色体上的第39738795位核苷酸；BoSNP119位点为C7号染色体上的第158286位核苷酸；BoSNP123位点为C7号染色体上的第5806434位核苷酸；BoSNP131位点为C7号染色体上的第29393856位核苷酸；BoSNP143位点为C8号染色体上的第560414位核苷酸；BoSNP148位点为C8号染色体上的第19862942位核苷酸；BoSNP162位点为C8号染色体上的第41500954位核苷酸；BoSNP163位点为C9号染色体上的第2044009位核苷酸；BoSNP169位点为C9号染色体上的第13219893位核苷酸；BoSNP171位点为C9号染色体上的第35448451位核苷酸；BoSNP177位点为C9号染色体上的第49443403位核苷酸。
所述SNP位点组合具体可由上述32个SNP位点组成。
本发明还保护引物组合，可包括用于扩增所述BoSNP002位点的引物组1、用于扩增所述BoSNP007位点的引物组2、用于扩增所述BoSNP016位点的引物组3、用于扩增所述BoSNP021位点的引物组4、用于扩增所述BoSNP028位点的引物组5、用于扩增所述BoSNP033位点的引物组6、用于扩增所述BoSNP037位点的引物组7、用于扩增所述BoSNP041位点的引物组8、用于扩增所述BoSNP047位点的引物组9、用于扩增所述BoSNP052位点的引物组10、用于扩增所述BoSNP059位点的引物组11、用于扩增所述BoSNP060位点的引物组12、用于扩增所述BoSNP062位点的引物组13、用于扩增所述BoSNP075位点的引物组14、用于扩增所述BoSNP076位点的引物组15、用于扩增所述BoSNP091位点的引物组16、用于扩增所述BoSNP101位点的引物组17、用于扩增所述BoSNP105位点的引物组18、用于扩增所述BoSNP106位点的引物组19、用于扩增所述BoSNP110位点的引物组20、用于扩增所述BoSNP114位点的引物组21、用于扩增所述BoSNP118位点的引物组22、用于扩增所述BoSNP119位点的引物组23、用于扩增所述BoSNP123位点的引物组24、用于扩增所述BoSNP131位点的引物组25、用于扩增所述BoSNP143位点的引物组26、用于扩增所述BoSNP148位点的引物组27、用于扩增所述BoSNP162位点的引物组28、用于扩增所述BoSNP163位点的引物组29、用于扩增所述BoSNP169位点的引物组30、用于扩增所述BoSNP171位点的引物组31和用于扩增所述BoSNP177位点的引物组32。
所述引物组合中，所述引物组1可由SEQ ID NO:1所示的正向引物01F1、SEQ IDNO:2所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成。所述引物组2可由SEQID NO:4所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成。所述引物组3可由SEQ ID NO:7所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成。所述引物组4可由SEQ ID NO:10所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成。所述引物组5可由SEQ ID NO:13所示的正向引物05F1、SEQ ID NO:14所示的正向引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成。所述引物组6可由SEQ ID NO:16所示的正向引物06F1、SEQ ID NO:17所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组成。所述引物组7可由SEQ ID NO:19所示的正向引物07F1、SEQ ID NO:20所示的正向引物07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成。所述引物组8可由SEQ ID NO:22所示的正向引物08F1、SEQ ID NO:23所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成。所述引物组9可由SEQ ID NO:25所示的正向引物09F1、SEQ ID NO:26所示的正向引物09F2和SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成。所述引物组10可由SEQ ID NO:28所示的正向引物10F1、SEQ ID NO:29所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成。所述引物组11可由SEQ ID NO:31所示的正向引物11F1、SEQ ID NO:32所示的正向引物11F2和SEQID NO:33所示的反向引物11R组成。所述引物组12可由SEQ ID NO:34所示的正向引物12F1、SEQ ID NO:35所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成。所述引物组13可由SEQ ID NO:37所示的正向引物13F1、SEQ ID NO:38所示的正向引物13F2和SEQ IDNO:39所示的反向引物13R组成。所述引物组14可由SEQ ID NO:40所示的正向引物14F1、SEQID NO:41所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成。所述引物组15可由SEQ ID NO:43所示的正向引物15F1、SEQ ID NO:44所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45所示的反向引物15R组成。所述引物组16可由SEQ ID NO:46所示的正向引物16F1、SEQ IDNO:47所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成。所述引物组17可由SEQ ID NO:49所示的正向引物17F1、SEQ ID NO:50所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所示的反向引物17R组成。所述引物组18可由SEQ ID NO:52所示的正向引物18F1、SEQ ID NO:53所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成。所述引物组19可由SEQID NO:55所示的正向引物19F1、SEQ ID NO:56所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的反向引物19R组成。所述引物组20可由SEQ ID NO:58所示的正向引物20F1、SEQ ID NO:59所示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成。所述引物组21可由SEQ IDNO:61所示的正向引物21F1、SEQ ID NO:62所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反向引物21R组成。所述引物组22可由SEQ ID NO:64所示的正向引物22F1、SEQ ID NO:65所示的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成。