JP5077984B2 - 穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法 - Google Patents

Description

本発明は、カビの検出方法、それに用いるマイクロアレイ及びカビ検出用キットを用いて、穀類又はナッツ類の中のマイコトキシンを生成するカビ類を網羅的に検出し、穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法に関する。

特定の生物種を迅速に検出する方法として、従来、ＰＣＲとＤＮＡプローブを用いた方法が実施されている。この方法は、例えば、まず、特定生物種のゲノム塩基配列のうち、前記生物種に特異的な配列からなるプローブを準備し、次に、被検試料に含まれる核酸からＰＣＲによって前記プローブの相補配列を含み、検出可能な標識化合物で標識されたターゲットを準備し、そして、前記プローブと前記ターゲットとをハイブリダイズして前記プローブとハイブリダイズしたターゲットの標識シグナルを測定し、前記生物種を検出する方法である。そして、この方法には、ＤＮＡプローブが基板上に固定化されたマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいう）が利用され、１回のハイブリダイゼーションで、複数種類の生物種について検出することが可能となっている。

上記生物種の検出方法の問題点として、例えば、偽陽性の問題が挙げられる。すなわち、多くの生物種のゲノム塩基配列が決定されつつあるといっても、地球上の生物種全体から見れば、現段階では、そのほとんどのゲノム塩基配列が不明のままといえる。

そうすると、例えば、研究室外の試料を対象に前記検出方法を試みて、ある生物種のプローブに対してターゲットのシグナルが検出されたとしても、そのシグナルがクロスハイブリダイゼーションによる偽陽性である可能性が、技術的限界として常に存在する。

この問題を解決する方法として、例えば、競合ハイブリダイゼーション法（非特許文献１及び２参照）や、改変ヌクレオチドを含むブロッキング剤を利用する方法（特許文献１参照)が開示されている。

しかしながら、これらの方法であっても、プローブ配列と同一又は相同性の高い配列を含む偽陽性ターゲットのクロスハイブリダイゼーションを排除することは困難という問題がある。

上記生物種の検出方法のその他の問題点として、例えば、定量性の問題がある。すなわち、マクロアレイを用いた定量方法としては、例えば、内部標準や外部標準を用いる方法が開示されているが（特許文献２参照）、多数の生物種を同時に検出する場合に生じる前記クロスハイブリダイゼーションに起因する定量の不確定性は、解決されていない。

特に、食品中の有害なカビ類を多数検出する方法は、例えば、輸入食品等の網羅的検査に期待されている。これは、あらかじめ感染することがわかっている食品以外にも、地球温暖化の影響で新たな宿主が発生した場合に、速やかにカビの感染を網羅的に検出・定量できるようになる。

マイコトキシンのような有害な化学物質を生産するカビの検出・同定には、未だに専門知識が必要とされる平板培養後の形態観察や一部分のDNA配列解析からの同定などが行われ、数日を要しながらも実際には正確な判断が出来ない場合も多い。また、従来法では定量的な問題にはほとんど答えることが出来なかった。

ここで、マイコトキシンとは、カビが生産する有害な化合物であり、大量摂取で引き起こされる急性毒性による臓器障害や少量・長期摂取による発ガン等人間の健康に重大な害をもたらすことは広く知られている。

近年、リンゴジュースにおけるパツリンの混入が問題となり、今まで混入がないとされてきた食品にも有害なカビが検出される事例が見られるようになり、今後はさらなる適切な汚染の検出や防除策が強く求められる。

また、食品流通のグローバル化により、今まで日本人が消費した経験のない食品も広く入手が可能になってきており、これらの食品の安全性の確保は重要な課題である。現在ではマイコトキシンそのものの検査には、化学的測定法や免疫学的測定法などが使われ、その結果として汚染食品などの除去が実施されている。
特表２００５−５０２３４６号公報 特開２００４−２８６９５号公報 Oliveira, R et al. (2002) 『Competitive hybridization onspotted microarrays as a tool to conduct comparative genomic analyses ofXylella fastidiosa strains』 FEMS Microbiol. Let. 216: 15-21. Abecassis, V. et al. (2003) 『Microarray-Based Method forCombinatorial Library Sequence Mapping and Characterization』 BioTechniques 34: 1272-1279

しかしながら、カビの生育特性上、食中毒菌等とは異なり、水ぬれした部分など食品の一部分に限定して生育している場合があり、適切なサンプリングが容易ではないことが散見される。

また、化学物質そのものは増幅出来ないために、存在している微量のマイコトキシン（生産カビ）を見逃し、その後の流通過程でカビが増殖することにより重大な被害をもたらす可能性も指摘されている。

また、地球温暖化など環境の変化により、今まで汚染がないとされてきた作物に新たなマイコトキシン生産カビが寄生する可能性が十分に考えられる。この場合、特定のマイコトキシンによる汚染があると予測して行う化学的測定法や免疫学的測定法では汚染の検出が不可能である。

このような状況を鑑みた場合、今後はマイコトキシン量の検査そのものの微量化を図るよりも、マイコトキシン生産カビそのものを網羅的に検出・定量する方が、より現実的に予防という観点に立った食品安全行政に寄与できる方法であると考えられる。

そこで、本発明は、陽性か偽陽性かの判定が可能なカビの検出方法を用いて、穀類又はナッツ類の中のマイコトキシンを生成するカビ類を網羅的に検出し、穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明は、
穀類又はナッツ類の中のマイコトキシンを生成するカビ類を網羅的に検出し、穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法であって、
検出対象のカビに特異的な複数種類の検出用プローブのスポットが配置されたマイクロアレイを準備するマイクロアレイ準備工程と、
前記被検試料中の核酸から、第１の標識化合物で標識された検出用ターゲットを準備するターゲット準備工程と、
前記検出対象のカビの標準試料から、第２の標識化合物で標識された検出用リファレンスを準備するリファレンス準備工程と、
前記ターゲットと前記リファレンスとを混合して前記マイクロアレイにハイブリダイズし、前記スポットにおける第１及び第２の標識化合物の標識シグナルをそれぞれ測定する競合ハイブリダイゼーション工程と、
前記スポットにおける前記２つの標識シグナルの相関関係について、相関係数ｒの算出及び検定を行い、所定の有意水準で相関が肯定され、かつ、前記相関係数ｒの値が所定の値を超える場合に前記カビ類の検出を陽性と判定し、それ以外の場合を偽陽性と判定する判定工程とを含み、
前記ターゲット準備工程及び前記リファレンス準備工程におけるターゲット及びリファレンスの調製が、アシンメトリックＰＣＲ法又はＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により行われ、
前記判定工程の結果に基づき穀類又はナッツ類のマイコトキシン汚染の可能性を予測することを特徴とする
穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法の構成とした。

本発明者らは、マイクロアレイを用いて環境試料中のカビを検出する方法について鋭意研究を重ね、１種類のカビを検出するための検出用プローブスポットを複数種類配置することの利点に着目した。

従来技術においても検出の信頼性を高めるという観点から、例えば、１種類のカビにつき２〜３種類のプローブを配置することはあったが、具体的な偽陽性を排除する方法はなかった。

