CN101307352A

CN101307352A - 一种中国被毛孢生理小种的发现及工艺优化

Info

Publication number: CN101307352A
Application number: CNA2008100610492A
Authority: CN
Inventors: 傅惠英; 柯越海; 郑勇军; 柯传奎
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2008-05-07
Publication date: 2008-11-19

Abstract

本发明是建立在细胞学动态信息基础上，鉴别青藏高原不同产地和真假冬虫夏草或制品，筛选分离自青藏高原不同产地的冬虫夏草菌种中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)。依据与道地药材西藏那曲和青海玉树产的冬虫夏草细胞图谱的接近程度，用一至十星级表示冬虫夏草的质量高低。同时，筛选出一种最接近天然冬虫夏草细胞图谱的中国被毛孢生理小种。本发明还涉及了中国被毛孢生理小种产业化方法的改进，使用膜分离截留技术，从发酵外液中提取与冬虫夏草相似作用的有效部位，和菌丝体合并或分别冷冻干燥，共同制成保健食品或药品或食品。

Description

一种中国被毛孢生理小种的发现及工艺优化

(一)技术领域

本发明涉及优良中国被毛孢生理小种的筛选及其产业化方法改进。

(二)背景技术

冬虫夏草与人参、鹿茸同被誉为中国三大宝，有“百药之王”的美称，被历代医家称为“理诸虚百损之圣药”。近年来，由于冬虫夏草价格持续上涨，而冬虫夏草产量又在逐渐下降，市场上出现了各种各样的假冬虫夏草和假冬虫夏草制品，真伪难辨。如何鉴别冬虫夏草？如何使冬虫夏草真正产业化，来解决市场的供不应求，缓解采挖冬虫夏草带来严重的环境污染，成为了人们日益关注的问题。

虫草属有497种，中药冬虫夏草只是其中的一种，拉丁名全称为Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.，是以虫草蝙蝠蛾幼虫为宿主并长成虫型菌核和草型子座的复合体(子座是高等真菌的有性器官)。冬虫夏草产业化首决条件是确切分离到冬虫夏草菌。2005年10月29日，中国菌物学会在北京召开了“冬虫夏草及其无性型研讨会”，与会专家就冬虫夏草菌及其无性型科学名称的正确使用一致做出了下列结论：

1.冬虫夏草菌的拉丁学名是Cordyceps sinensis，其无性型是中国被毛孢，国际承认的无性型拉丁学名为：Hirsrtella sinensis Liu，Guo，Yu etZeng(1989)。冬虫夏草头孢(Cephalosporium dongchongxiacaonia)、蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali)、中华束丝孢(Synnema tium sinense)为中国被毛孢的同种异名，且系不合格发表名称，不为国际所承认。

2.中国拟青霉(Paecilomyces sinensis Chen，1984)不是冬虫夏草菌的无性型，而是不同于冬虫夏草菌的另一种真菌，其有性型名称尚不明确。

3.蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali Chen et Dai，1989)不是冬虫夏草菌的无性型，而是不同于冬虫夏草菌的另一种真菌，其有性型名称尚不明确。

此外，虽然下列菌种均未被纳入上述实验过程，但是，至灵胶囊生产菌被孢霉属真菌，在亲缘关系上是和子囊菌相距甚远的结合菌门的成员，因此，与冬虫夏草菌无关。标明为“人工冬虫夏草菌丝粉”的心肝宝胶囊的生产菌“粉红胶霉”则是一种真菌寄生菌；其胶霉属(Gliocladium Corda)是肉座菌科(Hypocreaceae)小灿球赤壳菌属(Sphaerostibella)的无性型，也不是冬虫夏草菌。根据上述分析，无论是至灵胶囊、宁心宝胶囊或心肝宝胶囊的生产菌均非冬虫夏草菌的无性型。

以中国被毛孢为菌种发酵生产制品的出现(如百令胶囊)，不但有效缓解了冬虫夏草市场供需矛盾，延缓草原环境恶化，而且使冬虫夏草变得有名但不再昂贵，能让更多的老百姓享用得起。但是也存在许多不足，人们使用人工冬虫夏草制品后容易上火，少数产生胃肠道不良反应，而天然冬虫夏草性温平，几乎很少发生，所以人工冬虫夏草制品在疗效上与天然冬虫夏草存在一定的距离；另外，人工冬虫夏草发酵废液的排放对环境也造成比较大的污染。解决这些问题，一方面需要从优良菌种的筛选着手，另一方面从发酵工艺上进行改进。

