JP2021193963A - 遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラム - Google Patents
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Abstract
【課題】対象となる微生物種等の情報を設定するだけで当該対象に特異的な遺伝子情報を検索することができ、延いては、微生物検出に最適な核酸プローブを簡易に設計可能とすることに貢献する遺伝子検索装置等を提供すること。【解決手段】核酸プローブ設計を支援するための遺伝子検索装置は、所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、当該所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子データテーブルから、設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、当該テーブルで管理されている、当該微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を検索する。【選択図】図１
Description
本発明は、核酸プローブ設計を支援するための、遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラムに関する。
マイクロバイオーム研究では、次世代シーケンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）と呼ばれる超並列シーケンサーを用いた網羅的解析が主流である。また、当該網羅的解析は微生物や遺伝子のスクリーニング手法として強力である。
一方で、検出対象となる菌種が定まった後には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの別の測定手法により遺伝子の検出が行われるようになることが考えられる。
なお、遺伝子抽出に関連する先行技術文献として、非特許文献１および非特許文献２が挙げられる。非特許文献１には、ウイルスに特徴的な遺伝子を抽出し、当該抽出した遺伝子を未知のウイルスの分類に使用する技術が開示されている。非特許文献２には、対象となる生物種のゲノム中の保存配列のみを抽出し、当該抽出した保存配列を対象にプライマーを設計する技術が開示されている。
Taxonomic assignment of uncultivated prokaryotic virus genomes is enabled by gene-sharing networks. Nature Biotechnology (2019) DOI: 10.1038/s41587-019-0100-8
HiMAP: Robust phylogenomics from highly multiplexed amplicon sequencing. Molecular Ecology Resources (2018) doi:10.1111/1755-0998.12783
例えば、検出対象となる菌に特異的な遺伝子（例えば病原性遺伝子など）を対象にプライマーを設計する場合、当該遺伝子を検索するにあたって、菌ごとに深い事前知識と文献調査が必要となる。また、例えば、多くの菌が有する遺伝子（例えば生育必須遺伝子など）を対象にプライマーを設計する場合、特異性を確保することが困難である。
本発明は、対象となる微生物種等の情報を設定するだけで当該対象に特異的な遺伝子情報を検索することができ、延いては、微生物検出に最適な核酸プローブを簡易に設計可能とすることに貢献する遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラムを提供することを目的とする。
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る遺伝子検索装置は、核酸プローブ設計を支援するための、制御部を備える遺伝子検索装置であって、所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、前記所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子情報にアクセス可能であり、前記制御部は、設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する検索手段を備える。
ここで、核酸プローブとは、標的核酸とハイブリダイズし得る核酸分子である。標的核酸とは、検出対象となる微生物に特異的な遺伝子をコードする核酸である。核酸プローブは、概念的に、核酸増幅法におけるプライマーやCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic Repeat）-CAS（CRISPR-associated protein）システムなどにおけるガイド、核酸検査におけるプローブなどを含む。核酸プローブは、標的核酸と異なる核酸から構成されてもよい。標的核酸と異なる核酸から核酸プローブが構成されるとは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として核酸プローブが有することを意味する。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、標的核酸とは異なる核酸の核酸プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブ（例えばＲＮＡプローブ）を用いることができる。
なお、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記所定の複数の微生物および前記系統情報は、全ゲノム解析結果から得られたものでもよく、前記所定の複数の遺伝子は、前記全ゲノム解析結果に登録されている前記所定の複数の微生物の全ゲノム配列から各全ゲノム配列上の遺伝子領域配列を予測し、前記予測した各遺伝子領域配列の機能アノテーションを行うことによって決定されたものでもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記保有遺伝子情報は、さらに、メタゲノム解析を行うことによって得られた微生物叢由来の単一または複数のコンティグ配列における前記所定の複数の遺伝子の保有数と、前記単一または複数のコンティグ配列が属するグループのグループ情報であって系統情報に相当するものと、を含んでもよく、前記検索手段は、設定されたグループ情報で特定されるグループが共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記グループ以外の全てのコンティグ配列と全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索してもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記設定されたグループ情報は、完全性を有するコンティグ配列が属するグループのグループ情報でもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記完全性は、単一コピー遺伝子セットの保有率とコンタミネーション率で定義されるものでもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記グループ情報は、塩基組成とデータカバレッジに関する情報を基に前記複数のコンティグ配列のビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）を行った結果得られたビン（ｂｉｎ）の識別情報でもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記検索手段は、前記保有率が最下位の遺伝子を検索してもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索装置において、前記微生物は、細菌、ウイルスまたは真菌でもよい。