本発明者らは、より多くの種類及び数のプローブスポットを配置したマイクロアレイに、ターゲット及びリファレンスの競合ハイブリダイゼーションをすることで得られる標識シグナルの分布の相関関係に着目すれば、測定されたターゲットのシグナルが偽陽性か否かを判定できることを見出し本発明に到達した。

本発明であるカビの検出方法によれば、一部のプローブスポットにおいてターゲットの標識シグナルが強く測定された場合であっても、リファレンスの標識シグナルとの相関の有無を検定し、さらに、両者の正の相関の強さを示す相関係数ｒを算出して所定の値と比較することで、前記ターゲット標識シグナルが陽性か偽陽性かを判定できる。したがって、本発明によれば、簡便かつ迅速で信頼性がより向上したカビの検出方法が可能となる。

また、ターゲットの標識シグナルが弱い場合であっても、同様に、リファレンスの標識シグナルとの相関関係に基づき陽性か偽陽性かを判断して、偽陽性を排除できる。このように、本発明によれば、ターゲット標識シグナルの強弱に関わらず陽性・偽陽性の判断ができるから、より一層、検出感度や信頼性が向上した簡便かつ迅速なカビの検出方法が可能となる。

さらに、競合ハイブリダイゼーションにおいては、各スポットにおける標識シグナルのターゲット／リファレンス比は、両者の濃度比を反映するから、例えば、前記スキャタープロットにおける回帰直線の傾き（回帰係数）を利用して、ターゲットの定量が可能となる。したがって、本発明であるカビの検出方法によれば、簡便かつ迅速なカビの定量が可能となる。

さらにまた、本発明は、マイクロアレイを用いるから、複数種類のカビについて、一度に、カビの検出や定量をすることができる。

そして、本発明であるカビの検出方法を、例えば、穀物やナッツ類などを汚染しているカビの検出や定量に適用すれば、汚染環境中のカビの種類・存在量についての簡便かつ迅速で、信頼性が向上したモニタリングが可能となる。

本発明であるカビの検出方法は、前記被検試料における検出対象のカビの存在量を算出する定量工程を含み、前記定量工程が、前記スポットにおける前記２つの標識シグナルの回帰直線の傾き（回帰係数）ａを算出することを含むことが好ましい。

本発明であるカビの検出方法において、前記マイクロアレイ準備工程、ターゲット準備工程及びリファレンス準備工程が、それぞれ、内部標準プローブを配置すること、第１の標識化合物で標識された内部標準ターゲットを調製すること及び第２の標識化合物で標識された内部標準リファレンスを調製することを含み、前記判定工程が、検出用ターゲット及びリファレンス標識シグナルを、前記内部標準のシグナルに基づいて修正することを含むことが好ましい。

前記マイクロアレイ準備工程のマイクロアレイにおいて、前記検出用プローブのスポット数が、１種類の検出対象のカビにつき、６個以上であることが好ましい。

前記判定工程において、前記所定の有意水準が、２０％〜０．１％の範囲であり、前記相関係数の所定の値が、０．８〜０．９９の範囲であることが好ましい。

前記ターゲット準備工程及び前記リファレンス準備工程において、前記ターゲット及び前記リファレンスの調製が、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により行われることが好ましい。

本発明であるカビの検出方法は、検出対象のカビが、複数種類であってもよい。また、検出対象が、カビであって、前記検出用プローブが、前記カビのリボゾーム領域に由来するプローブであってもよい。

本発明であるカビの検出方法は、前記被検試料が、穀類やナッツ類などの食品から採取された試料であってもよい。

本発明のマイクロアレイは、本発明であるカビの検出方法に使用するマイクロアレイである。本発明であるカビ検出用キットは、本発明のマイクロアレイを含み、本発明であるカビの検出方法に使用するキットである。

本発明において、検出対象をカビとしたが、カビの他、動物、植物、カビ以外の微生物粘菌類、単細胞藻類、原生動物、ウイルスなどにも応用できる。

本発明において、「検出用プローブ」とは、検出対象のカビのゲノム領域に特異的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含むプローブである。前記検出用プローブの長さとしては、特に制限されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチドであって、２０〜１００ヌクレオチドが好ましく、より好ましくは４０〜８０ヌクレオチドである。複数のプローブ間で、プローブの長さは、同じでもよいし、異なっていてもよい。通常、プローブは、その長さが短くなるほど配列特異性が増し、信頼度が向上する。

プローブのポリヌクレオチドとしては、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等を使用できる。検出用プローブの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。

本発明では、前記検出用プローブをマイクロアレイとして利用するから、前記検出用プローブには、マイクロアレイの基板に固定するための修飾がされていてもよい。前記修飾は、使用するマイクロアレイ基板の種類に応じて従来公知のものを選択できるが、例えば、プローブのポリヌクレオチドの５’又は３’側のＣ（３〜７）アミノ化等が挙げられる。

前記検出用プローブの配列としては、検出対象のカビに特異的である従来公知の配列であってもよく、また、前記カビのゲノム配列に基づき設計しても良い。プローブ配列の設計方法は、特に制限されないが、例えば、従来公知のアルゴリズムやソフトウエアを利用することができる。

前記ソフトウエアとしては、例えば、ＰＲＩＭＲＯＳＥ ver.1.1.7(Kevin E.
Ashelford, Andrew J. Weightman andJohn C. Fry (2002) "PRIMROSE: a computer
program for generating and estimating the phylogenetic range of 16S rRNA
oligonucleotide probes and primers in conjunction with the RDP-II database
" Nucleic Acids Research, Vol. 30, No. 15 3481-3489）等が挙げられる。

プローブ設計における一般的な好ましい要件としては、例えば、ＧＣ含量（例えば、５０％）、長さ（例えば、４０〜８０ｎｔ）、ヘアピン構造をとらないこと、同じ塩基、Ａ＋Ｔ、又はＧ＋Ｃが連続して５つ以上並ばないこと、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ等の相同性検索で、同一又は９０％、９２.５％若しくは９５％以上の相同性を示すヒットがないこと、ミスマッチがプローブ中心部に近いこと、センス鎖の配列であること、遺伝子の末端部分であること、同時に検出するカビが複数種類ある場合には、少なくともそれらのカビ間でクロスハイブリダイゼーションしないこと等が挙げられる。

検出対象がカビである場合には、前記検出用プローブは、例えば、１６ＳｒＤＮＡやＩＴＳ領域に由来する配列を利用することができる。ＩＴＳ領域とは、カビゲノムの１６ＳリボゾーマルＤＮＡと２３ＳリボゾーマルＤＮＡとの間の転写を受ける領域（Internal Trancscribed Spacer）のことである。

カビのリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である１８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ及び５．８ＳｒＲＮＡは、通常、１つの転写単位（オペロン）として転写されるため、１８Ｓ、５．８、２８ＳｒＲＮＡ遺伝子は隣り合ってゲノム上に配置されている。この１８ＳｒＲＮＡ遺伝子と５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子との間の領域が、１８Ｓ-５．８Ｓ Internal Transcribed Spacer（ＩＴＳ１）、５．８Ｓ−２８Ｓ Internal Transcribed Spacerと呼ばれる領域である。