本发明就是发现一种优良中国被毛孢生理小种及其产业化方法的改进。

(三)发明内容

本发明使用细胞学动态信息分析筛选出了一种中国被毛孢生理小种，并通过改进其产业化工艺，所得产物与青藏高原那曲、玉树产的冬虫夏草从A549、RBL等细胞捕获细胞学动态信息的集成数据相同。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

1.构建天然冬虫夏草标准化细胞动态信息图谱

1.1天然冬虫夏草提取

称取不同产地冬虫夏草0.09g，加1mL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，离心，取上清液备用。

2.2提取液介入细胞培养

取不同产地冬虫夏草提取液10uL，加入铺有10³～10⁴个/孔细胞的相对应孔内，使用市售仪器获取细胞学动态信息，建立冬虫夏草标准细胞动态信息图谱。

2.中国被毛孢菌种筛选

2.1中国被毛孢菌丝体提取

称取中国被毛孢菌丝体0.09g，加1mL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，离心，取上清液备用。

2.2提取液介入细胞培养

取中国被毛孢菌丝体提取液10uL，加入铺有10³～10⁴个/孔细胞的相对应孔内，以青藏高原那曲、玉树等地产的天然冬虫夏草为对照，使用市售仪器获取细胞学动态信息，筛选接近天然冬虫夏草图谱的中国被毛孢生理小种。

3.中国被毛孢生理小种发酵外液处理工艺改进

按中国被毛孢常规发酵后，取发酵外液，滤液分别用300、500、1000、2000、3000、4000分子量的超滤离心管或膜浓缩，冷冻干燥，得发酵外液干粉。取各干粉0.09g，加1mL纯净水溶解，取10uL加入铺有10³～10⁴个/孔细胞的相对应孔内，以青藏高原那曲、玉树等地产的天然冬虫夏草为对照，使用市售仪器获取细胞学动态信息，筛选发酵外液接近天然冬虫夏草图谱的分子量段。

所述中国被毛孢常规发酵工艺简单流程为：斜面培养→种瓶培养→发酵灌培养→发酵终点。

上述方法中，所述的细胞可以有很多种，比如A549、RBL等。

上述方法中，所述的获取细胞学动态信息的方法可以有很多种，比如RT-CES实时动态分析检测系统等。

对不同产地的天然冬虫夏草通过细胞学动态信息方法分析，结果表明西藏那曲和青海玉树出产的冬虫夏草比较接近。以西藏那曲和青海玉树出产的冬虫夏草作为对照，对不同中国被毛孢菌株通过细胞学动态信息方法分析，筛选出同青藏高原那曲、玉树产冬虫夏草具有相同集成信息的菌株。以西藏那曲和青海玉树出产的冬虫夏草作为对照，对发酵外液不同分子量段，通过细胞学动态信息方法分析，筛选出发酵外液同青藏高原那曲、玉树产冬虫夏草具有相同集成信息的分子量段。

中国被毛胞生理小种产业化工艺改进结果：取中国被毛胞生理小种常规发酵物，固液分离，滤液取300～4000段分子量的膜浓缩，浓缩液分别或与菌丝体混合冷冻干燥或烘干，得中国被毛孢生理小种的发酵终产物。

本发明所述提供了一种中国被毛孢生理小种的筛选及其产业化方法，其有益效果主要体现在：(1)本发明所述的分析方法是建立在大规模细胞生物学功能基础上，可以反应不同中国被毛孢菌株同天然冬虫夏草生物功能的接近程度，为筛选更接近天然冬虫夏草的中国被毛孢菌株提供参考。(2)本方法对天然冬虫夏草细胞学动态信息获取分析可以用来作为真、假冬虫夏草制品的鉴别。(3)中国被毛孢发酵物处理工艺的改进，大大提高了产量，同时也减少了环境污染。

(四)附图说明

图1、不同产地天然冬虫夏草的A549细胞动态信息分析

图2、以天然冬虫夏草RBL细胞动态信息图作为对照筛选中国被毛孢菌株

图3、不同虫草制品的RBL细胞动态信息分析

图4、不同虫草制品的RBL细胞动态信息分析

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：不同产地天然冬虫夏草的A549细胞动态信息分析

1.1不同产地的天然冬虫夏草提取

取不同产地的天然冬虫夏草，干燥、粉碎，称取西藏那曲冬虫夏草、西藏林芝冬虫夏草、青海海南州冬虫夏草、青海玉树冬虫夏草、四川德格冬虫夏草、四川阿坝县冬虫夏草、云南玉龙雪山冬虫夏草各0.09g，加1mL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，离心，取上清液备用。