所述引物组23可由SEQ ID NO:67所示的正向引物23F1、SEQ ID NO:68所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引物23R组成。所述引物组24可由SEQ ID NO:70所示的正向引物24F1、SEQ ID NO:71所示的正向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成。所述引物组25可由SEQ ID NO:73所示的正向引物25F1、SEQ ID NO:74所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物25R组成。所述引物组26可由SEQ ID NO:76所示的正向引物26F1、SEQ ID NO:77所示的正向引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成。所述引物组27可由SEQ ID NO:79所示的正向引物27F1、SEQ ID NO:80所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R组成。所述引物组28可由SEQ ID NO:82所示的正向引物28F1、SEQ ID NO:83所示的正向引物28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成。所述引物组29可由SEQ ID NO:85所示的正向引物29F1、SEQ ID NO:86所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组成。所述引物组30可由SEQ ID NO:88所示的正向引物30F1、SEQ ID NO:89所示的正向引物30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成。所述引物组31可由SEQ ID NO:91所示的正向引物31F1、SEQ ID NO:92所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成。所述引物组32可由SEQ ID NO:94所示的正向引物32F1、SEQ ID NO:95所示的正向引物32F2和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。
所述引物组合中，所述引物组1可由SEQ ID NO:1自5’末端起第22至43位所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2自5’末端起第22至46位所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成。所述引物组2可由SEQ ID NO:4自5’末端起第22至46位所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5自5’末端起第22至45位所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成。所述引物组3可由SEQ ID NO:7自5’末端起第22至44位所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8自5’末端起第22至43位所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成。所述引物组4可由SEQ ID NO:10自5’末端起第22至48位所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11自5’末端起第22至47位所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成。所述引物组5可由SEQ ID NO:13自5’末端起第22至53位所示的正向引物05F1、SEQ ID NO:14自5’末端起第22至53位所示的正向引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成。所述引物组6可由SEQ ID NO:16自5’末端起第22至42位所示的正向引物06F1、SEQ ID NO:17自5’末端起第22至42位所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组成。所述引物组7可由SEQ ID NO:19自5’末端起第22至50位所示的正向引物07F1、SEQ ID NO:20自5’末端起第22至52位所示的正向引物07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成。所述引物组8可由SEQ ID NO:22自5’末端起第22至46位所示的正向引物08F1、SEQ ID NO:23自5’末端起第22至45位所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成。所述引物组9可由SEQ ID NO:25自5’末端起第22至41位所示的正向引物09F1、SEQ ID NO:26自5’末端起第22至40位所示的正向引物09F2和SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成。所述引物组10可由SEQ ID NO:28自5’末端起第22至46位所示的正向引物10F1、SEQ ID NO:29自5’末端起第22至48位所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成。所述引物组11可由SEQ ID NO:31自5’末端起第22至51位所示的正向引物11F1、SEQ ID NO:32自5’末端起第22至49位所示的正向引物11F2和SEQ ID NO:33所示的反向引物11R组成。所述引物组12可由SEQ ID NO:34自5’末端起第22至46位所示的正向引物12F1、SEQ ID NO:35自5’末端起第22至46位所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成。所述引物组13可由SEQ ID NO:37自5’末端起第22至46位所示的正向引物13F1、SEQ ID NO:38自5’末端起第22至44位所示的正向引物13F2和SEQ ID NO:39所示的反向引物13R组成。所述引物组14可由SEQ ID NO:40自5’末端起第22至46位所示的正向引物14F1、SEQ ID NO:41自5’末端起第22至48位所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成。所述引物组15可由SEQ ID NO:43自5’末端起第22至49位所示的正向引物15F1、SEQ ID NO:44自5’末端起第22至51位所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45所示的反向引物15R组成。所述引物组16可由SEQ ID NO:46自5’末端起第22至45位所示的正向引物16F1、SEQ ID NO:47自5’末端起第22至46位所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成。所述引物组17可由SEQ ID NO:49自5’末端起第22至50位所示的正向引物17F1、SEQ ID NO:50自5’末端起第22至51位所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所示的反向引物17R组成。