本発明において、「複数種類の検出用プローブ」とは、１種類の検出対象のカビに対して特異的な複数種類のプローブのことである。その種類の数としては、例えば、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類又はそれ以上であって、５種類以上が好ましく、その種類は、多いほどより好ましい。前記判定工程における偽陽性排除の信頼性が向上するからである。

また、同一マイクロアレイ上に、同一種類の検出用プローブのスポットを、例えば、２個、３個、４個、５個又はそれ以上重複させて配置してもよい。例えば、ある検出対象のカビの検出用プローブが５種類で、それぞれ３個重複させた場合、前記カビに対する検出用プローブのスポット数は、１５個となる。１種類の検出対象のカビに対して用いる検出用プローブのスポット数としては、例えば、６個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個又はそれ以上であって、９〜６０個が好ましく、そのスポット数は多いほどより好ましい。

本発明において、「プローブのスポットが配置されたマイクロアレイ」とは、基材と、前記基材の表面上に規則的に配置された前記プローブのスポットとを含むマイクロアレイをいう。

前記マイクロアレイの製造方法は、特に制限されず、例えば、プローブ溶解液を基材に微小滴下するインクジェット法や、半導体製造技術で用いられるフォトリソグラフィー法を応用した方法等の従来公知の方法を利用して製造できる。前記基材としては、特に制限されず、例えば、ガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。

本発明において、「検出用ターゲット」とは、被検試料中の核酸に基づき調製される、第１の標識化合物で標識されたポリヌクレオチドである。被検試料中に検出対象のカビが存在する場合には、前記検出用プローブの相補配列を含むポリヌクレオチドが検出用ターゲットとして調製され、前記マイクロアレイ上で前記プローブとハイブリダイズして、陽性の標識シグナルを示すこととなる。

前記核酸の調製方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。また、前記検出用ターゲットの調製方法としては、特に制限されないが、例えば、検出対象のカビのゲノムＤＮＡを鋳型としたランダムプライミング法、ＰＣＲ法、その他の遺伝子増幅法等が挙げられる。

これらの中でも、前記定量工程における定量性の観点からは、前記検出用ターゲットに含まれるポリヌクレオチドが、前記被検試料中の濃度に比例することが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーションの効率や感度の観点からは、前記検出用ターゲットは、二重鎖よりも、前記検出用プローブと相補的な単一鎖が多く占めることが好ましい。

これらを踏まえると、前記検出用ターゲットは、ランダムプライミング法や、アシンメトリックＰＣＲ法により調製されることが好ましい。

第１の標識化合物の標識化の方法は、特に制限されず、例えば、プライマーを予め標識化しておく方法や、標識化ヌクレオチドを用いる方法が挙げられるが、標識化ヌクレオチドの場合、取り込み時に偏りがあることから、標識化プライマーを用いる方法が好ましい。

本発明者らは、本発明であるカビの検出方法において、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法（Linear-After-The-Exponential-PCR;
Sanchez et al. (2004) PNAS, 101(7); 1933-1938）によりターゲット及びリファレンスを調製すると、従来のＰＣＲ法を用いる場合を比べて、約１０００倍も標識シグナルが上昇するという、予想を越える効果があることを見出した。

さらに、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法の最終増幅産物は、被検試料中の濃度に比例するから、定量性も良好である。すなわち、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法を用いる本発明であるカビの検出方法であれば、検出感度、定量性及び簡便性をより向上できる。

本発明において、「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法」とは、アシンメトリックＰＣＲ法を改良した方法をいう。アシンメトリックＰＣＲ法とは、１組のプライマーのモル比を、例えば、１００：１のように不均等にして、主に単一鎖ＤＮＡ産物を生成することを目的としたＰＣＲ法である。

ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法は、「Linear-After-The-Exponential」という名が示すとおり、対数増幅後に直線増幅を可能とする、すなわち、プラトーとならないＰＣＲ法である（Sanchez et al. (2004) PNAS,
101(7); 1933-1938）。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法のポイントは、プライマー設計であって、少ない方のプライマーのＴｍ値を、過剰な方のプライマーのＴｍ値以上とすることである。

前記Ｔｍ値の計算は、例えば、隣接法（Nearest Neighbor Method）により行うことが好ましく、例えば、前記ＰＲＩＭＲＯＳＥ等のソフトウェアにより計算できる。ただし、本発明における「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法」は、対数増幅後に直線増幅可能であって、主に単一鎖ＤＮＡ産物を生成することを目的としたものであれば、上記方法の制限されず、さらに改良されたＰＣＲ法を含む。

本発明において、「検出用リファレンス」とは、検出対象のカビの標準試料から調製される、第２の標識化合物で標識されたポリヌクレオチドである。その調製方法は、被検試料中の核酸に代えて前記標準試料を使用し、第１の標識化合物に代えて第２の標識化合物を使用する以外は、前記検出用ターゲットと同様の調製方法であることが好ましい。

前記検出用リファレンスは、前記検出用ターゲットと共に、前記マイクロアレイへの競合ハイブリダイゼーションに使用される。この「競合ハイブリダイゼーション」は、検出用ターゲットのクロスハイブリダイゼーションをブロッキングする役割を果たすのみならず、複数のプローブスポットにおける標識シグナルのターゲット/リファレンス比を提供することで、後述する統計処理により、従来の競合ハイブリダイゼーション法では排除できなかった偽陽性を排除し、さらに、検出対象のカビを定量することを可能とする。

前記「検出対象のカビの標準試料」とは、単離培養された既知細胞数の検出対象のカビ、又は、それから調製される核酸をいう。前記定量工程において、後述するように、前記検出用リファレンスに相当する前記標準試料の細胞数と、前記ターゲット/リファレンス比とから、検出対象のカビの細胞数を定量できる。複数のカビを検出する場合、それらの標準試料を混合して検出用リファレンスを調製しても良く、検出対象のカビごとに調製してもよい。

本発明において、「標識化合物」とは、特に制限されず、例えば、発光標識や放射性標識の化合物が挙げられる。前記発光標識としては、例えば、蛍光標識、生体発光標識、化学発光標識及び比色定量標識等が挙げられ、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等の蛍光標識化合物が好ましい。

市販の蛍光標識化合物としては、例えば、フルオレプライム（FluorePrime、アマシャムファルマシア社製）、フルオレダイト（Fluoredite、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）等の蛍光ホスホルアミダイト類が挙げられる。

第１と第２の標識化合物は、同一プローブスポットにおいて、混在しても互いに独立に標識シグナルが測定できる標識化合物であることが好ましい。例えば、蛍光標識化合物である場合、第１と第２の標識化合物は、励起波長及び蛍光波長が異なるものを選択することが好ましい。

本発明において、「内部標準プローブ」とは、第１標識化合物と第２標識化合物との標識シグナルを補正するためのものであって、前記検出用プローブとともにマイクロアレイに配置して使用できる。