また、本発明に係る遺伝子検索方法は、制御部を備える情報処理装置において実行される、核酸プローブ設計を支援するための遺伝子検索方法であって、所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、前記所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子情報にアクセス可能な前記情報処理装置の前記制御部において実行される、設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する検索ステップを含む。
また、本発明に係る遺伝子検索プログラムは、制御部を備える情報処理装置において実行させるための、核酸プローブ設計を支援するための遺伝子検索プログラムであって、所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、前記所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子情報にアクセス可能な前記情報処理装置の前記制御部において実行させるための、設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する検索ステップを含む。
本発明は、対象となる微生物種等の情報を設定するだけで当該対象に特異的な遺伝子情報を検索することができ、延いては、微生物検出に最適な核酸プローブを簡易に設計可能とすることに貢献する、という効果を奏する。
以下に、本発明に係る遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラムの実施形態を、図面を参照して説明する。なお、本実施形態により本発明が限定されるものではない。
図１は、遺伝子検索装置１００の構成の一例を示すブロック図である。遺伝子検索装置１４は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等の当該装置を統括的に制御する制御部１０２と、当該装置を有線または無線の通信回線を介してインターネットなどのネットワーク３００に通信可能に接続する通信インターフェース部１０４と、各種のデータベース、テーブルまたはファイルなどを記憶可能な記憶部１０６と、入力装置１１２および出力装置１１４に接続する入出力インターフェース部１０８と、を備える。遺伝子検索装置１００が備える各部は、任意の通信路を介して通信可能に接続される。
入力装置１１２には、キーボード、マウスまたはマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニタ、または、タッチパネルなどを用いることができる。出力装置１１４には、モニタの他、スピーカまたはプリンタなどを用いることができる。
記憶部１０６は、ストレージ手段である。記憶部１０６として、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）・ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、または光ディスク等を用いることができる。記憶部１０６には、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）と協働してＣＰＵに命令を与えて各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されていてもよい。
記憶部１０６は、例えば、保有遺伝子データテーブル１０６ａ（本発明の保有遺伝子情報に相当）などを格納する。保有遺伝子データテーブル１０６ａは、例えば、遺伝子検索装置１００がネットワーク３００を介してアクセス可能な外部ＤＢ（データベース）２００に格納されてもよい。
図２は、保有遺伝子データテーブル１０６ａの一例を示す図である。保有遺伝子データテーブル１０６ａには、所定の複数の微生物（株）のそれぞれに対応する微生物レコードが格納されている。各々の微生物レコードには、微生物識別情報と、微生物識別情報で特定される微生物における所定の複数の遺伝子のそれぞれの保有数と、微生物識別情報で特定される微生物の系統情報が格納されている。各々の微生物レコードには、所定の複数の遺伝子のそれぞれに対応する遺伝子識別情報と保有数が格納されている。
微生物は、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌などである。微生物識別情報は、例えば、微生物名または微生物ＩＤなどである。微生物識別情報で特定される微生物における所定の複数の遺伝子のそれぞれの保有数とは、具体的には、微生物識別情報で特定される微生物の全ゲノム配列が所定の複数の遺伝子領域配列のそれぞれを保有する数である。遺伝子検索装置１００は、当該保有数を集計する情報処理機能を備えてもよい。遺伝子識別情報は、例えば遺伝子名または遺伝子ＩＤなどである。系統情報は、例えば、生物種名または生物種ＩＤなどである。
所定の複数の微生物および系統情報は、公共のデータベース（例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が公開しているゲノムデータベースまたはＮＣＢＩが公開しているＴａｘｏｎｏｍｙデータベースなど）または全ゲノム解析結果から取得されたものでもよい。遺伝子検索装置１００は、当該取得を実行する情報処理機能を備えてもよい。
所定の複数の遺伝子は、公共のデータベース（例えばＮＣＢＩが公開しているゲノムデータベースなど）または全ゲノム解析結果に登録されている、所定の複数の微生物の全ゲノム配列から、各全ゲノム配列上の遺伝子領域配列を予測し、予測した各遺伝子領域配列の機能アノテーションを行うことによって決定されたものでもよい。予測した各遺伝子領域配列の機能アノテーションは、例えば、予測した各遺伝子領域配列と公共のデータベース（例えばＫＯ（ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ） Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベースなど）に登録されている遺伝子領域配列との相同性検索の結果に基づく機能アノテーションでもよい。遺伝子検索装置１００は、当該予測および当該機能アノテーションを実行する情報処理機能を備えてもよい。
保有遺伝子データテーブル１０６ａには、さらに、メタゲノム解析を行うことによって得られた微生物叢由来の単一または複数のコンティグ配列のそれぞれに対応するコンティグ配列レコードが格納されていてもよい。各々のコンティグ配列レコードには、コンティグ配列識別情報と、コンティグ配列識別情報で特定されるコンティグ配列における所定の複数の遺伝子のそれぞれの保有数と、コンティグ配列識別情報で特定されるコンティグ配列が属するグループのグループ情報であって系統情報に相当するものと、が格納されている。
コンティグ配列識別情報は、例えば、コンティグ配列に付与された配列名または配列ＩＤなどである。コンティグ配列識別情報で特定されるコンティグ配列における所定の複数の遺伝子のそれぞれの保有数とは、具体的には、コンティグ配列識別情報で特定されるコンティグ配列が所定の複数の遺伝子領域配列のそれぞれを保有する数である。遺伝子検索装置１００は、当該保有数を集計する情報処理機能を備えてもよい。
グループ情報は、グループを識別するための識別情報（例えばグループ名またはグループＩＤ）であり、例えば、塩基組成とデータカバレッジに関する情報を基に複数のコンティグ配列のビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）を行った結果得られたビン（ｂｉｎ）の識別情報（例えばｂｉｎ名またはｂｉｎＩＤなど）などである。遺伝子検索装置１００は、当該ビニングを実行する情報処理機能を備えてもよい。
制御部１０２は、ＯＳ等の制御プログラム・各種の処理手順等を規定したプログラム・所要データなどを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の情報処理を実行する。制御部１０２は、検索部１０２ａを備える。
検索部１０２ａは、「オペレータにより設定された系統情報に紐付く微生物」（検出対象）が共通して保有し、且つ、「保有遺伝子データテーブル１０６ａで管理されている、当該微生物以外の全ての微生物」（非検出対象）における保有率が下位の遺伝子を、保有遺伝子データテーブル１０６ａから検索し、当該検索した遺伝子に関する情報（例えば遺伝子識別情報と保有率など）を出力装置１１４に出力する。