1.2提取液介入细胞培养

取不同产地的天然冬虫夏草提取液10uL，加入铺有5000个/孔的A549细胞株的相对应孔内，使用实时动态分析检测系统获取细胞学动态信息(见图1)。

实施例2：中国被毛孢生理小种的筛选

2.1中国被毛孢菌丝体提取

称取1号、2号、3号、4号、5号中国被毛孢菌种发酵菌丝体0.09g，加1mL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，离心3500转/分15分钟，取上清液备用。

2.2提取液介入细胞培养

取1号、2号、3号、4号、5号中国被毛孢菌种菌丝体提取液10uL，加入铺有4000个/孔的RBL细胞株相对应孔内，以青藏高原那曲、玉树等地产的天然冬虫夏草作为阳性对照，使用实时动态分析检测系统获取细胞学动态信息(见图2)。

实施例3：不同虫草制品的细胞学动态信息分析

3.1不同虫草制品提取

称不同虫草制品：百令胶囊(批号021154)、金水宝胶囊(批号051101)、天狮牌虫草菌丝体胶囊、至灵胶囊、奇滋宝胶囊、位元堂冬虫夏草(西藏、天然野生)制品、东台冬虫夏草冻干粉、金虫草养生胶囊、宁心宝胶囊各0.09g，加1mL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，离心，取上清液备用。

3.2提取液介入细胞培养

取不同虫草制品提取液10uL，加入铺有4000个/孔的RBL细胞株的相对应孔内，以青藏高原那曲、玉树等地产的天然冬虫夏草为对照，使用实时动态分析检测系统获取细胞学动态信息(见图3、4)。

Claims

1、一种用细胞学动态信息鉴别各地冬虫夏草、中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)和各种″虫草″，筛选出的中国被毛孢生理小种，经产业化所得的产物与青藏高原道地药材的冬虫夏草相同。

2、权利要求1所述细胞学动态信息是一种基于现代分子生物学和细胞学而建立的快速、微量、体外筛选模型的高通量技术方法，使用一种或多种分离自人体或动植物或微生物的各种组织和器官细胞，或永生化细胞，如A549、RBL，3T3， COS7等细胞，被市售检测仪器捕获的各种细胞学的动态信息，经统计学分析方法转换成数学矩阵或数字或字母构成的条码表示，作为冬虫夏草及其代谢产物或其复方制品的各种生物功能或药效的象征标记或冬虫夏草质量高低的识别标志。

3、权利要求1所述鉴别各地冬虫夏草、中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)和各种″虫草″是以青藏高原道地药材产地的西藏那曲和青海玉树的冬虫夏草从A549获取的细胞动态信息图谱为标准比较各地冬虫夏草、中国被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)和市售的各种″虫草″。

4、权利要求1所述筛选出的中国被毛孢生理小种是指在从A549获取的细胞动态信息图谱为标准比较，与青藏高原道地药材产地的西藏那曲和青海玉树的冬虫夏草一致的冬虫夏草菌种，并定名为中国被毛孢那曲玉树生理小种Hirsutella sinensis Sp.naqvyusu Guo，Fu & Ke。

5、权利要求1所述产业化是指中国被毛孢那曲玉树生理小种经传统液体培养(发酵培养)和固液分离，发酵培养外液使用膜分离截留技术，从发酵外液中提取与冬虫夏草相似作用的有效部位，和菌丝体合并或分别冷冻干燥或烘干或喷雾干燥，共同制成保健食品或药品或食品。

6、权利要求1所述经产业化所得的产物与青藏高原道地药材的冬虫夏草相同是指在从RBL获取的细胞动态信息图谱为标准比较，中国被毛孢那曲玉树生理小种的产业化产品与青藏高原道地药材产地的西藏那曲和青海玉树的冬虫夏草一致。

7、权利要求2所述冬虫夏草质量高低的识别标志是指依据与道地药材西藏那曲和青海玉树产的冬虫夏草细胞图谱的接近程度，用一个至十个星级表示冬虫夏草的质量高低。

8、权利要求5所述发酵培养外液使用膜分离截留技术是指两次使用有机膜，截留分子量为300或500到3000或4000的物质。

9、权利要求5所述冷冻干燥或烘干或喷雾干燥是指中国被毛孢那曲玉树生理小种液体培养后经固液分离所得的菌丝体和经膜分离截留，分别或合并冷冻干燥或烘干或喷雾干燥。