CN105062898A - 一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法 - Google Patents
一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法。本发明所提供的蝙蝠蛾拟青霉菌株具体为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces？hepiali)DCH-60，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？No.10901。本发明从天然冬虫夏草上分离得到了蝙蝠蛾拟青霉新菌株DCH-60，并在蚕蛹上培养得到了孢梗束，有望作为保健食品或药品开发。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法。
背景技术
冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora(≡Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)]为我国传统名贵药材和滋补品，但是其天然产量十分有限，因此寻找其替代品，满足人们的健康需求，缓解人类需求对自然资源压力具有十分重要的意义。
蝙蝠蛾拟青霉(PaecilomyceshepialiQ.T.Chen&R.Q.DaiexR.Q.Dai,X.M.Li,A.J.Shao,ShuF.Lin,J.L.Lan,WeiH.Chen&C.Y.Shen)为中国中医研究院中药研究所戴如琴等1989年从云南迪庆采集的冬虫夏草上分离得到拟青霉属新种，该分离菌种与天然冬虫夏草的主要成分、药理作用基本相似。戴如琴等在1993年申请并获得国家专利，专利号为93104709。中国医学科学院药物所有关人员从青海化隆分离得到蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株，已经在江西国药厂(现江西济民可信集团)发酵生产并制成国家中药一类新药“金水宝”胶囊，具有“补益肺肾，秘精益气。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝酸软”等功效。2014年金水宝年产值已达22亿人民币。
然而目前为止，蝙蝠蛾拟青霉的产品仅限于液体发酵菌丝体。蝙蝠蛾拟青霉菌株来源于天然冬虫夏草标本，将其接种于昆虫虫体上，将更接近于其天然状态，而且对于真菌而言，人工培养子实体或孢梗束其有效成分及药理功效都与液体发酵菌粉不同，但是目前还没有蝙蝠蛾拟青霉菌株在蚕蛹上培养形成子实体或孢梗束的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种在蚕蛹上产孢梗束的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其培养方法。
本发明所提供的蝙蝠蛾拟青霉具体为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60，已于2015年6月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.10901。
所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60CGMCCNo.10901分离自天然冬虫夏草标本。冬虫夏草标本于2013年采集自青海玉树地区，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)25℃培养2周，菌落直径5cm左右，菌落正面白色粉状，中部微突起，背面中部淡黄色。菌丝有隔，透明，直径1.2-4μm；分生孢子梗直接生于气生菌丝上，单生、对生或轮生，(5.0-23)×(1.5-3.0)μm；分生孢子单细胞，透明，卵形，(2.0-3.0)×(1.2-2.0)μm。
培养所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60得到的孢梗束也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的培养所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60获得孢梗束的方法，是将所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60接种于蚕蛹进行培养，从而获得所述孢梗束。
具体而言，所述方法可包括如下步骤：
(1)将所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子接种于活蚕蛹的蛹体内，每个所述活蚕蛹接种2×105～8×105个(如5×105个)所述孢子；
(2)将步骤(1)接种后的所述蚕蛹置于15-20℃(如20℃)、黑暗下培养7-15天(如15天)，得到僵化蚕蛹；
(3)将步骤(2)所得的僵化蚕蛹置于18-25℃(如20℃)、空气相对湿度70-90％(如空气相对湿度80％)、光照下培养25-40天(如30天)，从蚕蛹中上长出2-10cm长的孢梗束，即可采收，然后进行阴干或冻干或烘干。
在所述方法的步骤(3)中，所述光照的光强具体可为200-1000lux(如400lux)。
在所述方法中，所述蚕蛹为活的桑蚕蛹或柞蚕蛹。具体是无病、健壮、有活力、未发育的活蛹，可用清水冲洗干净晾干后备用(不需灭菌处理)。
在所述方法的步骤(1)中，所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子可按照包括如下步骤的方法制备获得：
(a1)将所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的斜面菌种转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，18-25℃(如20℃)静置培养10-20天(如14天)，得到活化菌种；
其中，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基是按照包括如下步骤的方法制备获得的：制备每1000ml所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基，取200g土豆煮汁，过滤，加入20g葡萄糖，20g琼脂，定容至1000ml。