競合ハイブリダイゼーションを行う場合に、例えば、あるスポットにおいて、検出用ターゲットと検出用リファレンスとが、１：１の割合で結合しても、測定される標識シグナルが、１：１とならない場合がある。そのような場合に備えて、同一内部標準試料から調製された既知数量の内部標準ターゲット及び内部標準リファレンスを、前記検出用ターゲット及び検出用リファレンスと共に同一マイクロアレイに対して競合ハイブリダイゼーションを行うことで、測定された標識シグナルを補正し、定量性を高めることができる。

内部標準プローブの配列は、マイクロアレイに含まれる検出用ターゲット及び検出用リファレンスとクロスハイブリダイゼーションを起こさないことが好ましく、例えば、ヒト、マウス等といった被検試料には存在しないことが明らかなカビ由来以外の配列を選択して使用することが挙げられる。

内部標準プローブの長さ及び調製方法は、特に制限されず、例えば、検出用プローブと同じである。また、内部標準ターゲット及び内部標準リファレンスの調製及び標識方法は、特に制限されず、例えば、検出用ターゲット及び検出用リファレンスと同じである。前記マイクロアレイにおける内部標準プローブの種類やスポット数は、特に制限されず、例えば、１種類の検出対象微生物に対する検出用プローブと同様の種類及びスポット数である。

本発明において、「被検試料」は、特に制限されず、例えば、食物や生体から採取される試料の他、土壌、地下水、池、海水等の環境から採取された試料であってもよい。

本発明において、「偽陽性」とは、検出対象のカビではない生物種に由来する検出用ターゲットが検出用プローブとクロスハイブリダイズし、ターゲットの標識シグナルが観察されることをいう。本発明であるカビの検出方法において、検出用ターゲットの標識シグナルが陽性か偽陽性かを判定する工程が、前記判定工程である。

次に、本発明であるカビの検出方法について説明する。

（マイクロアレイ準備工程）
まず、マイクロアレイ準備工程において、１種類又は複数種類の検出対象のカビに対する検出用プローブ、及び、必要に応じて前記内部標準プローブが基板上に配置されたマイクロアレイを準備する。

前記検出用プローブ及び内部標準プローブの調製方法、種類、スポット数は、前述のとおりである。前記マイクロアレイは、本発明のカビの検出方法を行う前に製造してもよく、又は、本発明のマイクロアレイ若しくは本発明のカビ検出用キットに含まれるマイクロアレイを使用してもよい。

（ターゲット準備工程）
つぎに、ターゲット準備工程において、被検試料中の核酸から、第１の標識化合物で標識された検出用ターゲットを準備する。また、必要に応じて、第１の標識化合物で標識された内部標準ターゲットを準備する。

これらのターゲットの調製方法は、前述のとおりである。前記被検試料中に検出対象以外のカビであって、検出対象のカビの検出用プローブと同一又は相同性が高い配列を有するカビが存在し、この配列が検出用ターゲットとして調製されると、クロスハイブリダイゼーションによる偽陽性のシグナルの原因となる。

本発明であるカビの検出方法では、前記クロスハイブリダイゼーション及び偽陽性は、後述する競合ハイブリダイゼーション工程及び判定工程により、抑制し除外することができる。

（リファレンス準備工程）
前記ターゲット準備工程と同時又は別個に、検出対象のカビの標準試料から、第２の標識化合物で標識された検出用リファレンスを準備する。また、必要に応じて、第２の標識化合物で標識された内部標準リファレンスを準備する。

これらリファレンスの調製方法は、ターゲットの調製方法と同様であることが好ましい。前記標準試料は、前述のとおり、既知数の検出対象のカビの細胞、又は、それから得られる核酸であることが好ましい。

（競合ハイブリダイゼーション工程）
つぎに、前記３つの準備工程で準備した前記検出用ターゲット及びリファレンス、並びに、必要に応じて前記内部標準ターゲット及びリファレンスを混合し、この混合物を前記マイクロアレイにハイブリダイズし、各スポットについて第１及び第２の標識シグナルをそれぞれ測定する工程である。

前記混合物に含まれるターゲット及びリファレンスは、それらの濃度に比例して各スポットにハイブリダイズし、各スポットにおけるターゲットとリファレンスの標識シグナルの分布は、正の相関関係を示し、また、その標識シグナルのターゲット/リファレンス比は、一定値を示すこととなる。この関係を利用して、後述するとおり、相関分析等により、偽陽性の排除及び検出対象のカビの定量が可能となる。

なお、前述の内部標準を利用する場合には、内部標準ターゲット及びリファレンスは、等量使用することが好ましい。等量であれば、標識シグナルの補正値を算出しやすいからである。

競合ハイブリダイゼーションの方法及び条件は、特に制限されず、従来公知の方法で行うことができ、当業者であれば、プローブ、ターゲット、ポリヌクレオチドの種類などによって、適宜調節できる。

一般的なハイブリダイゼーション方法及び条件としては、例えば、５×ＳＳＣ＋０．３％ＳＤＳ中でターゲット及びリファレンスを熱変性した後、マイクロアレイに添加し、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。

前記プローブとハイブリダイゼーションした前記ターゲット及びリファレンスの標識シグナルをそれぞれ検出し測定する方法は、特に制限されず、標識の種類に応じて、従来公知の方法又は装置により測定できる。

例えば、標識として蛍光標識を用いる場合、顕微鏡やスキャナー等を用いて自動的に検出、測定することができる。また、内部標準プローブを使用した場合であって、例えば、前述のように、内部標準ターゲットと内部標準リファレンスとを等量混合して使用した場合には、内部標準により得られた第１標識シグナルと第２標識シグナルとが等しくなるように、検出用ターゲット及びリファレンスの標識シグナルを補正することができる。

（判定工程）
最後に、判定工程により、検出対象のカビの検出を行う。すなわち、前記検出用ターゲット及び前記検出用リファレンスの標識シグナル分布の相関関係を評価するために、相関係数ｒの算出及び検定を行い、所定の有意水準で相関が肯定され、かつ、前記相関係数ｒの値が所定の値を超える場合に陽性と判定し、それ以外の場合を偽陽性と判定し、陽性であれば、前記検出対象のカビが検出されたとする。前記判定工程は、具体的には、以下のとおりに行うことができる。

まず、前記「相関係数ｒ」は、ピアソンの積率相関係数として、２つの変数ｘ、ｙについて、式：ｒ＝Ｃｏｖ(ｘ,ｙ)／Ｓ_ｘ*Ｓ_ｙ（Ｃｏｖ(ｘ,ｙ)は、共分散を表し、Ｓ_ｘ及びＳ_ｙは、それぞれ、標準偏差を表す。）から算出することができる。

また、例えば、マイクロソフトエクセル（商品名；マイクロソフト社製）等の表計算ソフトウエアでも容易に算出できる。前記相関係数ｒは、−１〜１の値をとり、１に近いほど正の相関が強く、ｒが０であれば、両変数に相関がないことを示す。正の相関関係とは、例えば、検出用ターゲットの標識シグナルを縦軸、検出用リファレンスの標識シグナルを横軸としてスキャタープロットをすると、プロットが右肩上がりの直線に沿って分布する関係である。