検索部１０２ａは、「オペレータにより設定されたグループ情報で特定されるグループ」（検出対象）が共通して保有し、且つ、「保有遺伝子データテーブル１０６ａで管理されている、当該グループ以外の全てのコンティグ配列と全ての微生物」（非検出対象）における保有率が下位の遺伝子を、保有遺伝子データテーブル１０６から検索してもよい。
設定されたグループ情報は、例えば、完全性を有するコンティグ配列が属するグループのグループ情報などでもよい。完全性は、例えば、所定値（例えば９５％など）以上または超の単一コピー遺伝子セットの保有率と所定値（例えば５％など）以下または未満のコンタミネーション率で定義されるものなどでもよい。遺伝子検索装置１００は、当該完全性の確認を実行する情報処理機能を備えてもよい。
検索部１０２ａは、保有率がオペレータにより設定された所定値以下または未満の遺伝子を検索してもよい。所定値は、例えば、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１などといった小さな値を設定しておくのが好ましいが、例示したこれらの値に限定されるものではない。
検索部１０２ａは、保有率が最下位の遺伝子を検索してもよい。
実施例１では、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）という細菌に特異的な遺伝子を遺伝子検索装置１００で検索し、当該検索した遺伝子を対象にプライマーを設計し、当該設計したプライマーを用いて当該遺伝子が実際に検出できるかを検証した。検証は、以下の工程（工程１１〜１３）で行った。
［工程１１．公共データベースを用いてデータテーブルを作成する工程］
以下の手順（手順１１１〜１１７）で保有遺伝子データテーブルを作成した。なお、図２に示した保有遺伝子データテーブルは、以下の手順で実際に作成されたものである。
以下の手順（手順１１１〜１１７）で保有遺伝子データテーブルを作成した。なお、図２に示した保有遺伝子データテーブルは、以下の手順で実際に作成されたものである。
［手順１１１］ＮＣＢＩが公開しているゲノムデータベースから、計１１，５９６株の微生物の全ゲノム配列をダウンロードした。
［手順１１２］遺伝子予測ソフトウェア「Ｐｒｏｋｋａ」を用いて、ダウンロードした各全ゲノム配列上における遺伝子領域配列を予測した。これにより、計１１，５９６件の全ゲノム配列のそれぞれに対し、遺伝子領域が紐付けられた。
［手順１１３］相同性検索ソフトウェア「ＤＩＡＭＯＮＤ」を用いて、予測した各遺伝子領域の配列の相同性検索を、遺伝子配列データベース「ＫＯ（ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベース」に対し行うことによって、各遺伝子領域のアノテーションを行った。これにより、予測した全ての遺伝子領域のそれぞれに対し、機能分類が紐付けられた。
［手順１１４］各遺伝子領域の機能分類ごとに、遺伝子ＩＤを付与した。これにより、予測した全ての遺伝子領域のそれぞれに対し、遺伝子ＩＤが紐付けられた。
［手順１１５］ダウンロードした全ゲノム配列ごとに、付与した全ての遺伝子ＩＤのそれぞれの保有数を集計した。
［手順１１６］ＮＣＢＩが公開しているＴａｘｏｎｏｍｙデータベースを参照して、ダウンロードした全ゲノム配列ごとに系統情報（生物種名）を付与した。
［手順１１７］ダウンロードした各全ゲノム配列についての、集計した各遺伝子ＩＤの保有数と付与した系統情報とを含む保有遺伝子データテーブルを作成した。
［工程１２．Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子領域を抽出する工程］
以下の手順（手順１２１〜１２５）でＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子領域を抽出した。
以下の手順（手順１２１〜１２５）でＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子領域を抽出した。
［手順１２１］工程１１で作成した保有遺伝子データテーブルを記憶する遺伝子検索装置１００を用いて、検出対象となる「Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの全ての株」が共通して保有し、且つ、非検出対象となる「保有遺伝子データテーブルで管理されている、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ以外の全ての微生物」の保有率が０．００５未満の遺伝子ＩＤを検索した。検索結果を表１に示す。なお、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの株はＮＣＢＩのゲノムデータベース中に２つ存在した。
［手順１２２］検索した遺伝子ＩＤのうち非検出対象における保有率が最も低い遺伝子ＩＤ「Ｋ１０８００」に対応する遺伝子領域配列を、ダウンロードしたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの全ゲノム配列から抽出した。
［手順１２３］コンセンサス配列作成プログラム「ｃｏｎｓ」を用いて、遺伝子ＩＤ「Ｋ１０８００」に対応する抽出した遺伝子領域配列に対しコンセンサス配列を作成した。
［手順１２４］プライマー設計プログラム「Ｐｒｉｍｅｒ３」を用いて、作成したコンセンサス配列に対しプライマー配列セットを作成した。作成したフォワードプライマー配列は、「５’−ＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴ−３’」（配列番号１）であり、リバースプライマー配列は、「５’−ＡＴＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＧ−３’」（配列番号２）である。配列番号１の塩基配列は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ１０８００」）検出用のフォワードプライマーの塩基配列を示す。配列番号２の塩基配列は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ１０８００」）検出用のリバースプライマーの塩基配列を示す。
［手順１２５］相同性検索プログラム「Ｂｌａｓｔ＋」を用いて、設計したプライマー配列の相同性検索を、工程１１でダウンロードした計１１，５９６件の全ゲノム配列をデータベースとして行った。結果、設計したプライマー配列が前記非検出対象に存在しないことが確認された。
［工程１３．Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子を実験で検出する工程］
以下の手順（手順１３１〜１３４）でＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子を実験で検出した。
以下の手順（手順１３１〜１３４）でＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的な遺伝子を実験で検出した。
［手順１３１］Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の「ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」を用いて、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液（１５ｍＬ）、ヒト糞便１検体（約３ｍｇ）およびヒト唾液１検体（約１ｍＬ）からＤＮＡを抽出した。Ｑｉａｇｅｎ社製の「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」を用いて、ヒト全血１検体（約２００μＬ）からＤＮＡを抽出した。
［手順１３２］抽出した各ＤＮＡを用いて、１０μＬのＰＣＲ反応溶液を調製した。反応溶液の成分は以下の通りである。以下に列挙した計１０の反応溶液を調製した。
＜反応溶液の成分＞
・抽出したＤＮＡ：１μＬ
・Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製の「ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」：５μＬ
・１０μＭに調製されたフォワードプライマー（配列番号１）：０．５μＬ
・１０μＭに調製されたリバースプライマー（配列番号２）：０．５μＬ
・精製水：３μＬ
＜反応溶液の成分＞
・抽出したＤＮＡ：１μＬ
・Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製の「ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」：５μＬ
・１０μＭに調製されたフォワードプライマー（配列番号１）：０．５μＬ
・１０μＭに調製されたリバースプライマー（配列番号２）：０．５μＬ
・精製水：３μＬ
＜調製した反応溶液＞
・Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡを用いた反応溶液１
・血液由来のＤＮＡを用いた反応溶液２
・血液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．０１％混合された反応溶液３
・血液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．１％混合された反応溶液４
・糞便由来のＤＮＡを用いた反応溶液５
・糞便由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．０１％混合された反応溶液６
・糞便由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．１％混合された反応溶液７
・唾液由来のＤＮＡを用いた反応溶液８
・唾液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．０１％混合された反応溶液９
・唾液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．１％混合された反応溶液１０
・Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡを用いた反応溶液１
・血液由来のＤＮＡを用いた反応溶液２
・血液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．０１％混合された反応溶液３
・血液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．１％混合された反応溶液４
・糞便由来のＤＮＡを用いた反応溶液５
・糞便由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．０１％混合された反応溶液６
・糞便由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．１％混合された反応溶液７
・唾液由来のＤＮＡを用いた反応溶液８
・唾液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．０１％混合された反応溶液９
・唾液由来のＤＮＡを用いた反応溶液にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの菌培養液由来のＤＮＡが０．１％混合された反応溶液１０
［手順１３３］調製したＰＣＲ反応溶液を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のサーマルサイクラー「Ｖｅｒｉｔｉ」を用いた。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で３０秒のインキュベーションを行った後、９８℃１０秒の熱変性、６５℃１５秒のアニーリングおよび７２℃３０秒の伸長反応を３５サイクル行うというものである。
［手順１３４］増幅産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の全自動ハイスループット電気泳動システム「Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ」の「Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ」を用いて解析した。解析結果を図３に示す。図３において、「Ｌ」はラダーを示し、「Ａｍ」は反応溶液１から得られた増幅産物の検出結果を示す。図３において、「Ｂｌ」は反応溶液２から得られた増幅産物の検出結果を示し、「Ｂｌ＋０．０１％Ａｍ」は、反応溶液３から得られた増幅産物の検出結果を示し、「Ｂｌ＋０．１％Ａｍ」は、反応溶液４から得られた増幅産物の検出結果を示す。図３において、「Ｓｔ」は反応溶液５から得られた増幅産物の検出結果を示し、「Ｓｔ＋０．０１％Ａｍ」は、反応溶液６から得られた増幅産物の検出結果を示し、「Ｓｔ＋０．１％Ａｍ」は、反応溶液７から得られた増幅産物の検出結果を示す。図３において、「Ｓａ」は反応溶液８から得られた増幅産物の検出結果を示し、「Ｓａ＋０．０１％Ａｍ」は、反応溶液９から得られた増幅産物の検出結果を示し、「Ｓａ＋０．１％Ａｍ」は、反応溶液１０から得られた増幅産物の検出結果を示す。
実施例１により、遺伝子検索装置１００で検索した遺伝子を対象に設計したプライマーで、対象となる菌が実際に検出できること、および、ヒトゲノムサンプルや多様な菌が存在するメタゲノムサンプルでは、当該プライマーで、対象となる菌が検出されないこと、が確認された。
実施例２では、メタゲノムサンプルを対象として、メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子を遺伝子検索装置１００で検索し、当該検索した遺伝子を対象にプライマーを設計し、当該設計したプライマーを用いて当該遺伝子が実際に検出できるかを検証した。検証は、以下の工程（工程２１〜２４）で行った。
［工程２１．メタゲノム解析結果からデータテーブルを作成する工程］
以下の手順（手順２１１〜２１８）で保有遺伝子データテーブルを作成した。
以下の手順（手順２１１〜２１８）で保有遺伝子データテーブルを作成した。
［手順２１１］Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の「ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」を用いて、ヒト糞便５検体（それぞれ約３ｍｇ）からＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｐｌｅ１〜Ｓａｍｐｌｅ５）。Ｑｉａｇｅｎ社製の「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」を用いて、ヒト全血１検体（約２００μＬ）からＤＮＡを抽出した。
［手順２１２］抽出したＤＮＡのうちＳａｍｐｌｅ１のＤＮＡとＳａｍｐｌｅ２のＤＮＡについて、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製の「Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ ｋｉｔ」を用いて、シーケンシング解析用のライブラリーの調製を行った。
［手順２１３］ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＮｅｘｔＳｅｑを用いて、調製したライブラリーのショットガンシーケンシング解析を行った。
［手順２１４］ゲノムアセンブラー「ＳＰＡｄｅｓ」を用いて、手順２１３で取得した配列情報のアセンブル解析を行った。
［手順２１５］ｂｉｎｎｉｎｇソフトウェア「ＭｅｔａＢＡＴ２」を用いて、ｂｉｎｎｉｎｇを行った。具体的には、塩基組成やデータカバレッジの情報を基に、同じ生物由来と考えられるコンティグ配列をグルーピングした。
［手順２１６］ｂｉｎｎｉｎｇで生成されたグループを１単位として、グループごとに、手順１１２〜１１５と同様の手順を実施した。
［手順２１７］コンティグ配列ごとに、該当するグループを特定するための任意のＩＤ（ｂｉｎ名）を系統情報として付与した。
