KR101733302B1 - 수박 흰가루병 저항성 개체 판별용 분자 마커 및 이의 이용 - Google Patents

수박 흰가루병 저항성 개체 판별용 분자 마커 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수박 흰가루병 저항성 개체 판별용 분자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트 및 이를 이용하여 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 수박 흰가루병 저항성 분자마커의 제공으로 PI 254744유래 수박 흰가루병 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있다.

Description

수박 흰가루병 저항성 개체 판별용 분자 마커 및 이의 이용{Molecular marker for selecting watermelon line or cultivar resistant to powdery mildew and use thereof}
본 발명은 수박 흰가루병 저항성 개체 판별용 분자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수박 흰가루병 저항성 개체, 계통 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트 및 이를 이용하여 수박 흰가루병 저항성을 판별하는 방법에 관한 것이다.
현재 염기서열 분석법의 발달과 비용의 절감으로 식물의 염기서열 분석이 빠르게 진행되고 있다. 박과 식물의 경우 최근 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었으며, 최근 게놈의 서열분석을 통한 게놈서열기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 특히 단일염기다양성(single nucleotide polymorphism; SNP) 정보의 확보로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커로서의 활용도가 증가되고 있다. 특히, 작물은 다양한 병에 감염되어 수확량 및 품질의 저하가 지속되고 있으며, 이의 방제를 위한 농약의 과다 사용으로 인한 피해가 지속적으로 증가하고 있는 실정이다. 이의 해결을 위한 가장 바람직한 방법은 기존 재배종에는 존재하지 않는 병 저항성 유전자를 포함하는 야생종의 저항성 게놈영역을 교배를 통하여 재배종에 도입하는 병 저항성 계통 육성법이라 할 수 있다. 일반적으로 여교잡 (backcross)을 통하여 병 저항성 게놈영역 도입이 이루어지는데, 이때 지속적인 병 접종을 통한 병 저항성 계통육성이 일반적이라 할 수 있다. 최근의 식물 전체 염기서열 해독에 따라서, 기존의 유전자지도는 고밀도화 되었으며, 이에 따라 특정 형질에 연관된 QTL (quantitative trait loci) 분석에 의해 얻어지는 형질관련 마커도 기존과 달리 매우 연관성이 높은 분자마커 (tightly linked marker)로 개발할 수 있게 되었다. 또한 병 저항성을 부여하는 특정 게놈영역에 대한 후보 유전자들도 찾아볼 수 있게 되었다.
한편, 흰가루병은 절대활물기생균으로 수박을 비롯한 박과식물에 빈발하고 발병시 작물에 따라 증상이 다소 차이가 있으나 대부분 줄기, 잎, 열매에 흰가루 모양의 곰팡이가 되며 병이 진행됨에 따라 식물의 광합성과 호흡을 저해하여 동화 작용과 증산 작용을 감소시켜 병반 조직의 괴사와 함께 급속한 노화를 초래하여 작물, 즉 수박(Citrullus lanatus, watermelon)의 재배와 생산의 감소에 막대한 영향을 주고 있다.
현재까지 이러한 흰가루병 방제는 주로 디페노코나졸, 베노밀 및 만코젭 등의 화학 농약에 의존하여 왔으나, 이러한 화학 농약의 연용은 결국 흰가루병의 약제 저항성을 증대시켜 농약의 효율성을 떨어뜨리게 되며, 화학 농약을 기피하는 소비자들에게는 높은 잔류 농약 검출로 인해 농약 사용 과채류가 기피되고 있는 실정이다.
이에, 흰가루병 저항성 수박의 육종이 시급한 상황이며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 수박(Citrullus lanatus, watermelon) 상업용 계통 SBB와 야생종 PI 254744를 교배친으로 한 분리집단에서 수박 흰가루저항성 QTL 분석으로 얻어진 수박 게놈영역을 토대로 수박 PI 254744 게놈 유래 흰가루병 저항성을 판별할 수 있는 분자마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분자 마커를 이용하여 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흰가루병 저항성을 갖는 수박의 육종 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 2의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 3의 염기서열 내에서 549번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은,
(1) 상기 PCR 키트와 수박으로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(2) 상기 (1)단계의 증폭된 시료를 이용하여 HRM(High resolution melting) 분석을 수행하는 단계를 포함하는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 흰가루병 저항성을 갖는 수박의 육종 방법을 제공한다:
(a) 저항성 야생종인 PI 254744와 재배종 SBB 또는 45NC과의 종간교잡으로 종간 F1을 얻는 단계;
(b) 상기 종간 F1을 다시 SBB 또는 45NC와 여교잡(F1×SBB 또는 F1×45NC)을 통하여 수박 흰가루병 저항성 종간 분리집단인 BC4F1 집단을 얻는 단계; 및
(c) 상기 BC4F1을 자가수분시키는 단계.
본 발명에 따른 수박 흰가루병 저항성 분자마커의 제공으로 PI 254744유래 수박 흰가루병 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있는 장점이 있다.
또한, 향후 PI 254744를 이용하여 교잡육종 시에 다양한 HRM 마커를 개발하는데 사용할 수 있는 저항성 게놈영역 및 그 서열을 제공함으로써, 교잡하고자 하는 다른 상업용 계통의 해당 염기서열에서도 HRM 마커를 쉽게 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
더욱이, 본 발명의 육종 방법에 따르면, PI 254744자원을 일회친으로 사용하고, 상업용 계통 SBB 및 45NC를 반복친으로 사용한 여교잡을 통해 흰가루병 저항성을 갖는 수박 계통을 육종할 수 있다.
도 1은 수박 상업용 우수계통 SBB와 흰가루병저항성 야생계통 PI 254744의 교잡세대 가계도 (pedigree)를 요약한 모식도이다.
도 2는 SBB와 PI 254744 교잡후대 F2세대의 유전자지도 작성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 SBB와 PI 254744 교잡후대 F2의 자가수분으로 얻어진 F3 세대의 저항성 검정으로 얻어진 표현형을 QTL 분석한 결과이다.
도 4는 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 6은 서열번호 3의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 PI 254744를 일회친으로 하고, SBB 및 45NC를 반복친으로 여교잡하여 얻어진 BC4F6세대의 2가지 NIL의 육성을 요약한 모식도이다.
도 8은 HRM 마커를 이용한 유전자형 판별 결과를 나타낸 것이다. 각 그래프는 유전자형을 나타내며, 적색그래프는 흰가루병 저항성(R)인 개체들, 청색그래프는 감수성(S)인 개체들, 노란색그래프는 헤테로(H = R+S)를 나타내며, 유전자형이 헤테로인 개체의 표현형은 저항성을 나타낸다.
본 발명자들은 수박(Citrullus lanatus, watermelon) 흰가루병 저항성 개체 판별을 위한 HRM 마커를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 교배 양친인 상업용 SBB 계통과 야생종 PI 254744의 F2:3 세대에서 QTL 분석으로 저항성 게놈영역을 결정하고, 이에 따라 교배양친의 저항성 영역에 대한 게놈 서열을 비교하여 SNP를 확보한 후, 해당 SNP를 확인할 수 있는 프라이머를 디자인하여 검정한 결과, 모든 개체에서 표현형과 유전자형이 일치하는 결과를 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 3의 염기서열 내에서 549번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열은 수박 2번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 25,800,000 - 27,000,000bp 영역일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 수박 흰가루병 저항성 야생종 PI 254744와 감수성 재배종 SBB와의 교잡을 통하여 얻어진 F2세대 개체들의 DNA를 추출한 후, GBS 분석을 통한 유전자지도를 작성하였고, F3 세대 (F2 각 개체의 자가수분으로 얻어진 세대)의 표현형 검정을 통하여 양적형질유전자좌 (QTL) 분석을 수행하였다. QTL 분석에서 저항성 부위로 추정되는 PI 254744의 게놈영역을 결정하였다.
또한, F2의 자가수분 세대인 F3 세대에서의 개체들에 흰가루병균을 접종후 저항성 여부를 판단하고 가장 저항성인 개체 20개체, 가장 감수성인 개체 20개체들을 선발하였고, 이들 각 개체들에서 DNA를 추출하여 동량으로 합친후 대량염기서열 분석 (NGS)을 수행하였다. 이때 얻어진 저항성과 감수성 개체 유래 염기서열들의 SNP를 상호비교하여 가장 큰 SNP 차이와 빈도를 보이는 영역을 결정하여 저항성 게놈영역으로 추정하였다. 상기 두 가지 방법으로 결정된 흰가루병 저항성 PI 254744 게놈부위의 공통 영역은 참조염색체 염기서열을 기준으로 염색체 2번의 25,800,000 - 27,000,000bp 영역으로 확인하였고, 해당 영역 내에 존재하는 SNP를 확보하였다.
본 발명에 따른 SNP 마커, 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 염기가 T -> C이고, 서열번호 2의 염기서열 내에서 553번째 염기가 T -> C이며, 서열번호 3의 염기서열 내에서 549번째 염기가 G -> A인 경우, 수박 흰가루병에 대한 저항성이 있는 개체인 것으로 판별할 수 있는바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 분자마커로 사용함으로써 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하며, 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 4 및 5로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 3개의 프라이머 세트를 이용하여 F2:3 분리집단의 각 개체(총 137개체)를 대상으로 유전자형 : 표현형 검정을 수행하였고, 그 결과, 모든 개체에서 프라이머 간에 차이없이 모두 동일한 HRM 결과를 나타냄을 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 HRM(High resolution melting) 분석을 통하여 핵산 서열에서의 변이를 확인하는데 사용될 수 있는바, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명에서 "HRM"은 PCR 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 90℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
1) 상기 PCR 키트와 수박으로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
2) 상기 1)단계의 증폭된 시료를 이용하여 HRM(High resolution melting) 분석을 수행하는 단계를 포함하는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하는 방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 수박 PI 254744를 교잡하여 흰가루병 저항성 계통을 얻은 후, 흰가루병 접종시 저항성 표현형을 나타내었으며, 특히 본 발명에 따른 분자마커들로 검정 시에도 유전적 흰가루병 저항성을 갖고 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 하기의 단계를 포함하는 흰가루병 저항성을 갖는 수박의 육종 방법을 제공한다:
(a) 저항성 야생종인 PI 254744와 재배종 SBB 또는 45NC과의 종간교잡으로 종간 F1을 얻는 단계;
(b) 상기 종간 F1을 다시 SBB 또는 45NC와 여교잡(F1×SBB 또는 F1×45NC)을 통하여 수박 흰가루병 저항성 종간 분리집단인 BC4F1 집단을 얻는 단계; 및
(c) 상기 BC4F1을 자가수분시키는 단계.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 실험방법
1-1. 수박 야생종 PI 254744의 준비
수박 흰가루병에 저항성인 야생종으로 알려져 있는 US Plant Introduction(PI) 중 PI 254744는 미국 농무성 USDA-ARS로부터 분양 받았고, 이는 수박 야생자원들에 대한 사전 흰가루병 저항성 스크리닝을 통하여 선발 되었으며, 4회 자가수분을 통하여 유전자형이 고정된 계통으로 육성되었다.
1-2. 수박 야생종 PI 254744의 흰가루병 저항성 판별
흰가루병균은 식물에 기생하는 진균(곰팡이)의 일종으로 절대활물기생균이기 때문에 경기도 안성 중앙대학교 내 비닐온실의 수박에서 채집하였고, 수박과 멜론에서 격리증식되어 접종원으로 사용하였다. 접종시 흰가루병균의 농도는 1 x 106 spore/mL이었으며, 감염잎에 물을 적셔 붓으로 긁어모아 접종원 농도를 맞추었다. 접종은 자엽 전개기에 1회, 본엽 1매기에 2회 일주일 간격으로 스프레이 분무하였으며, 발병을 위하여 접종 후 3-4일은 비닐을 덮어 상대습도 90-100%를 유지하였다. 접종 후 흰가루병균에 대한 식물의 반응은 하기 표 1과 같은 판별지표를 수립하고 평가하여 저항성, 중도저항성, 감수성으로 구분하였다.
판별점수
(Rating)		 저항성/감수성 판정 병징지표(Disease index)
0 저항성 병징 전혀 없음
1 저항성 약간의 희미한 황화 병반 발생
2 저항성 황화병반 발생 시작
3 저항성 황화병반이 자엽 또는 잎을 20% 이상 나타남
4 (중도)저항성 황화병반 외에 갈색의 괴사반점 발생
5 (중도)저항성 2-3개의 흰가루 포자가 원형으로 발생
6 (중도)저항성 흰가루 포자가 20% 미만으로 발생
7 감수성 흰가루 포자가 20-50% 발생
8 감수성 흰가루 포자가 50-70% 발생
9 감수성 전체에 흰가루 포자 발생 또는 식물체 고사
실시예 2. 수박 흰가루병 저항성 게놈영역을 판별하기 위한 QTL 분석
2-1. 수박 야생종 PI 254744의 흰가루병 저항성 유전양상 분석
PI 254744의 흰가루병 저항성 유전양상을 밝히기 위하여, 흰가루병에 감수성인 상업용 계통 SBB와 교배하여 후대분리세대를 확보하였다(도 1). 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 교배후 첫세대인 F1식물체들은 흰가루병에 저항성을 보였으며, F2 세대에서는 3:1 (저항성:감수성)로 분리하였다. 또한, F1을 모본 및 부본인 SBB와 PI 254744와 각각 교배하여 얻어진 여교잡 (backcross)세대에서도 멘델의 유전법칙에 상응하는 결과를 얻었다. 또한, 저항성 유전은 자엽과 본엽 1매에서 동일한 양상으로 결과를 얻었다
집단 개체수 관측 표현형 기대 표현형 자유도
 카이제곱
 P
R S R S
P1(SBB) 20 20
P2(PI254744) 20 20
F1 20 15 5
F2 137 100 37 102.75 34.25 1 0.058 0.782
BC1P1 54 26 28 27 27 1 3.34 0.260
BC2P2 52 50 2 52 0 1 0.509 0.495
표 2의 결과로 볼 때, 수박 야생종 PI 254744가 보유한 저항성 유전자는 단인자 완전우성으로 결론을 내릴 수 있으며, 이는 기 보고된 흰가루병저항성 자원인 인도 지역종 Arka Manic 등의 불완전우성의 결과와는 달라, 동일한 유전자가 아니며, 서로 관계없는 비대립유전자라는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 유전자지도 작성 및 F2:3 집단의 저항성 표현형 검정
모본 (수박 계통 SBB)과 부본 (수박 야생종 PI 254744)를 교배하여 얻어진 F1을 자가수분하여 F2를 얻고 각 F2 개체를 자가수분하여 F3 세대를 얻었다 (F2:3 집단). F2세대의 각 개체들의 성숙한 잎에서 DNA를 분리하였으며, SNP 기반의 유전자지도 작성을 위하여 GBS(genotyping by sequencing)를 수행하였다.
보다 구체적으로, GBS를 위하여 F2 각 개체에서 추출한 DNA를 ApeKI으로 자른 후, 각 개체를 확인할 수 있는 DNA 서열 (barcode)과 sequencing용 서열이 합성된 oligo DNA (총칭하여 adaptor)를 접합(ligation) 시켰다. 이후 NGS (next generation sequening)를 수행하고자 어댑터(adaptor) 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 sequencing용 library를 제작하였다. 제작된 library를 Illumina 사의 GAII sequencer에서 ligation 된 수박 게놈 조각들의 서열을 획득했으며, 각 F2 유래 SNP (single nucleotide polymorphism)를 생물정보학 소프트웨어로 분석하였다. 얻어진 SNP 정보를 기반으로 JoinMap (v. 4.1) 소프트웨어를 이용하여 연관유전자지도를 작성하였고, 이를 도 2에 나타내었다.
또한, F2:3 분리집단에서 각 F2에서 유래한 F3 개체들을 20개체씩 포트에 심고 흰가루병균을 접종하여 저항성 정도를 실시예 1-2에 기재된 판별지표(표 1)에 의거하여 점수화 하였고, 이를 바탕으로 저항성 및 감수성을 판별하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
번호 F3 개체 번호 표현형 검정
스코어 표현형
1 F3-12 5.5 R
2 F3-18 6.0 R
3 F3-19 6.0 R
4 F3-31 3.5 R
5 F3-32 3.0 R
6 F3-33 3.0 R
7 F3-36 2.5 R
8 F3-37 5.5 R
9 F3-42 2.0 R
10 F3-43 2.0 R
11 F3-46 3.0 R
12 F3-48 2.0 R
13 F3-58 2.0 R
14 F3-61 1.0 R
15 F3-94 2.0 R
16 F3-99 3.5 R
17 F3-100 2.5 R
18 F3-102 2.5 R
19 F3-105 3.0 R
20 F3-108 2.5 R
21 F3-4 8.0 S
22 F3-23 7.5 S
23 F3-27 7.5 S
24 F3-38 8.5 S
25 F3-41 8.0 S
26 F3-44 9.0 S
27 F3-45 8.5 S
28 F3-47 7.5 S
29 F3-49 8.0 S
30 F3-51 8.0 S
31 F3-54 8.5 S
32 F3-56 9.0 S
33 F3-72 8.5 S
34 F3-76 8.0 S
35 F3-79 8.0 S
36 F3-80 8.5 S
37 F3-84 8.0 S
38 F3-88 8.0 S
39 F3-91 8.5 S
40 F3-118 8.0 S
2-3. 수박 흰가루병 저항성 QTL 분석
실시예 2-2를 통해 작성된 유전자지도 정보와 F2:3 집단에서 판단된 각 F2에 상응하는 병반응(저항성 혹은 감수성)의 표현형을 검정한 결과를 취합하여, 공개 소프트웨어 Windows QTL Cartographer(ver. 2.5)를 사용하여 양적형질 유전자좌 (quantitative trait loci; QTL) 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바 와 같이, 11개로 이루어진 수박 염색체 중, 2번 염색체의 25,800,000 - 27,000,000bp 위치로 나타났으며 자엽의 저항성 유전자좌와 제1본엽의 저항성 유전자좌가 동일한 위치에서 QTL이 검정되었다. 주 QTL 지역이 전체 염색체 중 2번 염색체 한 지역에서만 LOD 19~21.5로 나타나 전체 게놈 중 단일 지역으로 한정할 수 있었다.
실시예 3. 수박 흰가루병 저항성 판별을 위한 HRM 마커 개발
3-1. 수박 흰가루병 저항성 판별을 위한 SNP 확보
실시예 2-3을 통해 확인된 저항성 게놈영역 내에서의 SNP를 좀 더 구체적으로 비교하기 위하여, PI 254744 및 SBB 계통의 DNA를 추출하고, 이를 Illumina사의 HiSeq 2500을 사용하여 NGS 분석을 수행하였고 (resequencing), 수박 참조게놈 (reference genome)의 서열 (www.icugi.org)과 비교하여 SNP를 얻었다. 또한, PI 254744 및 SBB 계통의 SNP 결과를 활용하여, 실시예 2-3을 통해 분석된 흰가루병 저항성 영역 내에서 Tablet 소프트웨어를 이용하여 서로 다른 SNP를 탐색하였다.
그 결과, 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기, 서열번호 2의 염기서열 내에서 553번째 염기 및 서열번호 3의 염기서열 내에서 549번째 염기에 위치하는 SNP를 확보하였다(도 4 내지 도 6 참조).
3-2. 프라이머 세트 제작
실시예 3-1을 통해 확보한 SNP를 중심으로 공개된 웹용 소프트웨어인 Primer 3 (http://primer3.ut.ee/)을 이용하여 각 SNP에 대한 프라이머 세트를 제작하였고, 각 프라이머 세트에 대한 구체적인 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
Primer Sequence mer
Set 1
254Pmr_04-F primer AGGATCTTGT GTTACTTCCG GA (서열번호 4) 22
254Pmr_04-R primer TTATGATCCA ATTGCTTCCG C (서열번호 5) 21
Set 2
254Pmr_05-F primer GGTCGGCCTT GTAATTTCGT (서열번호 6) 20
254Pmr_05-R primer AGAACAAACG CTGCACAGTT (서열번호 7) 20
Set 3
254Pmr_06-F primer AATGACTCAC CTCCCACAAA TG (서열번호 8) 22
254Pmr_06-R primer TGGTCATCCC TAAAGCAATA GTG (서열번호 9) 23
실시예 4. HRM 마커의 적용성 검증
실시예 3을 통해 제작된 프라이머 세트를 이용하여 2014년과 2015년에 걸쳐 F2:3 분리집단의 각 개체(총 137개체)를 대상으로 유전자형 : 표현형 검정을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 사용한 3개의 프라이머 세트는 F2-337에서 하나의 비정상적인 결과만 나타냈을 뿐, 모든 개체에서 프라이머 간에 차이없이 모두 동일한 HRM 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. F2-337에서 차이가 발생한 것은 실험오차로 인정할 수 있다.
한편, F2:3 분리세대의 각 식물체에서 검정되었던 표현형은 2014년과 2015년(일부는 개체수 부족으로 2015년에서 검정되지 못했음)에서 표현형이 동일하게 나타나 환경의 영향은 매우 적었음을 알 수 있다.
또한, 시험된 137개 모든 개체에서 표현형과 HRM 마커로 검정한 유전자형이 일치하였으며, 단지 F2-317 하나의 개체에서만 표현형은 감수성이나, 유전자형은 저항성으로 나타났다. 이는 표현형을 검정하기 위한 F3세대 진전시 F2-137의 자가수분이 제대로 이루어지지 않았을 것으로 유추할 수 있다.
F2 개체 번호 표현형 검정 유전자형 검정
2014년 2015년 254Pmr04 254Pmr05 254Pmr06
F2-2 S -z) S S S
F2-3 S - S S S
F2-4 R - H H H
F2-6 R - H H H
F2-8 R - H H H
F2-10 S - S S S
F2-12 S - S S S
F2-17 R - R R R
F2-23 R - R R R
F2-25 R - H H H
F2-38 R - H H H
F2-39 R - H H H
F2-56 R - H H H
F2-58 R - H H H
F2-61 R - H H H
F2-62 S - S S S
F2-64 R - R R R
F2-65 R - H H H
F2-67 S - S S S
F2-68 R - R R R
F2-70 R - H H H
F2-71 R - H H H
F2-75 S - S S S
F2-76 R - R H H
F2-79 S - S S S
F2-81 R - H H H
F2-82 R - H H H
F2-83 R - H H H
F2-84 R - R R R
F2-85 S - S S S
F2-86 R - H H H
F2-89 R - H H H
F2-91 R - R R R
F2-92 R - H H H
F2-93 R - H H H
F2-94 R - H H H
F2-97 R - H H H
F2-99 R - H H H
F2-100 R - R R R
F2-104 R - R R R
F2-105 R - H H H
F2-106 S - S S S
F2-107 S - S S S
F2-111 R - H H H
F2-112 S - S S S
F2-113 R - R R R
F2-115 S - S S S
F2-118 S - S S S
F2-121 S - S S S
F2-124 S - S S S
F2-125 R - R R R
F2-301 S S S S S
F2-302 S S S S S
F2-304 S S S S S
F2-305 R R R R R
F2-307 S S S S S
F2-308 R R R R R
F2-309 R R H H H
F2-312 R R H H H
F2-316 S S S S S
F2-317 S S R R R
F2-319 R R H H H
F2-320 R R R R R
F2-321 R R H H H
F2-323 S S S S S
F2-331 R R H H H
F2-332 R R R R R
F2-333 R R R R R
F2-336 R R H H H
F2-337 R R H S H
F2-338 S S S S S
F2-341 S S S S S
F2-342 R R H H H
F2-343 R R R R R
F2-344 S S S S S
F2-345 S S S S S
F2-346 R R H H H
F2-347 R R H H H
F2-348 R R H H H
F2-349 R R H H H
F2-350 R R R H R
F2-351 S S S S S
F2-353 R R S S S
F2-354 S S S S S
F2-356 R R H H H
F2-357 R R H H H
F2-359 S S S S S
F2-360 R R H H H
F2-361 R R H H H
F2-362 S S S S S
F2-363 R R H H H
F2-366 R R R R R
F2-370 S S S S S
F2-372 R R H H H
F2-376 R R H H H
F2-377 R R R R R
F2-378 R R H H H
F2-382 R R H H H
F2-383 R R R R R
F2-388 R R H H H
F2-390 S S S S S
F2-391 R R H H H
F2-393 R R H H H
F2-394 R R R R R
F2-395 R R H H H
F2-396 S S S S S
F2-399 R R R R R
F2-400 R R H H H
F2-402 R R R H H
F2-403 R - H H H
F2-404 R R R R R
F2-405 R R H H H
F2-406 R R H H H
F2-407 R R H H H
F2-408 R R H H H
F2-409 R R R R R
F2-411 R - R R R
F2-412 R R H H H
F2-413 S S S S S
F2-414 S S S S S
F2-417 R R H H H
F2-418 S S S S S
F2-419 R R H H H
F2-421 R S H H H
F2-425 R R H H H
F2-427 R R H H H
F2-430 R R H H H
F2-434 R R R R R
F2-438 R R R R R
F2-439 R R H H H
F2-440 R R R R R
F2-441 R R R R R
F2-442 R R R R R
F2-444 R R H H H
F2-445 R R H H H
F2-447 R R H H H
F2-449 R R R H H
(■표현형: 저항성(R), 감수성(S), ■유전자형: 저항성(R, H), 감수성(S))
실시예 5. 흰가루병 저항성 계통들에서의 HRM 마커의 적용성 검증
5-1. 근동질계통 (NIL; near- isogenic line) 육성
개발된 HRM 마커의 활용성을 검정하기 위하여, PI 254744자원을 일회친으로 사용하고, 상업용 계통 SBB 및 45NC를 반복친으로 사용한 여교잡으로 육성된 흰가루병저항성 상업용 근동질계통 (NIL)을 육성하였고, 이에 대한 방법 개략적인 과정을 도 7에 나타내었다. 한편, 각 NIL은 BC4F6 세대로 육성되었다.
5-2. NIL의 분리세대에서의 HRM 마커 검정
개발된 각 NIL 개체들에 대하여 흰가루병 저항성 표현형 검정을 수행하였다.
그 결과, 표 6 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 각 NIL개체들은 개발된 HRM마커의 유전자형 결과와 저항성/감수성의 표현형 검정결과가 일치하였다. 또한, 2종의 NIL개체 각각과 이를 흰가루병에 감수성인 상업용 계통 TS와 교배한 후대 F2분리세대들에서 멘델법칙에 상응하는 3:1 (저항성:감수성) 분리비를 보였으며, HRM 마커로 검정된 유전자형과 일치하여 PI 254744의 흰가루병 저항성 유래 후대교배 개체들에 대한 저항성 유전자형 검정이 가능함을 보여주었다.
F2 (TS x SBB-NIL_BC4F6) F2 (TS x 45NC-NIL_BC4F6)
번호 표현형 유전자형 번호 표현형 유전자형
1 S S S 1 R R R
2 R R H 2 R R H
3 S S S 3 S S S
4 S S S 4 S S S
5 R R R 5 S S S
6 R R H 6 R R R
7 S S S 7 R R R
8 S S S 8 R R H
9 R R R 9 S S S
10 R R H 10 R R H
11 S S S 11 S S S
12 R R H 12 R R R
13 S S S 13 S S S
14 R R R 14 S S S
15 R R H 15 S S S
16 S S S 16 R R H
17 R R R 17 S S S
18 R R H 18 R R R
유전자형 검정을 위한 HRM 이용 프라이머세트는 254Pmr04, 254Pmr05, 254Pmr06을 모두 사용하였고, 세 프라이머세트의 유전자형 검정결과는 동일하였다.
따라서, 본 발명을 통하여 제시된 PI 254744 유래 흰가루병저항성 연관 분자마커들은 PI 254744를 교배친 중 하나로 활용한 수박 흰가루병저항성 계통 육성에 성공적인 사용이 가능하며, 육종시 표현형 검정 없이 유식물체의 DNA 만으로 저항성 유무를 판별할 수 있음을 입증하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Molecular marker for selecting watermelon line or cultivar resistant to powdery mildew and use thereof <130> MP15-122 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1106 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 1 tagaagtata tcacttatag actatatagc tgtttttgct ttcactgagt ataggttcag 60 taaaaaaggc aactaaattt ttcttcaaaa aggtgccgtt ataaatatct caaatgtata 120 catcaataat cgtttgtaag ttcaaaacac acttttacta cttttttttt atctctcaat 180 tttgatctca aatattttaa attggtgaat tttgaagaat aagtttaaaa agatctcaac 240 taataaattt atttaattta aatataaaat taattaaata tatgacgttt taatatgatt 300 ttagaaaaaa aaaattatat tttttaatat ttcccacttc tctctcttct ttctctactt 360 tttcttcctc ttctctcttg ttctctctcc acatctccat ctccaacatt gttgttacag 420 cacccatctc ttgcgcagcc attccaacac atagatctga aacccagctc cattccaacc 480 aattatgtct actggatcta ctattaggat cttgtgttac ttccggagat actattcaaa 540 attgtatttt ttttctctta ttactatttg atagaaatga aggaacataa agaatacgca 600 gcggaagcaa ttggatcata aacactctaa tttgaaagta aaaacatgct atttttaagc 660 tataaaagag agggtttgaa atacaacatt tgtagcacca aattcttgca aattagcctt 720 tcagttaatc acgaacaaga tatagaccac cacaagtgtc ttccttgcta ttctctggtt 780 ttagaacttg attgtgggat caaattagtg atgaattgaa gggaattttg tgaattgaga 840 gagattgaga gacttttagt tttagtgctt aatttcaaca aattcaagca tcatcattct 900 tcttcatgaa tctcattcat aatttctttt taaagagatt aacatgcaaa aatgagttat 960 catttcaaat tgacacataa tttaagtagg attagtgtca aattgagaag aacacgccta 1020 gcatgcaaaa atgagtactg atttcaagtt gacaccttac ataagtgtga ttagtatcaa 1080 attgagaaca atgcaccaag cctttc 1106 <210> 2 <211> 1106 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 2 agatttacgt ttacaacata aaataataat agttgagatc taattttgat aaattatttt 60 accaattgtt acaaaattga aaaaaaaaaa gtgttttaaa aaaaaacaaa aaacataaga 120 agtggtggcc gggaccggcg ggacgagtag aaggacctta tcttttctct cagacgatga 180 actcactacc gtcgcaagcg attcgacctc tttcactctc ttcttcttct tcttcatctt 240 caagctctct ctaccttcgt ttcatctctt catccttccc aatttcccct tatttcaatc 300 cccaatcccc tgtttttgcc gccatttccc gccgactacg acgttccacc atcagaagct 360 gctcctccat caccgccaag ccatcctcgg agatcagaag aacccgccct aaggatgaac 420 ccgattccaa gcttcgggct ctccgtgagt tgttctcgag acccaccatt ggtatcgacg 480 cctatgtaat cccctcacag gacgctcacc aggtcggcct tgtaatttcg ttttctctgg 540 tctcttctgt gttgtaagag cacaaagtca tttcgatgca actgtgcagc gtttgttctt 600 aaggggtttg gaaaattctg agtaattaag actttgtgct gttgaatttt tttttttatc 660 aacgtgttgt gttgatgatg aactcatttg gatgtgttac tgaattgtga aatgtttgtt 720 cttgagggtt tttttttcct ttgttcttgg aaggagaaat atgagtcatc aggtcttcat 780 ttggtaacca ttgggtgtat tttttttttc ttttagttat tgaaaattgt gcttgtttct 840 tcacaatttc ttaaccatgg ttttcataaa ttctgaaaac aaaaaacaag tctacgatgg 900 attctttttt gtgaaatgtt gctcaattgt gcaatgtttg ttcttgaact ttttctgggg 960 gtggggagaa gaaatataga gtaattgcga ttttatgctc ctgaaatttt atggaagatc 1020 tattttcatc gtaatttcgt tatgtctaat ctcttctgtg tcgttagagc ataaagtcat 1080 ttggatgtgt tactcaactg tgcagc 1106 <210> 3 <211> 1098 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 3 aaagtaccat acactttaac actataaatt ttacttcatt aatatgtata gactccacaa 60 taatatcagt aggtactgct atactttaaa aaaactcgtt gacatgacaa acaataaatg 120 aaaattttgt ttaaaaaaga aacgaacaag caaattaata ccgcaaaaca ttctctacct 180 aactttttta ttgaattctt aaaattaaat ttaaaaaaaa ttaaaaaaaa aagaaggaaa 240 aagtatactt ttttttattg aattaaacaa aagaaagaaa taaattagaa aatccacttt 300 tctggttcga tgccacctta actgttttcc gcctcacgtt tatttaattt ttttttaatt 360 aaaatattat tttaggcttt aatatatatt cttaattgtc taattttcat cttcgtaatt 420 tcaacaaata aacaaattta gtctatgtac ttttaataaa tttttgagat ttttgtacaa 480 taaccaattc ataagtacat ttatgattaa tgactcacct cccacaaatg tatgaaatct 540 aactttctgg ttacattcga gcgcactatt gctttaggga tgaccatatg taccatagtc 600 ctaacatgat ggtcatccct atcgcgttat tcatttttag agactagttt tttttataga 660 gaaaaccaac cataaactaa tcatagtgac taattttaag attcattcaa agaataagaa 720 ctaaaacttg acattttaaa gtacaaagac tatagaacaa agctaataat ttagtgacca 780 aaatggtatt taaacttaaa tcttaaaaaa aattatttta aaatataaga aaatgtatca 840 aaatatttac aaatatagca aaatttcact atctatgtgc aatggaccgc gatagactat 900 tatctatatt tatatgtgtc ataatagaca cggatagtag tctatcgcaa tttattattg 960 tgtatcacag atagattatg atattttacg attatttgta aatattttca acaatcttgt 1020 cattttccta aaacaaaata caataaaact gaataaagtt tttatcaaat ttccttgatg 1080 aaaatttgtc actggata 1098 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254Pmr_04-F primer <400> 4 aggatcttgt gttacttccg ga 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254Pmr_04-R primer <400> 5 ttatgatcca attgcttccg c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254Pmr_05-F primer <400> 6 ggtcggcctt gtaatttcgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254Pmr_05-R primer <400> 7 agaacaaacg ctgcacagtt 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254Pmr_06-F primer <400> 8 aatgactcac ctcccacaaa tg 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254Pmr_06-R primer <400> 9 tggtcatccc taaagcaata gtg 23

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 2의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    서열번호 3의 염기서열 내에서 549번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 4 및 5으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제2항 또는 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트.
  5. (1) 제4항의 PCR 키트와 수박으로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (2) 상기 (1)단계의 증폭된 시료를 이용하여 HRM(High resolution melting) 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 수박 흰가루병 저항성 개체를 판별하는 방법.
  6. 삭제
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