２つの変数、リファレンス標識シグナル及びターゲット標識シグナルの相関係数ｒが大きいほど、検出対象のカビ以外のカビ由来のターゲットによるクロスハイブリダイゼーションがないこと、すなわち、偽陽性ではないことを示す。

したがって、算出された相関係数ｒが所定の値より大きければ、陽性であり、前記所定の値以下であれば、偽陽性と判定することができる。判定に用いる相関係数の前記所定の値としては、例えば、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８及び０．９９が挙げられ、好ましくは、０．９５〜０．９９である。

次に、リファレンス標識シグナルとターゲット標識シグナルとの相関の有無を検定する。前記相関係数ｒが、前記所定の値を超える場合でも、両者の相関があるとはいえない場合があるからである。

前記検定は、例えば、両者の相関がないとした場合、式：ｔ＝|ｒ|(ｎ−２)^１／２／(１−ｒ^２)^１／２が、自由度ｎ−２のｔ分布に従うことを利用したｔ検定により行うことができる。前記式において、ｒは、前記相関係数ｒであり、ｎは、検出用プローブの種類又はスポットの数である。

前記ｔ検定により算出されるＰ値が、前記所定の有意水準未満であれば、その有意水準でターゲットとリファレンス間の相関を認めることができる。前記所定の有意水準としては、例えば、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１％であって、好ましくは、１０％以下であり、より好ましくは、５％以下であり、さらにより好ましくは、１％以下である。

そして、前記所定の有意水準での相関が有意であり、かつ、相関係数ｒが前記所定の値を超える場合に陽性と、それ以外の場合を偽陽性と判定する。この判定工程における統計学的計算は、例えば、マイクロソフトエクセル（商品名；マイクロソフト社製）等の表計算ソフトウエアで容易に行える。

また、判定工程において、前記相関係数ｒに代えて、前記スキャタープロットの回帰直線の決定係数（寄与率）ｒ^２を利用することもできる。決定係数ｒ^２を利用する場合の所定の値は、例えば、前記相関係数ｒの所定の値を二乗した値が挙げられる。

前記決定係数を利用した場合、前記検定として、前記ｔ検定に代えて、例えば、Ｆ検定等により回帰の有無を検定してもよい。前記所定の有意水準としては、前記ｔ検定のものがあげられる。回帰が有意であり、かつ、決定係数ｒ^２が前記所定の値を超える場合を、陽性、それ以外を偽陽性と判定することができる。

（定量工程）
前記判定工程で陽性であると判定され検出されたカビについては、以下のようにして定量することができる。まず、縦軸に検出用ターゲット標識シグナルをとり、横軸に検出用リファレンス標識シグナルをとったスキャタープロットの回帰直線の傾きである回帰係数ａを算出する。

次に、前記回帰係数ａに検出用リファレンスの濃度を乗じて検出用ターゲットの濃度を得て、最後に、被検試料における検出対象生物の存在量を算出する。

図１と図２は、横軸に示す様々な細胞数に相当する標準試料ＤＮＡから調製したターゲットと、一定量の標準試料ＤＮＡから調製したリファレンスとを用いて競合ハイブリダイゼーションを行った場合の標識シグナル比（ターゲット／リファレンス比）を縦軸にとった対数グラフである。

図１と図２に示すとおり、ターゲット調製に用いた試料中の細胞数と、ターゲット／リファレンス比が比例関係となる。したがって、前記回帰係数ａとリファレンスの標準試料の濃度から、ターゲットの試料濃度、すなわち、被検試料中の検出対象生物の存在量が定量できる。

例えば、回帰係数ａが０．０９７の場合（図２）、検出用ターゲットに用いた被検試料中には、検出用リファレンスに用いた標準試料の１０分の１倍に相当する検出カビが存在することがわかる。この定量工程を行う場合には、前述したように、内部標準プローブを用いて、第１及び第２標識シグナルの補正を行うことが好ましい。

本発明であるカビの検出方法は、１つの基板上に複数種類のカビを検出するためのプローブを配置したマイクロアレイを使用することで、同時に複数のカビを検出し、定量できる。したがって、本発明であるカビの検出方法は、例えば、食品製造、食品流通の分野において、食品に汚染したカビを検出定量する用途等に有用である。

本発明のマイクロアレイは、本発明であるカビの検出方法に用いるマイクロアレイであって、前述した検出用プローブや内部標準プローブのスポットが基板に規則的に配置されたものである。本発明のマイクロアレイの製造方法は、特に制限されず、前述のとおり、従来公知の方法を利用して製造できる。

本発明であるカビ検出用キットは、本発明のマイクロアレイを含む本発明であるカビの検出方法のためのキットである。本発明のカビ検出用キットは、さらに、検出用ターゲット及びリファレンスを調製するためのプライマー、酵素、試薬、検出対象のカビの標準試料等を含んでもよい。

さらにまた、内部標準ターゲット及びリファレンスを調製するためのプライマー、内部標準試料等を含んでもよい。前記酵素及び試薬としては、従来公知の試薬が利用でき、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、標識化合物、バッファー等があげられる。本発明の検出キットは、必要に応じて、ターゲットやリファレンス調製用の核酸抽出用試薬及びフィルター若しくはチップ等を含んでいてもよい。

以下に、食品に含まれる有害カビを検出する本発明であるカビの検出方法の一態様について説明する。

マイコトキシンを生産する代表的なカビとして、以下が知られている。以下のカビは食品中で繁殖し、条件によって、アスペルギルス オリゼ（Aspergillus oryzae）を除いて、マイコトキシンを生産する。
Ａ：アスペルギルス フラバス（Aspergillus flavus）
Ｂ：アスペルギルス オリゼ（Aspergillus oryzae）
Ｃ：アスペルギルス パラシチカス（Aspergillus parasiticus）
Ｄ：アスペルギルス ノミウス（Aspergillus nomius）
Ｅ：アスペルギルス クラバタス（Aspergillus clavatus）
Ｆ：アスペルギルス オクラセウス（Aspergillus ochraceus）
Ｇ：アスペルギルス カンディダス（Aspergillus candidus）
Ｈ：ペニシリウム ビリディカータム（Penicillium viridicatum）
Ｉ：ペニシリウム パプルゲナム（Penicillium pupurogenum）
Ｊ：ペニシリウム シトリーナム（Penicillium citrinum）
Ｋ：ペニシリウム イスランディカム（Penicillium islandicum）
Ｌ：フザリウム トリシンクタム（Fusarium tricinctum）
Ｍ：フザリウム スポロトリシオイデス（Fusarium sporotrichioides）
Ｎ：ジベレラ ゼアエ（Gibberella zeae）
Ｏ：クラビセプス パープレア（Claviceps purpurea）
Ｐ：アスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）
Ｑ：アスペルギルス ベシカラ（Aspergillus versicolor）
Ｒ：フザリウム ソラニ（Fusarium solani）
Ｓ：ジベレラ フジクロイ（Gibberella fujikuroi）
Ｔ：フザリウム カルモラム（Fusaroum culmorum）
Ｕ：ペニシリウム エクスパンサム（Penicillum expansum）
Ｖ：ペニシリウム グリセオフルバム（Penicillium griseofulvum）
Ｗ：ペニシリウム ロックフォーティ（Penicillium roquefortii）
Ｘ：トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）
Ｙ：ペニシリウム シクロピウム（Penicillium cyclopium）
Ｚ：ユーロティウム ルブラム（Eurotium rubrum）