［手順２１８］各グループについての、集計した各遺伝子ＩＤの保有数と付与した系統情報とを含むレコードを、工程１１で作成した保有遺伝子データテーブルに結合した。
［工程２２．メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子領域を抽出する工程］
以下の手順（手順２２１〜２２６）で、メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子領域を抽出した。
以下の手順（手順２２１〜２２６）で、メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子領域を抽出した。
［手順２２１］完全性評価ソフトウェア「ＣｈｅｃｋＭ」を用いて、工程２１で取得した全てのグループの完全性の評価を行い、完全性が９５％以上で且つコンタミネーション率が５％以下のコンティグ配列のみをプライマーの設計対象に選んだ。選ばれた各グループのうち、Ｓａｍｐｌｅ１由来のグループに付与されているｂｉｎ名は、ｂｉｎ．３３、ｂｉｎ．１３、ｂｉｎ．４３およびｂｉｎ．１８であり、Ｓａｍｐｌｅ２由来のグループに付与されているｂｉｎ名は、ｂｉｎ．１４、ｂｉｎ．１８、ｂｉｎ．５２およびｂｉｎ．１１であった。
［手順２２２］手順２２１で得た８個のｂｉｎ名のそれぞれに対し、以下の検索処理を実行して、ｂｉｎ名ごとに遺伝子ＩＤを検索した。
＜検索処理＞
結合後の保有遺伝子データテーブルを記憶する遺伝子検索装置１００を用いて、検出対象となる「ｂｉｎ名で特定されるグループ」が保有し、且つ、非検出対象となる「保有遺伝子データテーブルで管理されている、当該ｂｉｎ名で特定されるグループ以外の全てのコンティグ配列と全ての微生物」の保有率が０．０５未満の遺伝子ＩＤを検索する。
＜検索処理＞
結合後の保有遺伝子データテーブルを記憶する遺伝子検索装置１００を用いて、検出対象となる「ｂｉｎ名で特定されるグループ」が保有し、且つ、非検出対象となる「保有遺伝子データテーブルで管理されている、当該ｂｉｎ名で特定されるグループ以外の全てのコンティグ配列と全ての微生物」の保有率が０．０５未満の遺伝子ＩＤを検索する。
［手順２２３］前記８個のｂｉｎ名のそれぞれに対し、手順２２２で検索した遺伝子ＩＤのうち非検出対象における保有率が最も低い遺伝子ＩＤの選択をさらに行い、当該選択した各遺伝子ＩＤに対応する遺伝子領域配列を、各ｂｉｎ名に紐付くコンティグ配列から抽出した。前記８個のｂｉｎ名のそれぞれに対応する、手順２２３で選択した遺伝子ＩＤを表２に示す。
［手順２２４］プライマー設計プログラム「Ｐｒｉｍｅｒ３」を用いて、前記８個のｂｉｎ名のそれぞれに対応する、手順２２３で抽出した遺伝子領域配列に対し、プライマー配列セットを作成した。前記８個のｂｉｎ名のそれぞれに対応する、作成したプライマー配列セットを表３に示す。
配列番号３，４の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．１３」に対応する菌種に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ２２３３０」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。配列番号５，６の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．１８」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ１５３０３」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。配列番号７，８の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．３３」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ０５９４２」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。配列番号９，１０の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．４３」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ０５９４２」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号１１，１２の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．１１」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ１５０２２」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。配列番号１３，１４の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．１４」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ１８２０５」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。配列番号１５，１６の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．１８」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ２２３４０」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。配列番号１７，１８の塩基配列は、メタゲノム中のｂｉｎ名「ｂｉｎ．５２」に対応する菌に特異的な遺伝子ＩＤ「Ｋ２２６０７」に対応する遺伝子を検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列である。
［手順２２５］相同性検索プログラム「Ｂｌａｓｔ＋」を用いて、前記８個のｂｉｎ名のそれぞれに対応する設計したプライマー配列の相同性検索を、工程２１で得た全てのコンティグ配列と工程１１でダウンロードした計１１，５９６件の全ゲノム配列をデータベースとして行った。その結果、設計したプライマー配列が前記非検出対象に存在しないことが確認された。
［工程２３．メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子を実験で検出する工程］
以下の手順（手順２３１〜２３３）で、メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子を実験で検出した。
以下の手順（手順２３１〜２３３）で、メタゲノム中の個別の菌種ごとに特異的な遺伝子を実験で検出した。
［手順２３１］手順２１１で抽出したＤＮＡを用いて、１０μＬのＰＣＲ反応溶液を調製した。反応溶液の成分は以下の通りである。以下に列挙した計４８の反応溶液を調製した。
＜反応溶液の成分＞
・抽出したＤＮＡ：１μＬ
・Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製の「ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」：５μＬ
・１０μＭに調製されたフォワードプライマー（表３に示す配列）：０．５μＬ
・１０μＭに調製されたリバースプライマー（表３に示す配列）：０．５μＬ
・精製水：３μＬ
＜反応溶液の成分＞
・抽出したＤＮＡ：１μＬ
・Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製の「ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」：５μＬ
・１０μＭに調製されたフォワードプライマー（表３に示す配列）：０．５μＬ
・１０μＭに調製されたリバースプライマー（表３に示す配列）：０．５μＬ
・精製水：３μＬ
＜調製した反応溶液＞
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液１
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液２