(a2)将步骤(a1)获得的活化菌种接种于土豆汁葡萄糖液体培养基，18-25℃(如20℃)100-200转/分钟(如150转/分钟)振荡培养4-6天(如6天)后，用4-8层(如4层)纱布过滤培养液(所述纱布的孔径为50目)，去除菌丝体，得到含有所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子的滤液。
其中，所述土豆汁葡萄糖液体培养基按照包括如下步骤的方法制备获得的：制备每1000ml所述土豆汁葡萄糖液体培养基，取200g土豆煮汁，过滤，加入20g葡萄糖，定容至1000ml。
相应的，所述方法的步骤(1)具体为：用注射器将所述滤液注射到所述活蚕蛹的蛹体内，使每个所述活蚕蛹接种2×105～8×105个所述孢子，每个所述活蚕蛹中的所述滤液的注射量为0.2-0.5ml。
所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60或所述孢梗束在制备保健品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60或所述孢梗束在生产腺苷中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明从天然冬虫夏草上分离得到一株蝙蝠蛾拟青霉新菌株——蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60，并在蚕蛹上培养得到了孢梗束，简单可行，成本低，其其中腺苷含量高达0.21±0.01％(质量百分含量)，远远高于《中华人民共和国药典》2015年版规定的冬虫夏草腺苷含量0.010％(质量百分含量)。本发明对相关保健食品或药品的开发具有重要意义，有着较好的应用前景。
保藏说明
建议分类命名：蝙蝠蛾拟青霉
拉丁名：(Paecilomyceshepiali)
参椐的生物材料：DCH-60
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年6月5日
保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10901
附图说明
图1为本发明蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60在PDA培养基上培养性状(正面)。
图2为本发明蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60在PDA培养基上培养性状(反面)。
图3为本发明蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60在蚕蛹上培养得到的孢梗束。
图4为其他蝙蝠蛾拟青霉菌株在蚕蛹上培养的照片。
图5为蝙蝠蛾拟青霉蚕蛹孢梗束和腺苷标准品的HPLC图谱。其中，A为蝙蝠蛾拟青霉蚕蛹孢梗束，保留时间15.830min；B为腺苷标准品，保留时间15.969min。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的获得及鉴定
本发明菌株DCH-60分离自天然冬虫夏草标本(冬虫夏草标本于2013年采集自青海玉树地区)，通过对其菌落、菌丝和分生孢子体形态特征的观察，结合细胞核rDNA-ITS测序，对该菌株进行分类鉴定。
一、形态学特征
将菌株DCH-60在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25℃培养2周，菌落直径5cm左右，菌落正面白色粉状，中部微突起，背面中部淡黄色，见图1和图2。菌丝有隔，透明，直径1.2-4μm；分生孢子梗直接生于气生菌丝上，单生、对生或轮生，(5.0-23)×(1.5-3.0)μm；分生孢子单细胞，透明，卵形，(2.0-3.0)×(1.2-2.0)μm。
二、分子生物学特征
rDNA-ITS序列作为条形码(Schoch,C.L.etal.Nuclearribosomalinternaltranscribedspacer(ITS)regionasauniversalDNAbarcodemarkerforFungi.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2012.109:6241–6246)，广泛用于真菌物种鉴定。本发明对菌株DCH-60进行DNA提取和rDNA-ITS扩增测序(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)，其测序结果如序列表中序列1所示。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST在线比对，结果显示该序列与蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)相应序列(GenBank：HM135170)相比，其同源相似性为99％。
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’。
鉴于上述形态特征及rDNA-ITS序列的分类鉴定研究，确定本发明菌株DCH-60为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.10901。
实施例2、在蚕蛹上培养蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60生产孢梗束
本发明蝙蝠蛾拟青霉在蚕蛹上培养产生孢梗束，包括菌种活化、液体菌种制备、蚕蛹选择、蚕蛹接种、僵蛹培养、孢梗束培养和采收干制等步骤，具体如下：
(1)菌种活化：将保存于斜面的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60菌种转移至马铃薯葡萄糖琼脂平板上，活化(20℃静置培养2周)。
其中，所述马铃薯葡糖琼脂培养基按照包括如下步骤的方法制备获得：200g土豆煮汁，过滤，加入20g葡萄糖，定容至1000ml；pH自然。
(2)液体菌种制备：将步骤(1)平板上活化好的菌种打孔接种至土豆汁葡萄糖液体培养基，20℃150转/分钟振荡培养6天。
其中，所述土豆汁葡萄糖液体培养基按照包括如下步骤的方法制备获得：200g土豆煮汁，过滤，加入20g葡萄糖，定容至1000ml；pH自然。
(3)蚕蛹选择：从桑蚕茧中取出的蚕蛹，选择无病、健壮、有活力、未发育的活蛹，用清水冲洗干净，晾干(不需灭菌处理)。