前記ＡからＺのカビは、以下に示す生物資源保存機関であるＮＢＲＣの寄託番号が付されており、該当機関から入手することができる。
Ａ：ＮＢＲＣ３０８０ Ｂ：ＮＢＲＣ４０７５ Ｃ：ＮＢＲＣ４０８２
Ｄ：ＮＢＲＣ８５５７ Ｅ：ＮＢＲＣ３３０２０ Ｆ：ＮＢＲＣ４０５９
Ｇ：ＮＢＲＣ４０３６ Ｈ：ＮＢＲＣ３０１８１ Ｉ：ＮＢＲＣ４６８４
Ｊ：ＮＢＲＣ４６３１ Ｋ：ＮＢＲＣ６３５２ Ｌ：ＮＢＲＣ３３２３８
Ｍ：ＮＢＲＣ３３２３７ Ｎ：ＮＢＲＣ４４７４ Ｏ：ＮＢＲＣ３２９７０
Ｐ：ＮＢＲＣ４１００ Ｑ：ＮＢＲＣ４０９８ Ｒ：ＮＢＲＣ５２３２
Ｓ：ＮＢＲＣ５２６８ Ｔ：ＮＢＲＣ５９０２ Ｕ：ＮＢＲＣ５４５３
Ｖ：ＮＢＲＣ７０１０ Ｗ：ＮＢＲＣ４６２２ Ｘ：ＮＢＲＣ５７２０
Ｙ：ＮＢＲＣ５８４７ Ｚ：ＮＢＲＣ４０８９

本発明であるカビの検出方法を用いて、前記カビＡ〜Ｚを検出するには、まず、前記各カビについて検出用プローブを複数種類設計し、検出に用いる本発明のマイクロアレイを準備する必要がある。

前記検出用プローブは、前記各カビのリボソーム領域あるいはその間のＩＴＳ領域から選択することが好ましい。前記Ａ〜Ｚの各カビについての複数種類の検出用プローブを、塩基長４５〜５０ｍｅｒ程度であること、前記隣接法によるＴｍ値が、８５℃〜１０５℃であること、他のカビのＩＴＳ領域と相同性がないこと、Ｇ＋Ｃ、Ａ＋Ｔ塩基が６つ以上連続しないこと、リボゾーム領域あるいはその間のＩＴＳ領域の末端にプローブが位置しないこと、及びプローブ同士の塩基配列の重複を少なくすることに基づき設計した例を以下に示す。

前記カビＡの検出用プローブが、配列番号１〜１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＢの検出用プローブが、配列番号１８〜３７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＣの検出用プローブが、配列番号３８〜５８塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＤの検出用プローブが、配列番号５９〜７９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＥの検出用プローブが、配列番号８０〜１０２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＦの検出用プローブが、配列番号１０３〜１２２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＧの検出用プローブが、配列番号１２３〜１３７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＨの検出用プローブが、配列番号１３８〜１５５の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＩの検出用プローブが、配列番号１５６〜１６５の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＪの検出用プローブが、配列番号１６６〜１８４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＫの検出用プローブが、配列番号１８５〜１９３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＬの検出用プローブが、配列番号１９４〜２１４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＭの検出用プローブが、配列番号２１５〜２３４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＮの検出用プローブが、配列番号２３５〜２５６の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＯの検出用プローブが、配列番号２５７〜２６８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＰの検出用プローブが、配列番号２６９〜２９０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＱの検出用プローブが、配列番号２９１〜３０３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＲの検出用プローブが、配列番号３０４〜３２０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＳの検出用プローブが、配列番号３２１〜３４１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＴの検出用プローブが、配列番号３４２〜３５８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＵの検出用プローブが、配列番号３５９〜３７６の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＶの検出用プローブが、配列番号３７７〜３９３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＷの検出用プローブが、配列番号３９４〜４０４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＸの検出用プローブが、配列番号４０５〜４２０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＹの検出用プローブが、配列番号４２１〜４３７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
前記カビＺの検出用プローブが、配列番号４３８〜４５８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブである。

ここで、「配列番号ｎの塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチド」とは、下記（１）〜（４）のポリヌクレオチドを含むことをいう。
（１）配列番号ｎの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列番号ｎの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、配列番号ｎの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）配列番号ｎの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。

前記（２）又は（３）のポリヌクレオチドにおいて、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、４０塩基に対して、欠失・付加で、１個〜６個であり、１個〜３個が好ましく、より好ましくは１個〜２個であり、置換で、１個〜４個であり、１個〜２個が好ましく、より好ましくは１個である。

また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、２つのＤＮＡ断片がSambrook Jらによって記載されたような標準的なハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する（Expression of cloned genes
in E. coli(Molecular Cloning:A laboratory manual(1989))Cold Spring harbor
Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61）。

より具体的には、Ｔｍ値の±１０℃を基準としてハイブリダイゼーション及び洗浄（例えば約２．０×ＳＳＣ、５０℃）を行うことを意味する。また、前記相同性としては、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは、９７．５％以上である。

前記検出用プローブを基板上に配置して、前記Ａ〜Ｚのカビを検出するための本発明のマイクロアレイを準備することができる。そして、検出用ターゲット及び検出用リファレンスの調製は、アシンメトリックＰＣＲやＬＡＴＥ−ＰＣＲを用いる場合、前記Ａ〜Ｚのカビのリボゾーム領域及びＩＴＳ領域を増幅可能なユニバーサルプライマーを設計して使用することができる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。なお、実施例において設定した数値等は、なんら本発明の範囲を限定するものではない。

（標準試料を使用した競合ハイブリダイゼーション）
１．検出用プローブの作製
前記Ａ〜Ｚのカビを検出対象のカビとして、それらのリボゾーム領域及びＩＴＳ領域から、４５塩基から５０塩基程度の複数の検出用プローブをデザインした。前記検出用プローブのデザインは、４５塩基から５０塩基程度、ＧＣ含有量４８-５０％の一本鎖であり、相同性が無いか又はほとんどなく、国際データベースＧｅｎＢａｎｋでヒットがない（あっても２以上のミスペア）ことを基準として行った。

以下に、作製したカビ検出用ＤＮＡプローブ（各カビにつきそれぞれ９〜２３種類）の塩基配列の配列番号（配列番号１〜４５８）を示す。なお、各プローブのＣ末端には、Ｃ６アミノ化を施した。

カビＡのプローブＡ１からＡ１７が、それぞれ、配列番号１から１７であり、
カビＢのプローブＢ１からＢ２０が、それぞれ、配列番号１８から３７であり、
カビＣのプローブＣ１からＣ２１が、それぞれ、配列番号３８から６０であり、
カビＤのプローブＤ１からＤ２１が、それぞれ、配列番号５９から７９であり、
カビＥのプローブＥ１からＥ２３が、それぞれ、配列番号８０から１０２であり、
カビＦのプローブＦ１からＦ２０が、それぞれ、配列番号１０３から１２２であり、
カビＧのプローブＧ１からＧ１５が、それぞれ、配列番号１２３から１３７であり、
カビＨのプローブＨ１からＨ１８が、それぞれ、配列番号１３８から１５５であり、
カビＩのプローブＩ１からＩ１０が、それぞれ、配列番号１５６から１６５であり、
カビＪのプローブＪ１からＪ１９が、それぞれ、配列番号１６６から１８４であり、
カビＫのプローブＫ１からＫ９が、それぞれ、配列番号１８５から１９３であり、
カビＬのプローブＬ１からＬ２１が、それぞれ、配列番号１９４から２１４であり、
カビＭのプローブＭ１からＭ２０が、それぞれ、配列番号２１５から２３４であり、
カビＮのプローブＮ１からＮ２２が、それぞれ、配列番号２３５から２５６であり、
カビＯのプローブＯ１からＯ１２が、それぞれ、配列番号２５７から２６８であり、
カビＰのプローブＰ１からＰ２２が、それぞれ、配列番号２６９から２９０であり、
カビＱのプローブＱ１からＱ１３が、それぞれ、配列番号２９１から３０３であり、
カビＲのプローブＲ１からＲ１７が、それぞれ、配列番号３０４から３２０であり、
カビＳのプローブＳ１からＳ２１が、それぞれ、配列番号３２１から３４１であり、
カビＴのプローブＴ１からＴ１７が、それぞれ、配列番号３４２から３５８であり、
カビＵのプローブＵ１からＵ１８が、それぞれ、配列番号３５９から３７６であり、
カビＶのプローブＶ１からＶ１７が、それぞれ、配列番号３７７から３９３であり、
カビＷのプローブＷ１からＷ１１が、それぞれ、配列番号３９４から４０４であり、
カビＸのプローブＸ１からＸ１６が、それぞれ、配列番号４０５から４２０であり、
カビＹのプローブＹ１からＹ１７が、それぞれ、配列番号４２１から４３７であり、
カビＺのプローブＺ１からＺ２１が、それぞれ、配列番号４３８から４５８である。

２．ＤＮＡマイクロアレイの作製とＤＮＡプローブの特異性の確認
次に、前記４５８種類の検出用プローブを、Affymetrix 417 Arrayer（Affymetrix社製）により、Takara Hubble Slide（Takara社製）に、それぞれ、３個づつカスタムプリントしてマイクロアレイを作製した。

また、各カビの標準試料ごとに検出用ターゲットを調製するとともに、全カビを含む標準試料から検出用ターゲットを調製した。

前記検出用プローブは、リボゾーム領域及びＩＴＳ領域のセンス鎖であるから、前記検出用ターゲット及び検出用リファレンスは、それぞれ、Ｃｙ５及びＣｙ３で標識したアンチセンス（リバース）プライマーを用いるＬＡＴＥ−ＰＣＲ法によって調製した。

ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法に用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ、配列番号４５９及び配列番号４６０の塩基配列をもとに、隣接法（Nearest Neighbor Method）によるＴｍ値が、Ｔｍ（フォワード）−Ｔｍ（リバース）≧０となるように修正したものを使用した。

なお、Ｔｍ値の計算は、ソフトウエア：ＰＲＩＭＲＯＳＥ ver.1.1.7(Kevin E.
Ashelford, Andrew J. Weightman andJohn C. Fry (2002) "PRIMROSE: a computer
program for generating and estimating the phylogenetic range of 16S rRNA
oligonucleotide probes and primers in conjunction with the RDP-II database
" Nucleic Acids Research, Vol. 30, No. 15 3481-3489）を使用して行った。

ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法においては、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーは、濃度比１：１００で使用した。増幅反応は、９４℃１０分ののち、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃６０秒を１５サイクル行い、さらに、９４℃３０秒−５０℃３０秒−７２℃６０秒を２５サイクル行った。増幅産物を、 Autoseq G-50（ファルマシア社製）を用いて脱塩し、SpeedVac（Savant社製）を用いて吸引乾燥した。

前記検出用ターゲット及び検出用リファレンスを、５×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドのバッファーに溶解させた溶解液を、９４℃で３分間ボイルして少なくとも２分間氷冷した後、前記マイクロアレイにアプライした。

カバーグラスを前記マイクロアレイ上にかぶせ、その後、６５℃に設定されたハイブリダイゼーションチャンバー内に４〜１２時間配置した後、前記マイクロアレイを、０.２×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳで５分間、０.２×ＳＳＣで５分間、そして、０.０５×ＳＳＣで数秒間洗浄し、１５００ｒｐｍでスピンドライした。結果の測定は、Scanarry version 5（パーキンエルマージャパン社製）でスキャンして行った。

図１は、同量のカビＡのＤＮＡを蛍光２色法で解析した結果である。縦軸はカビＡ（ｘ１）の相対蛍光強度であり、横軸はカビＡ（ｘ１）の相対蛍光強度である。ここで、相対蛍光強度とは、リファレンスに対してどれだけの強さの蛍光をもっているかを数値化したものである。

この結果、相関係数が０．９８となり、同じＤＮＡであることが分かる。また、グラフの傾きが、０．８１となり、ほぼ同量存在することが分かる。

図２は、１０（Ｘ軸）：１（Ｙ軸）の比率で、カビＡのＤＮＡを蛍光２色法で解析した結果である。縦軸はカビＡ（×０．１）の相対蛍光強度であり、横軸はカビＡ（×１）の相対蛍光強度である。

この結果、相関係数が０．９８となり、同じＤＮＡであることが分かる。また、グラフの傾きが、０．０９７となり、リファレンスに対して、ほぼ１０分の１量存在することが分かる。

以上説明したとおり、本発明であるカビの検出方法は、偽陽性か陽性かの判定を可能にすることで、より高い信頼性を提供し、検出したカビの定量を可能とすることで、より利便性を提供し、マイクロアレイを利用することで、操作の簡便性・迅速性及び大量サンプル一括処理等の優れた処理能力を提供する。したがって、本発明は、食品製造、食品流通の分野で有用である。

同量のカビＡのＤＮＡを蛍光２色法で解析した結果である。 １０（Ｘ軸）：１（Ｙ軸）の比率で、カビＡのＤＮＡを蛍光２色法で解析した結果である。

配列番号２２３ ｎは、ａ、ｃ、ｇ、或いはｔ
配列番号４５９は、ＰＣＲ用フォワードプライマーの基礎配列
配列番号４６０は、ＰＣＲ用リバースプライマーの基礎配列

Claims (10)

1. 穀類又はナッツ類の中のマイコトキシンを生成するカビ類を網羅的に検出し、穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法であって、
   検出対象のカビに特異的な複数種類の検出用プローブのスポットが配置されたマイクロアレイを準備するマイクロアレイ準備工程と、
   前記被検試料中の核酸から、第１の標識化合物で標識された検出用ターゲットを準備するターゲット準備工程と、
   前記検出対象のカビの標準試料から、第２の標識化合物で標識された検出用リファレンスを準備するリファレンス準備工程と、
   前記ターゲットと前記リファレンスとを混合して前記マイクロアレイにハイブリダイズし、前記スポットにおける第１及び第２の標識化合物の標識シグナルをそれぞれ測定する競合ハイブリダイゼーション工程と、
   前記スポットにおける前記２つの標識シグナルの相関関係について、相関係数ｒの算出及び検定を行い、所定の有意水準で相関が肯定され、かつ、前記相関係数ｒの値が所定の値を超える場合に前記カビ類の検出を陽性と判定し、それ以外の場合を偽陽性と判定する判定工程とを含み、
   前記ターゲット準備工程及び前記リファレンス準備工程におけるターゲット及びリファレンスの調製が、アシンメトリックＰＣＲ法又はＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により行われ、
   前記判定工程の結果に基づき穀類又はナッツ類のマイコトキシン汚染の可能性を予測することを特徴とする
   穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
2. 前記被検試料における検出対象のカビの存在量を算出する定量工程を含み、
   前記定量工程が、前記スポットにおける前記２つの標識シグナルの回帰直線の傾き（回帰係数）ａを算出することを含む
   請求項１に記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
3. 前記マイクロアレイ準備工程、ターゲット準備工程及びリファレンス準備工程が、それぞれ、内部標準プローブを配置すること、第１の標識化合物で標識された内部標準ターゲットを調製すること及び第２の標識化合物で標識された内部標準リファレンスを調製することを含み、前記判定工程が、検出用ターゲット標識シグナル及び検出用リファレンス標識シグナルを、前記内部標準のシグナルに基づいて修正することを含む請求項１又は２に記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
4. 前記マイクロアレイ準備工程のマイクロアレイにおいて、前記検出用プローブのスポット数が、１種類の検出対象のカビにつき、６個以上である請求項１から３のいずれかに記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
5. 前記判定工程における所定の有意水準が、２０％〜０．１％の範囲であり、前記相関係数の所定の値が、０．８〜０．９９の範囲である請求項１から４のいずれかに記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
6. 前記検出用プローブが、前記カビ類のリボゾーム領域あるいはその間のＩＴＳ領域に由来する請求項１から５のいずれかに記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
7. 検出対象のカビが、下記ＡからＺからなる群から選択される少なくとも１種を含むカビ類である請求項１から６のいずれかに記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法。
   Ａ：アスペルギルス フラバス（Aspergillus flavus）
   Ｂ：アスペルギルス オリゼ（Aspergillus oryzae）
   Ｃ：アスペルギルス パラシチカス（Aspergillus parasiticus）
   Ｄ：アスペルギルス ノミウス（Aspergillus nomius）
   Ｅ：アスペルギルス クラバタス（Aspergillus clavatus）
   Ｆ：アスペルギルス オクラセウス（Aspergillus ochraceus）
   Ｇ：アスペルギルス カンディダス（Aspergillus candidus）
   Ｈ：ペニシリウム ビリディカータム（Penicillium viridicatum）
   Ｉ：ペニシリウム パプルゲナム（Penicillium pupurogenum）
   Ｊ：ペニシリウム シトリーナム（Penicillium citrinum）
   Ｋ：ペニシリウム イスランディカム（Penicillium islandicum）
   Ｌ：フザリウム トリシンクタム（Fusarium tricinctum）
   Ｍ：フザリウム スポロトリシオイデス（Fusarium sporotrichioides）
   Ｎ：ジベレラ ゼアエ（Gibberella zeae）
   Ｏ：クラビセプス パープレア（Claviceps purpurea）
   Ｐ：アスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）
   Ｑ：アスペルギルス ベシカラ（Aspergillus versicolor）
   Ｒ：フザリウム ソラニ（Fusarium solani）
   Ｓ：ジベレラ フジクロイ（Gibberella fujikuroi）
   Ｔ：フザリウム カルモラム（Fusaroum culmorum）
   Ｕ：ペニシリウム エクスパンサム（Penicillum expansum）
   Ｖ：ペニシリウム グリセオフルバム（Penicillium griseofulvum）
   Ｗ：ペニシリウム ロックフォーティ（Penicillium roquefortii）
   Ｘ：トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）
   Ｙ：ペニシリウム シクロピウム（Penicillium cyclopium）
   Ｚ：ユーロティウム ルブラム（Eurotium rubrum）
8. 請求項７に記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法であって、
   前記カビＡの検出用プローブが、配列番号１〜１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＢの検出用プローブが、配列番号１８〜３７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＣの検出用プローブが、配列番号３８〜５８塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＤの検出用プローブが、配列番号５９〜７９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＥの検出用プローブが、配列番号８０〜１０２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＦの検出用プローブが、配列番号１０３〜１２２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＧの検出用プローブが、配列番号１２３〜１３７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＨの検出用プローブが、配列番号１３８〜１５５の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＩの検出用プローブが、配列番号１５６〜１６５の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＪの検出用プローブが、配列番号１６６〜１８４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＫの検出用プローブが、配列番号１８５〜１９３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＬの検出用プローブが、配列番号１９４〜２１４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＭの検出用プローブが、配列番号２１５〜２３４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＮの検出用プローブが、配列番号２３５〜２５６の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＯの検出用プローブが、配列番号２５７〜２６８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＰの検出用プローブが、配列番号２６９〜２９０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＱの検出用プローブが、配列番号２９１〜３０３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＲの検出用プローブが、配列番号３０４〜３２０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＳの検出用プローブが、配列番号３２１〜３４１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＴの検出用プローブが、配列番号３４２〜３５８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＵの検出用プローブが、配列番号３５９〜３７６の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＶの検出用プローブが、配列番号３７７〜３９３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＷの検出用プローブが、配列番号３９４〜４０４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＸの検出用プローブが、配列番号４０５〜４２０の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＹの検出用プローブが、配列番号４２１〜４３７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   前記カビＺの検出用プローブが、配列番号４３８〜４５８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むプローブであり、
   ここで、「配列番号ｎの塩基配列からなるポリヌクレオチド、その相同ポリヌクレオチド及びそれらの相補ポリヌクレオチド」が、下記（１）〜（４）のポリヌクレオチドをからなるカビの検出方法。
   （１）配列番号ｎの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
   （２）配列番号ｎの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、配列番号ｎの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
   （３）配列番号ｎの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
   （４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法に用いるマイクロアレイであって、
   検出対象のカビが前記ＡからＺからなる群から選択される少なくとも１種であり、検出対象バクテリア１種類につき前記検出用プローブが３種類以上、かつ、前記各検出用プローブにつき３個以上のスポットが配置されたマイクロアレイ。
10. 請求項９に記載のマイクロアレイを含む請求項８に記載の穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測する方法のための穀類又はナッツ類の流通過程におけるマイコトキシン汚染を予測するキット。

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