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液３
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液４
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液５
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液６
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液１
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液２
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液３
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液４
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液５
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液６
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液７
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液８
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液９
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液１０
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液１１
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液１２
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液８
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液９
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液１０
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液１１
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液１２
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１３
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセット用いた反応溶液１４
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１５
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１６
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１７
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１８
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセット用いた反応溶液１４
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１５
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１６
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１７
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１８
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液１９
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセット用いた反応溶液２０
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２１
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２２
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２３
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２４
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセット用いた反応溶液２０
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２１
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２２
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２３
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液２４
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２５
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセット用いた反応溶液２６
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２７
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２８
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２９
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液３０
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセット用いた反応溶液２６
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２７
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２８
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液２９
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液３０
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３１
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３２
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３３
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３４
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３５
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３６
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３２
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３３
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３４
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３５
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液３６
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液３７
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液３８
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液３９
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液４０
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液４１
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液４２
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液３８
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液３９
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液４０
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液４１
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液４２
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４３
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４４
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４５
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶４６
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４７
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４８
・Ｓａｍｐｌｅ３由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４４
・Ｓａｍｐｌｅ４由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４５
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶４６
・Ｓａｍｐｌｅ５由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４７
・血液由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液４８
［手順２３２］調製したＰＣＲ反応溶液を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のサーマルサイクラー「Ｖｅｒｉｔｉ」を用いた。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で３０秒のインキュベーションを行った後、９８℃１０秒の熱変性、６５℃１５秒のアニーリングおよび７２℃３０秒の伸長反応を３５サイクル行うというものである。
［手順２３３］増幅産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の全自動ハイスループット電気泳動システム「Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ」の「Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ」を用いて解析した。解析結果を図４に示す。図４において、上段には、反応溶液１〜２４のそれぞれから得られた増幅産物の検出結果を左から順に示し、下段には、反応溶液２５〜４８のそれぞれから得られた増幅産物の検出結果を左から順に示す。図４において、「Ｌ」はラダーを示す。
［工程２４：メタゲノム中の特異的な遺伝子の定量解析を行う工程］
以下の手順（手順２４１〜２４３）で、メタゲノム中の特異的な遺伝子の定量解析を行った。
以下の手順（手順２４１〜２４３）で、メタゲノム中の特異的な遺伝子の定量解析を行った。
［手順２４１］抽出したＳａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとＳａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡを用いて、２０μＬの定量ＰＣＲ反応溶液を調製した。反応溶液の成分は以下の通りである。以下に列挙した計８の反応溶液を調製した。
＜反応溶液の成分＞
・テンプレートＤＮＡ：１μＬ
・Ｔｏｙｏｂｏ社製の「２ｘ ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ」：１０μＬ
・１０μＭに調製されたフォワードプライマー（表３に示す配列）：１μＬ
・１０μＭに調製されたリバースプライマー（表３に示す配列）：１μＬ
・ＲＯＸ：０．４μＬ
・精製水：６．６μＬ
＜反応溶液の成分＞
・テンプレートＤＮＡ：１μＬ
・Ｔｏｙｏｂｏ社製の「２ｘ ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ」：１０μＬ
・１０μＭに調製されたフォワードプライマー（表３に示す配列）：１μＬ
・１０μＭに調製されたリバースプライマー（表３に示す配列）：１μＬ
・ＲＯＸ：０．４μＬ
・精製水：６．６μＬ
＜調製した反応溶液＞
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液１
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液２
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液３
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液４
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液５
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液６
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液７
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液８
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１３．Ｋ２２３３０」のプライマーセットを用いた反応溶液１
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ１５３０３」のプライマーセットを用いた反応溶液２
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．３３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液３
・Ｓａｍｐｌｅ１由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．４３．Ｋ０５９４２」のプライマーセットを用いた反応溶液４
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１１．Ｋ１５０２２」のプライマーセットを用いた反応溶液５
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１４．Ｋ１８２０５」のプライマーセットを用いた反応溶液６
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．１８．Ｋ２２３４０」のプライマーセットを用いた反応溶液７
・Ｓａｍｐｌｅ２由来のＤＮＡとプライマーセットＩＤ「ｂｉｎ．５２．Ｋ２２６０７」のプライマーセットを用いた反応溶液８
［手順２４２］調製した定量ＰＣＲ反応溶液を用いて定量ＰＣＲを実施した。定量ＰＣＲには、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の「Ｍｘ３００５Ｐ」を用いた。定量ＰＣＲ反応条件は、９８℃で２分のインキュベーションを行った後、９８℃１０秒の熱変性、６０℃１０秒のアニーリング、６８℃３０秒の伸長反応を４０サイクル行うというものである。
［手順２４３］取得したデータからΔＣｔ法で相対定量値を算出し、算出結果をショットガンシーケンシングで得られた定量結果と比較した。比較結果を図５に示す。定量ＰＣＲは３回の独立した実験で実施した。１回の実験内では２個のテクニカルレプリケートで実施し、平均値を解析に用いた。想定定量値は、個々のサンプルの定量値を図５に示すグラフ一番左の定量値で標準化して算出した。図５において、白色のグラフはｑＰＣＲの定量値を示し、黒色のグラフは、ショットガンシーケンシングの定量値を示す。図５において、白色のグラフ内のドットは、１回の実験での平均値を示す。
実施例２により、遺伝子検索装置１００で検索した遺伝子を対象に設計したプライマーで、対象となる菌が実際に検出できること、および、当該設計したプライマーで、ショットガン解析とほぼ同等の定量解析が実施可能であること、が確認された。
本発明は、例えば、核酸プローブ設計に有用である。
１００ 遺伝子検索装置
１０２ 制御部
１０２a 検索部
１０４ 通信インターフェース部
１０６ 記憶部
１０６a 保有遺伝子データテーブル
１０８ 入出力インターフェース部
１０２ 制御部
１０２a 検索部
１０４ 通信インターフェース部
１０６ 記憶部
１０６a 保有遺伝子データテーブル
１０８ 入出力インターフェース部
Claims (10)
- 核酸プローブ設計を支援するための、制御部を備える遺伝子検索装置であって、
所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、前記所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子情報にアクセス可能であり、
前記制御部は、設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する検索手段を備える、
遺伝子検索装置。 - 前記所定の複数の微生物および前記系統情報は、全ゲノム解析結果から得られたものであり、
前記所定の複数の遺伝子は、前記全ゲノム解析結果に登録されている前記所定の複数の微生物の全ゲノム配列から各全ゲノム配列上の遺伝子領域配列を予測し、前記予測した各遺伝子領域配列の機能アノテーションを行うことによって決定されたものである、
請求項１に記載の遺伝子検索装置。 - 前記保有遺伝子情報は、さらに、メタゲノム解析を行うことによって得られた微生物叢由来の単一または複数のコンティグ配列における前記所定の複数の遺伝子の保有数と、前記単一または複数のコンティグ配列が属するグループのグループ情報であって系統情報に相当するものと、を含み、
前記検索手段は、設定されたグループ情報で特定されるグループが共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記グループ以外の全てのコンティグ配列と全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する、
請求項１から３のいずれか１つに記載の遺伝子検索装置。 - 前記設定されたグループ情報は、完全性を有するコンティグ配列が属するグループのグループ情報である、請求項３に記載の遺伝子検索装置。
- 前記完全性は、単一コピー遺伝子セットの保有率とコンタミネーション率で定義されるものである、請求項４に記載の遺伝子検索装置。
- 前記グループ情報は、塩基組成とデータカバレッジに関する情報を基に前記複数のコンティグ配列のビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）を行った結果得られたビン（ｂｉｎ）の識別情報である、請求項３から５のいずれか１つに記載の遺伝子検索装置。
- 前記検索手段は、前記保有率が最下位の遺伝子を検索する、請求項１から６のいずれか１つに記載の遺伝子検索装置。
- 前記微生物は、細菌、ウイルスまたは真菌である、請求項１から７のいずれか１つに記載の遺伝子検索装置。
- 制御部を備える情報処理装置において実行される、核酸プローブ設計を支援するための遺伝子検索方法であって、
所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、前記所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子情報にアクセス可能な前記情報処理装置の前記制御部において実行される、
設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する検索ステップを含む、
遺伝子検索方法。 - 制御部を備える情報処理装置において実行させるための、核酸プローブ設計を支援するための遺伝子検索プログラムであって、
所定の複数の微生物における所定の複数の遺伝子の保有数と、前記所定の複数の微生物の系統情報と、を含む保有遺伝子情報にアクセス可能な前記情報処理装置の前記制御部において実行させるための、
設定された系統情報に紐付く微生物が共通して保有し、且つ、前記保有遺伝子情報で管理されている、前記微生物以外の全ての微生物における保有率が下位の遺伝子を、前記保有遺伝子情報から検索する検索ステップを含む、
遺伝子検索プログラム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020104040A JP2021193963A (ja) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | 遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020104040A JP2021193963A (ja) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | 遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラム |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021193963A true JP2021193963A (ja) | 2021-12-27 |
Family
ID=79198049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020104040A Pending JP2021193963A (ja) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | 遺伝子検索装置、遺伝子検索方法および遺伝子検索プログラム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2021193963A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023204008A1 (ja) * | 2022-04-21 | 2023-10-26 | 株式会社島津製作所 | 微生物判別用のデータベースを構築する方法および装置 |
-
2020
- 2020-06-16 JP JP2020104040A patent/JP2021193963A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023204008A1 (ja) * | 2022-04-21 | 2023-10-26 | 株式会社島津製作所 | 微生物判別用のデータベースを構築する方法および装置 |
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