所述引物组18可由SEQ ID NO:52自5’末端起第22至46位所示的正向引物18F1、SEQ ID NO:53自5’末端起第22至48位所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成。所述引物组19可由SEQ ID NO:55自5’末端起第22至49位所示的正向引物19F1、SEQ ID NO:56自5’末端起第22至49位所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的反向引物19R组成。所述引物组20可由SEQ ID NO:58自5’末端起第22至47位所示的正向引物20F1、SEQ ID NO:59自5’末端起第22至49位所示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成。所述引物组21可由SEQ ID NO:61自5’末端起第22至48位所示的正向引物21F1、SEQ ID NO:62自5’末端起第22至46位所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反向引物21R组成。所述引物组22可由SEQ ID NO:64自5’末端起第22至48位所示的正向引物22F1、SEQ ID NO:65自5’末端起第22至47位所示的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成。所述引物组23可由SEQ ID NO:67自5’末端起第22至44位所示的正向引物23F1、SEQ ID NO:68自5’末端起第22至46位所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引物23R组成。所述引物组24可由SEQ ID NO:70自5’末端起第22至48位所示的正向引物24F1、SEQ ID NO:71自5’末端起第22至49位所示的正向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成。所述引物组25可由SEQ ID NO:73自5’末端起第22至40位所示的正向引物25F1、SEQ ID NO:74自5’末端起第22至40位所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物25R组成。所述引物组26可由SEQ ID NO:76自5’末端起第22至48位所示的正向引物26F1、SEQ ID NO:77自5’末端起第22至46位所示的正向引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成。所述引物组27可由SEQ ID NO:79自5’末端起第22至48位所示的正向引物27F1、SEQ ID NO:80自5’末端起第22至48位所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R组成。所述引物组28可由SEQ ID NO:82自5’末端起第22至43位所示的正向引物28F1、SEQ ID NO:83自5’末端起第22至41位所示的正向引物28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成。所述引物组29可由SEQ ID NO:85自5’末端起第22至49位所示的正向引物29F1、SEQ ID NO:86自5’末端起第22至51位所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组成。所述引物组30可由SEQ ID NO:88自5’末端起第22至51位所示的正向引物30F1、SEQ ID NO:89自5’末端起第22至53位所示的正向引物30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成。所述引物组31可由SEQ ID NO:91自5’末端起第22至48位所示的正向引物31F1、SEQ ID NO:92自5’末端起第22至49位所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成。所述引物组32可由SEQ ID NO:94自5’末端起第22至44位所示的正向引物32F1、SEQ ID NO:95自5’末端起第22至43位所示的正向引物32F2和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。
上述任一所述引物组中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。
上述任一所述引物组合具体可由所述引物组1—所述引物组32组成。
上文中，序列表中序列1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即FAM荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。序列表中序列2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即HEX荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。
含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。
所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为x3)或x4)：x3)鉴定甘蓝品种；x4)鉴别甘蓝品种真伪性。
本发明还保护上述任一所述SNP位点组合或上述任一所述引物组合的应用，可为x1)至x4)中的任一种：x1)制备用于鉴定甘蓝品种的试剂盒；x2)制备用于鉴别甘蓝品种真伪性的试剂盒；x3)鉴定甘蓝品种；x4)鉴别甘蓝品种真伪性。
本发明还保护一种鉴定待测甘蓝属于76个甘蓝品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：分别检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于所述32个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测甘蓝基于所述32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中某品种基于所述32个SNP位点的基因型完全一致，则待测甘蓝与该甘蓝品种属于同一个品种；如果待测甘蓝基于所述32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中各个品种基于所述32个SNP位点的基因型均不一致，则待测甘蓝与76个甘蓝品种的品种均不相同。
上述方法中，所述“检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于所述32个SNP位点的基因型”的步骤可如下：
(1)分别以待测甘蓝的基因组DNA和76个甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测甘蓝和76个甘蓝品种基于所述32个SNP位点的基因型。
上述方法中，所述“检测检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于所述32个SNP位点的基因型”的步骤可如下：
(1)分别以待测甘蓝的基因组DNA和76个甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；
(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测甘蓝和76个甘蓝品种基于所述32个SNP位点的基因型。
本发明还保护一种鉴定待测甘蓝属于76个甘蓝品种中哪个品种的方法，可包括如下步骤：
(1)以待测甘蓝的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准甘蓝品种群中的各个甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准甘蓝品种群由76个甘蓝品种组成；
(2)将待测甘蓝得到的各个PCR扩增产物与每个标准甘蓝品种对应的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测甘蓝与哪个标准甘蓝品种为同一类，该待测甘蓝与该标准甘蓝品种即属于同一个品种。
上述任一所述76个甘蓝品种可为中甘21、苏甘8号、早夏16号、铁头八号、西园10号、苏甘19、瑞甘50、黔甘3号、华耐0903、瑞甘48、春甘2号、宿甘六号、苏甘20、秀美、寒美、先甘382、探春、苏甘3号、华耐G1103、瑞甘55、瑞甘21、瑞甘37、苏甘27、福兰、华耐G1202、Y2、绿宝石、锦绣、碧浪、华耐G1301、满月55、满月56、苏甘65、瑞甘22、名图、瑞甘16、瑞甘17、千美5号、双环56、满月51、铁头46、满月4号、先甘097、先甘011、冬丽42、秦甘1652、双环49、双环50、欧美来、中甘15号、中甘21号、京丰一号、中甘23号、中甘56号、中甘192号、中甘103号、中甘301号、甘蓝628号、中甘19号、中甘96号、中甘101号、中甘588号、中甘596号、晚丰、中甘18号、中甘9号、怡春、夏光、争春、8398、惠丰7号、西园4号、春丰、惠丰5号、惠丰4号和苏晨1号。
上述任一所述的方法中，“分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行PCR扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
本发明建立了基于等位基因竞争性特异PCR法鉴定甘蓝品种真实性的DNA指纹数据库，可用于对甘蓝品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为甘蓝种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知甘蓝品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为32个引物组在部分供试甘蓝品种中的SNP分型效果。
图2为建立在32个SNP引物组上的76个供试甘蓝品种的聚类图。
图3为SNP标记个数(即SNP位点个数)与区分76个供试甘蓝品种的关系图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于鉴定甘蓝品种真实性的引物组合的获得
一、32个SNP位点的发现
本发明基于30份甘蓝类蔬菜代表资源的重测序数据，获得32个SNP位点。这30份甘蓝类蔬菜资源类型丰富，涵盖结球甘蓝(3份)、羽叶甘蓝(5份)、抱子甘蓝(7份)、花椰菜(6份)、青花菜(4份)、球茎甘蓝(2份)和芥蓝(3份)，基本包括了甘蓝主要的生态类型，在农艺性状方面具有较高的遗传多样性，尽可能多地体现了种质代表性。
具体的，SNP位点的筛选标准如下：在全基因组范围内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、MAF>0.3、PCA聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SNP)的SNP位点。
32个SNP位点的基本信息详见表1中第1至4列。其中SNP位点在染色体上的位置是基于甘蓝02-12自交系参考基因组序列比对确定的(下载地址为：http://plants.ensembl.org/Brassica_oleracea/Info/Index)。
表1.32个SNP位点的基本信息
Figure BDA0002708668420000081
二、用于鉴定甘蓝品种真实性的引物组合的获得
根据步骤一发现的32个SNP位点，开发出具有较高的多态性信息量(PIC值)(见表1中第5列)且适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定甘蓝品种真实性的引物组合。
引物组合由32个引物组组成。每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。32个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。
表2.32个引物组及其引物的核苷酸序列
Figure BDA0002708668420000082
Figure BDA0002708668420000091
Figure BDA0002708668420000101
Figure BDA0002708668420000111
Figure BDA0002708668420000121
注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。
实施例2、实施例1开发的引物组合的有效性检验
随机选择76个供试甘蓝品种对实施例1开发的引物组合的有效性检验。
76个供试甘蓝品种的基本信息见表3。76个供试甘蓝品种均为常见的优良品种或部分国外引进品种。
表3.76个供试甘蓝品种的基本信息
Figure BDA0002708668420000122
Figure BDA0002708668420000131
1、供试甘蓝品种的基因组DNA的获得
采用CTAB法分别提取76个供试甘蓝品种的叶片(混取30粒种子的真叶)的基因组DNA，得到供试甘蓝品种的基因组DNA。
供试甘蓝品种的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试甘蓝品种的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。
2、分别以76个供试甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用32个引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的浓度比为2:2:5。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断76个供试甘蓝品种基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试甘蓝品种基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试甘蓝品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试甘蓝品种基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试甘蓝品种基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试甘蓝品种基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试甘蓝品种基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
部分结果见图1。结果表明，各个引物组在供试甘蓝品种中可以得到很好的分型效果。
4、聚类分析
根据76个供试甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型，利用MiniMarker和MEGA7软件对76个供试甘蓝品种进行聚类分析。
建立在32个引物组上的76个供试甘蓝品种的聚类图如图2所示。结果表明，32个引物组可以完全区分表3中的76个供试甘蓝品种。由此可见，实施例1开发的引物组合可以应用于甘蓝品种DNA指纹数据库构建和品种真实性鉴定。
5、效率评价
品种真实性鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。本发明的发明人比较了SNP标记个数(即引物组数)与区分76个供试甘蓝品种区分率的关系。
实验结果表明(图3)，32个引物组(即32个SNP标记个数)在76个供试甘蓝品种中的区分率达到100％。
实施例3、建立检测待测甘蓝属于实施例2中76个甘蓝品种中哪个品种的方法
一、建立检测待测甘蓝属于实施例2中76个甘蓝品种中哪个品种的方法
1、待测甘蓝的基因组DNA的获得
按照实施例2中步骤1的方法，将“供试甘蓝品种的叶片”替换为“待测甘蓝的叶片”，其它步骤均不变，得到待测甘蓝的基因组DNA。
2、以待测甘蓝的基因组DNA为模板，分别采用32个引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的浓度比为2:2:5。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
3、完成步骤2后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测甘蓝基于每个SNP位点的基因型。需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
具体的判断原则同实施例2中步骤3的判断原则。
4、完成步骤3后进行如下判断：如果待测甘蓝基于32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中某品种相应的SNP位点的基因型完全一致，则待测甘蓝与该甘蓝品种属于同一个品种；如果待测甘蓝基于32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中各个品种相应的SNP位点的基因型均不一致，则待测甘蓝与76个供试甘蓝品种的品种均不相同。
二、步骤一建立的方法的准确性鉴定
待测甘蓝1-待测甘蓝5的品种依次为中甘21、苏甘8号、早夏16号、铁头八号和西园10号。待测甘蓝1-待测甘蓝5的叶片均取自北京市农林科学院蔬菜研究中心试验基地。
1、按照步骤一中1-3的方法，获得待测甘蓝1-待测甘蓝5基于32个SNP位点的基因型。
2、将待测甘蓝1-待测甘蓝5基于32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型进行比较。
结果表明，待测甘蓝1基于32个SNP位点的基因型和中甘21相应的SNP位点的基因型完全一致，待测甘蓝1属于中甘21；待测甘蓝2基于32个SNP位点的基因型和苏甘8号相应的SNP位点的基因型完全一致，待测甘蓝2属于苏甘8号；待测甘蓝3基于32个SNP位点的基因型和早夏16号相应的SNP位点的基因型完全一致，待测甘蓝3属于早夏16号；待测甘蓝4基于32个SNP位点的基因型和铁头八号相应的SNP位点的基因型完全一致，待测甘蓝4属于铁头八号；待测甘蓝5基于32个SNP位点的基因型和西园10号相应的SNP位点的基因型完全一致，待测甘蓝5属于西园10号。检测结果与预期结果完全一致。
由此可见，步骤一建立的方法具有较高的准确性。
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种鉴定待测甘蓝属于哪个甘蓝品种的方法
<160> 96
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial sequence
<400> 87
gatcagaact ggttacaaag ctgggaa 27
<210> 88
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 88
gaaggtgacc aagttcatgc tcttaaatca aacaagaaaa ttctgaaatc g 51
<210> 89
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 89
gaaggtcgga gtcaacggat tttcttaaat caaacaagaa aattctgaaa tca 53
<210> 90
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 90
acccgtagat attgaaatta cagaagatga a 31
<210> 91
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 91
gaaggtgacc aagttcatgc tttggctaga ttcctaagaa gtagatac 48
<210> 92
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 92
gaaggtcgga gtcaacggat tcttggctag attcctaaga agtagatat 49
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 93
gtccctaagc cagcagataa aaattcc 27
<210> 94
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 94
gaaggtgacc aagttcatgc tctacactga gagcactcgt cgaa 44
<210> 95
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 95
gaaggtcgga gtcaacggat ttacactgag agcactcgtc gag 43
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 96
cgacgagcct acctcgggac tt 22

Claims (7)

1.引物组合甲，包括引物组1—引物组32：
所述引物组1由SEQ ID NO:1所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成；
所述引物组2由SEQ ID NO:4所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成；
所述引物组3由SEQ ID NO:7所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成；
所述引物组4由SEQ ID NO:10所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成；
所述引物组5由SEQ ID NO:13所示的正向引物05F1、SEQ ID NO:14所示的正向引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成；
所述引物组6由SEQ ID NO:16所示的正向引物06F1、SEQ ID NO:17所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组成；
所述引物组7由SEQ ID NO:19所示的正向引物07F1、SEQ ID NO:20所示的正向引物07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成；
所述引物组8由SEQ ID NO:22所示的正向引物08F1、SEQ ID NO:23所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成；
所述引物组9由SEQ ID NO:25所示的正向引物09F1、SEQ ID NO:26所示的正向引物09F2和SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成；
所述引物组10由SEQ ID NO:28所示的正向引物10F1、SEQ ID NO:29所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成；
所述引物组11由SEQ ID NO:31所示的正向引物11F1、SEQ ID NO:32所示的正向引物11F2和SEQ ID NO:33所示的反向引物11R组成；
所述引物组12由SEQ ID NO:34所示的正向引物12F1、SEQ ID NO:35所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成；
所述引物组13由SEQ ID NO:37所示的正向引物13F1、SEQ ID NO:38所示的正向引物13F2和SEQ ID NO:39所示的反向引物13R组成；
所述引物组14由SEQ ID NO:40所示的正向引物14F1、SEQ ID NO:41所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成；
所述引物组15由SEQ ID NO:43所示的正向引物15F1、SEQ ID NO:44所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45所示的反向引物15R组成；
所述引物组16由SEQ ID NO:46所示的正向引物16F1、SEQ ID NO:47所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成；
所述引物组17由SEQ ID NO:49所示的正向引物17F1、SEQ ID NO:50所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所示的反向引物17R组成；
所述引物组18由SEQ ID NO:52所示的正向引物18F1、SEQ ID NO:53所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成；
所述引物组19由SEQ ID NO:55所示的正向引物19F1、SEQ ID NO:56所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的反向引物19R组成；
所述引物组20由SEQ ID NO:58所示的正向引物20F1、SEQ ID NO:59所示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成；
所述引物组21由SEQ ID NO:61所示的正向引物21F1、SEQ ID NO:62所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反向引物21R组成；
所述引物组22由SEQ ID NO:64所示的正向引物22F1、SEQ ID NO:65所示的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成；
所述引物组23由SEQ ID NO:67所示的正向引物23F1、SEQ ID NO:68所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引物23R组成；
所述引物组24由SEQ ID NO:70所示的正向引物24F1、SEQ ID NO:71所示的正向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成；
所述引物组25由SEQ ID NO:73所示的正向引物25F1、SEQ ID NO:74所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物25R组成；
所述引物组26由SEQ ID NO:76所示的正向引物26F1、SEQ ID NO:77所示的正向引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成；
所述引物组27由SEQ ID NO:79所示的正向引物27F1、SEQ ID NO:80所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R组成；
所述引物组28由SEQ ID NO:82所示的正向引物28F1、SEQ ID NO:83所示的正向引物28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成；
所述引物组29由SEQ ID NO:85所示的正向引物29F1、SEQ ID NO:86所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组成；
所述引物组30由SEQ ID NO:88所示的正向引物30F1、SEQ ID NO:89所示的正向引物30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成；
所述引物组31由SEQ ID NO:91所示的正向引物31F1、SEQ ID NO:92所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成；
所述引物组32由SEQ ID NO:94所示的正向引物32F1、SEQ ID NO:95所示的正向引物32F2和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。
2.引物组合乙，包括引物组1—引物组32：
所述引物组1由SEQ ID NO:1自5’末端起第22至43位所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2自5’末端起第22至46位所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成；
所述引物组2由SEQ ID NO:4自5’末端起第22至46位所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5自5’末端起第22至45位所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成；
所述引物组3由SEQ ID NO:7自5’末端起第22至44位所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8自5’末端起第22至43位所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成；
所述引物组4由SEQ ID NO:10自5’末端起第22至48位所示的正向引物04F1、SEQ IDNO:11自5’末端起第22至47位所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成；
所述引物组5由SEQ ID NO:13自5’末端起第22至53位所示的正向引物05F1、SEQ IDNO:14自5’末端起第22至53位所示的正向引物05F2和SEQ ID NO:15所示的反向引物05R组成；
所述引物组6由SEQ ID NO:16自5’末端起第22至42位所示的正向引物06F1、SEQ IDNO:17自5’末端起第22至42位所示的正向引物06F2和SEQ ID NO:18所示的反向引物06R组成；
所述引物组7由SEQ ID NO:19自5’末端起第22至50位所示的正向引物07F1、SEQ IDNO:20自5’末端起第22至52位所示的正向引物07F2和SEQ ID NO:21所示的反向引物07R组成；
所述引物组8由SEQ ID NO:22自5’末端起第22至46位所示的正向引物08F1、SEQ IDNO:23自5’末端起第22至45位所示的正向引物08F2和SEQ ID NO:24所示的反向引物08R组成；
所述引物组9由SEQ ID NO:25自5’末端起第22至41位所示的正向引物09F1、SEQ IDNO:26自5’末端起第22至40位所示的正向引物09F2和SEQ ID NO:27所示的反向引物09R组成；
所述引物组10由SEQ ID NO:28自5’末端起第22至46位所示的正向引物10F1、SEQ IDNO:29自5’末端起第22至48位所示的正向引物10F2和SEQ ID NO:30所示的反向引物10R组成；
所述引物组11由SEQ ID NO:31自5’末端起第22至51位所示的正向引物11F1、SEQ IDNO:32自5’末端起第22至49位所示的正向引物11F2和SEQ ID NO:33所示的反向引物11R组成；
所述引物组12由SEQ ID NO:34自5’末端起第22至46位所示的正向引物12F1、SEQ IDNO:35自5’末端起第22至46位所示的正向引物12F2和SEQ ID NO:36所示的反向引物12R组成；
所述引物组13由SEQ ID NO:37自5’末端起第22至46位所示的正向引物13F1、SEQ IDNO:38自5’末端起第22至44位所示的正向引物13F2和SEQ ID NO:39所示的反向引物13R组成；
所述引物组14由SEQ ID NO:40自5’末端起第22至46位所示的正向引物14F1、SEQ IDNO:41自5’末端起第22至48位所示的正向引物14F2和SEQ ID NO:42所示的反向引物14R组成；
所述引物组15由SEQ ID NO:43自5’末端起第22至49位所示的正向引物15F1、SEQ IDNO:44自5’末端起第22至51位所示的正向引物15F2和SEQ ID NO:45所示的反向引物15R组成；
所述引物组16由SEQ ID NO:46自5’末端起第22至45位所示的正向引物16F1、SEQ IDNO:47自5’末端起第22至46位所示的正向引物16F2和SEQ ID NO:32所示的反向引物16R组成；
所述引物组17由SEQ ID NO:49自5’末端起第22至50位所示的正向引物17F1、SEQ IDNO:50自5’末端起第22至51位所示的正向引物17F2和SEQ ID NO:51所示的反向引物17R组成；
所述引物组18由SEQ ID NO:52自5’末端起第22至46位所示的正向引物18F1、SEQ IDNO:53自5’末端起第22至48位所示的正向引物18F2和SEQ ID NO:54所示的反向引物18R组成；
所述引物组19由SEQ ID NO:55自5’末端起第22至49位所示的正向引物19F1、SEQ IDNO:56自5’末端起第22至49位所示的正向引物19F2和SEQ ID NO:57所示的反向引物19R组成；
所述引物组20由SEQ ID NO:58自5’末端起第22至47位所示的正向引物20F1、SEQ IDNO:59自5’末端起第22至49位所示的正向引物20F2和SEQ ID NO:60所示的反向引物20R组成；
所述引物组21由SEQ ID NO:61自5’末端起第22至48位所示的正向引物21F1、SEQ IDNO:62自5’末端起第22至46位所示的正向引物21F2和SEQ ID NO:63所示的反向引物21R组成；
所述引物组22由SEQ ID NO:64自5’末端起第22至48位所示的正向引物22F1、SEQ IDNO:65自5’末端起第22至47位所示的正向引物22F2和SEQ ID NO:66所示的反向引物22R组成；
所述引物组23由SEQ ID NO:67自5’末端起第22至44位所示的正向引物23F1、SEQ IDNO:68自5’末端起第22至46位所示的正向引物23F2和SEQ ID NO:69所示的反向引物23R组成；
所述引物组24由SEQ ID NO:70自5’末端起第22至48位所示的正向引物24F1、SEQ IDNO:71自5’末端起第22至49位所示的正向引物24F2和SEQ ID NO:72所示的反向引物24R组成；
所述引物组25由SEQ ID NO:73自5’末端起第22至40位所示的正向引物25F1、SEQ IDNO:74自5’末端起第22至40位所示的正向引物25F2和SEQ ID NO:75所示的反向引物25R组成；
所述引物组26由SEQ ID NO:76自5’末端起第22至48位所示的正向引物26F1、SEQ IDNO:77自5’末端起第22至46位所示的正向引物26F2和SEQ ID NO:78所示的反向引物26R组成；
所述引物组27由SEQ ID NO:79自5’末端起第22至48位所示的正向引物27F1、SEQ IDNO:80自5’末端起第22至48位所示的正向引物27F2和SEQ ID NO:81所示的反向引物27R组成；
所述引物组28由SEQ ID NO:82自5’末端起第22至43位所示的正向引物28F1、SEQ IDNO:83自5’末端起第22至41位所示的正向引物28F2和SEQ ID NO:84所示的反向引物28R组成；
所述引物组29由SEQ ID NO:85自5’末端起第22至49位所示的正向引物29F1、SEQ IDNO:86自5’末端起第22至51位所示的正向引物29F2和SEQ ID NO:87所示的反向引物29R组成；
所述引物组30由SEQ ID NO:88自5’末端起第22至51位所示的正向引物30F1、SEQ IDNO:89自5’末端起第22至53位所示的正向引物30F2和SEQ ID NO:90所示的反向引物30R组成；
所述引物组31由SEQ ID NO:91自5’末端起第22至48位所示的正向引物31F1、SEQ IDNO:92自5’末端起第22至49位所示的正向引物31F2和SEQ ID NO:93所示的反向引物31R组成；
所述引物组32由SEQ ID NO:94自5’末端起第22至44位所示的正向引物32F1、SEQ IDNO:95自5’末端起第22至43位所示的正向引物32F2和SEQ ID NO:96所示的反向引物32R组成。
3.权利要求1所述引物组合甲或权利要求2所述引物组合乙的应用，为x1）至x4）中的任一种：x1）制备用于鉴定76个甘蓝品种的试剂盒；x2）制备用于鉴别76个甘蓝品种真伪性的试剂盒；x3）鉴定76个甘蓝品种；x4）鉴别76个甘蓝品种真伪性；
所述76个甘蓝品种为中甘21、苏甘8号、早夏16号、铁头八号、西园10号、苏甘19、瑞甘50、黔甘3号、华耐0903、瑞甘48、春甘2号、宿甘六号、苏甘20、秀美、寒美、先甘382、探春、苏甘3号、华耐G1103、瑞甘55、瑞甘21、瑞甘37、苏甘27、福兰、华耐G1202、Y2、绿宝石、锦绣、碧浪、华耐G1301、满月55、满月56、苏甘65、瑞甘22、名图、瑞甘16、瑞甘17、千美5号、双环56、满月51、铁头46、满月4号、先甘097、先甘011、冬丽42、秦甘1652、双环49、双环50、欧美来、中甘15号、中甘21号、京丰一号、中甘23号、中甘56号、中甘192号、中甘103号、中甘301号、甘蓝628号、中甘19号、中甘96号、中甘101号、中甘588号、中甘596号、晚丰、中甘18号、中甘9号、怡春、夏光、争春、8398、惠丰7号、西园4号、春丰、惠丰5号、惠丰4号和苏晨1号。
4.一种鉴定待测甘蓝属于权利要求3中所述76个甘蓝品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：分别检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测甘蓝基于32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中某品种基于32个SNP位点的基因型完全一致，则待测甘蓝与该甘蓝品种属于同一个品种；如果待测甘蓝基于32个SNP位点的基因型和76个甘蓝品种中各个品种基于32个SNP位点的基因型均不一致，则待测甘蓝与76个甘蓝品种的品种均不相同；
32个SNP位点分别为BoSNP002位点、BoSNP007位点、BoSNP016位点、BoSNP021位点、BoSNP028位点、BoSNP033位点、BoSNP037位点、BoSNP041位点、BoSNP047位点、BoSNP052位点、BoSNP059位点、BoSNP060位点、BoSNP062位点、BoSNP075位点、BoSNP076位点、BoSNP091位点、BoSNP101位点、BoSNP105位点、BoSNP106位点、BoSNP110位点、BoSNP114位点、BoSNP118位点、BoSNP119位点、BoSNP123位点、BoSNP131位点、BoSNP143位点、BoSNP148位点、BoSNP162位点、BoSNP163位点、BoSNP169位点、BoSNP171位点和BoSNP177位点；
BoSNP002位点为C1号染色体上的第296793位核苷酸；
BoSNP007位点为C1号染色体上的第12611358位核苷酸；
BoSNP016位点为C1号染色体上的第33551451位核苷酸；
BoSNP021位点为C2号染色体上的第3113051位核苷酸；
BoSNP028位点为C2号染色体上的第24698163位核苷酸；
BoSNP033位点为C2号染色体上的第38326491位核苷酸；
BoSNP037位点为C2号染色体上的第47456879位核苷酸；
BoSNP041位点为C3号染色体上的第868203位核苷酸；
BoSNP047位点为C3号染色体上的第23728120位核苷酸；
BoSNP052位点为C3号染色体上的第36143953位核苷酸；
BoSNP059位点为C3号染色体上的第64930308位核苷酸；
BoSNP060位点为C4号染色体上的第2841333位核苷酸；
BoSNP062位点为C4号染色体上的第10298943位核苷酸；
BoSNP075位点为C4号染色体上的第37791656位核苷酸；
BoSNP076位点为C4号染色体上的第48134351位核苷酸；
BoSNP091位点为C5号染色体上的第13820140位核苷酸；
BoSNP101位点为C5号染色体上的第39273578位核苷酸；
BoSNP105位点为C5号染色体上的第44036189位核苷酸；
BoSNP106位点为C6号染色体上的第8309925位核苷酸；
BoSNP110位点为C6号染色体上的第14463074位核苷酸；
BoSNP114位点为C6号染色体上的第26140487位核苷酸；
BoSNP118位点为C6号染色体上的第39738795位核苷酸；
BoSNP119位点为C7号染色体上的第158286位核苷酸；
BoSNP123位点为C7号染色体上的第5806434位核苷酸；
BoSNP131位点为C7号染色体上的第29393856位核苷酸；
BoSNP143位点为C8号染色体上的第560414位核苷酸；
BoSNP148位点为C8号染色体上的第19862942位核苷酸；
BoSNP162位点为C8号染色体上的第41500954位核苷酸；
BoSNP163位点为C9号染色体上的第2044009位核苷酸；
BoSNP169位点为C9号染色体上的第13219893位核苷酸；
BoSNP171位点为C9号染色体上的第35448451位核苷酸；
BoSNP177位点为C9号染色体上的第49443403位核苷酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型的步骤如下：
（1）分别以待测甘蓝的基因组DNA和76个甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合甲中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（2）完成步骤（1）后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测甘蓝和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测甘蓝和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型的步骤如下：
（1）分别以待测甘蓝的基因组DNA和76个甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（2）取步骤（1）得到的PCR扩增产物，测序；
（3）根据步骤（2）得到的测序结果，获得待测甘蓝和76个甘蓝品种基于32个SNP位点的基因型。
7.一种鉴定待测甘蓝属于权利要求3中所述76个甘蓝品种中哪个品种的方法，包括如下步骤：
（1）以待测甘蓝的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；以标准甘蓝品种群中的各个甘蓝品种的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合乙中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述标准甘蓝品种群由76个甘蓝品种组成；
（2）将待测甘蓝得到的各个PCR扩增产物与每个标准甘蓝品种对应的PCR扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测甘蓝与哪个标准甘蓝品种为同一类，该待测甘蓝与该标准甘蓝品种即属于同一个品种。
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Identification and development of a core set of informative genic SNP markers for assaying genetic diversity in Chinese cabbage;Peirong Li等;《Horticulture, Environment, and Biotechnology》;20190517;第60卷;第411-425页 *
甘蓝SNP标记开发及主要品种的DNA指纹图谱构建;李志远等;《中国农业科学》;20180716;第51卷(第14期);第2771-2787页 *

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