(4)蚕蛹接种：将步骤(2)生长好的菌种采用纱布(4层；50目医用纱布)过滤，去除菌丝体，得到含有所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子的滤液。血球计数板计数滤液中孢子含量为1×106个/ml。用注射器取将所述滤液注射到步骤(3)准备好的活蚕蛹的蛹体内，每个所述活蚕蛹注射0.5ml所述滤液(相当于5×105个所述孢子)，将注射后的蚕蛹摆放在器皿中生长。
(5)僵蛹培养：培养温度20℃，黑暗培养时间15天，检查蚕蛹的僵化程度。
(6)孢梗束培养：将已经僵化的蚕蛹转入生育室，20℃，光照(光强为400lux)培养，空气相对湿度80％，培养时间30天。
(7)采收干制：待孢梗束从蚕蛹上长出2-10cm时采收，冷冻干燥。
实验同时设置了其他蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)菌株对照试验，与上述方法相比，仅将蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60替换为蝙蝠蛾拟青霉ACCC30355，其余操作均不变。
结果显示，本发明蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60在蚕蛹上按照如上方法进行培养可以得到孢梗束(图3)；而其他蝙蝠蛾拟青霉菌株(ACCC30355)在蚕蛹上按照如上方法进行培养均不能得到孢梗束(图4)。
实施例3、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢梗束药效分析
采用高效液相色谱法(HPLC)对实施例2获得的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢梗束进行腺苷含量测定。具体如下：
腺苷标准品：Sigma公司产品，CAS号58-61-7。
标准曲线测定：准确称取腺苷标准品10mg，用流动相(配方见下文)溶解定容100ml，摇匀，4℃冰箱保存，有效期1个月。准确吸取0.1，0.2，0.5，1，2和5ml上述配制好的腺苷标准品溶液于10ml容量瓶中，用水定容、摇匀，该标准曲线浓度为1，2，5，10，20和50μg/ml，按样品的色谱条件(见下文)测定，以腺苷浓度为横坐标(X)，相应的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，求线性回归方程。
样品准备：准确称取实施例2获得的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢梗束样品0.5g，加水约80ml，置于超声波仪中超声处理3小时，取出后用水定容至100ml。取样液过0.45μm微孔滤膜，滤液供高效液相色谱法测定。
液相色谱条件：
色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：乙腈：水＝5：95(体积比)，使用前0.45μm滤膜过滤，脱气；
流速：1.0ml/min；
柱温，35℃；
波长：260nm；
进样量，10μl。
实验重复三次，结果取平均值，
腺苷标准品和孢梗束样品的HPLC图谱如图5所示。图5中A(孢梗束样品)的保留时间15.830min的峰为腺苷峰，图5中B(腺苷标准品)的保留时间为15.969min的峰为腺苷峰。所得线性回归方程方程为Y＝37396X–16397，R2＝0.9997，根据该方程计算得到实施例2获得的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢梗束，其腺苷含量高达0.21±0.01％(质量百分含量)，远远高于出《中华人民共和国药典》2015年版规定的冬虫夏草腺苷含量0.010％(质量百分含量)。
Claims (10)
1.蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.10901。
2.培养权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60得到的孢梗束。
3.一种培养权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60获得孢梗束的方法，是将权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60接种于蚕蛹进行培养，从而获得所述孢梗束。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子接种于活蚕蛹的蛹体内，每个所述活蚕蛹接种2×105～8×105个所述孢子；
(2)将步骤(1)接种后的所述蚕蛹置于15-20℃、黑暗下培养7-15天，得到僵化蚕蛹；
(3)将步骤(2)所得的僵化蚕蛹置于18-25℃、空气相对湿度70-90％、光照下培养25-40天，从蚕蛹中上长出2-10cm长的孢梗束。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述光照的光强为200-1000lux。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述蚕蛹为柞蚕蛹或桑蚕蛹。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
(a1)将所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的斜面菌种转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，18-25℃静置培养10-20天，得到活化菌种；
(a2)将步骤(a1)获得的活化菌种接种于土豆汁葡萄糖液体培养基，18-25℃100-200转/分钟振荡培养4-6天后，用纱布过滤培养液，去除菌丝体，得到含有所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60的孢子的滤液。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：用注射器将权利要求7中所述的滤液注射到所述活蚕蛹的蛹体内，使每个所述活蚕蛹接种2×105～8×105个所述孢子。
9.权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60或权利要求2所述的孢梗束在制备保健品中的应用。
10.权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)DCH-60或权利要求2所述的孢梗束在生产腺苷中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |