JP7500930B2 - サルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ｐｃｒ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法 - Google Patents
サルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ｐｃｒ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法 Download PDFInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Description
本発明は、畜産物、食品、環境等の衛生管理の分野などにおいて、サルモネラ属菌の血清型を特異的に検出するためのプライマー、及びこれを用いた検査技術に関する。
サルモネラ属菌は、種々の動物の消化管に生息する腸内細菌の一種であり、その一部にはヒトや動物に感染して病原性を示すものが存在している。
サルモネラ属菌の血清型は、細胞壁リポ多糖体であるＯ抗原と、鞭毛タンパク質であるＨ抗原の組み合わせにもとづいて、２６００種類以上に分類されており、その同定は、畜産物や食品、環境等の衛生管理において重要となっている。
サルモネラ属菌の血清型は、細胞壁リポ多糖体であるＯ抗原と、鞭毛タンパク質であるＨ抗原の組み合わせにもとづいて、２６００種類以上に分類されており、その同定は、畜産物や食品、環境等の衛生管理において重要となっている。
このうち、サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）、サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）、サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）、サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）、及びサルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）は、ＥＵにおいて規制の対象となっている（REGULATIONS, COMMISSION REGULATION（EU） No 200/2010 of 10 March 2010）。
このようなサルモネラ属菌における複数血清型を同時に判別することを目的として、血清型に特異的なＤＮＡ領域を対象とするＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）判別法が報告されている（下記の先行技術文献参照）。
しかしながら、既報のプライマーセットを用いた場合、誤判定を生じ得るという問題があった。
しかしながら、既報のプライマーセットを用いた場合、誤判定を生じ得るという問題があった。
Kardos G et al., Letters in Applied Microbiology 2007, 45:421-425.
Ranjbar R et al., Iran J Public Health 2017, 46（1）: 103-111.
Chiang Y-C et al., Journal of Food and Drug Analysis 2017, 26:58-66.
例えば、サルモネラ インファンティス検出用のプライマーセットは多数報告されているが、培地中にサルモネラ インファンティスが存在するにもかかわらず、一部の菌株について陰性と誤判定されてしまうという問題があった。
また、サルモネラ ウィルヒョウ検出用のプライマーセットは１件報告されているが（非特許文献３）、培地中にサルモネラ ケンタッキー（Salmonella Kentucky）が存在する場合に、これを偽陽性として誤判定するという問題があった。
また、サルモネラ ウィルヒョウ検出用のプライマーセットは１件報告されているが（非特許文献３）、培地中にサルモネラ ケンタッキー（Salmonella Kentucky）が存在する場合に、これを偽陽性として誤判定するという問題があった。
そこで、本発明者らは鋭意研究して、サルモネラ インファンティスの検出における一部の菌株についての誤判定を防止でき、かつ、サルモネラ ウィルヒョウの検出における誤判定を防止可能なプライマーセットを開発した。また、これらの血清型に加えて、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウム、及びサルモネラ ハーダーを同時に判別可能なプライマーセットと、そのＰＣＲ産物に好適にハイブリダイゼーションを行うことが可能なプローブを開発することに成功して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、サルモネラ属菌における複数の血清型を同時に特異的に判別することが可能なサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法の提供を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットは、下記の（１）～（２）に示されるプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセットである；（２）サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号４に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、フォワードプライマーが配列番号５に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成としてある。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを、上記のプライマーセットと共に、下記の（３）～（５）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセットである；（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセットである；（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成とすることも好ましい。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを、上記のプライマーセットと共に、下記の（６）～（７）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成とすることも好ましい。
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセットである構成とすることも好ましい。
また、本発明のＰＣＲ産物は、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られた構成としてある。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、上記のＰＣＲ産物にそれぞれ相補的に結合するプローブが固定化された構成としてある。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイを、前記プローブに、配列番号１７～２１に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２３に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが含まれる構成とすることも好ましい。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイを、前記プローブに、配列番号２５～２９に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３０～３５に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３６～４０に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４１～４４に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが含まれる構成とすることも好ましい。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、上記のプライマーセットと、上記のマイクロアレイとを含む構成としてある。
また、本発明のサルモネラ属菌血清型判別方法は、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これを上記のマイクロアレイに固定化されたプローブとハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別する方法としてある。
本発明によれば、サルモネラ属菌における複数の血清型を同時に特異的に判別することが可能となる。
以下、本発明のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
まず、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに固定化されたプローブの設計手順について説明する。
上記非特許文献３記載のサルモネラ インファンティス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅される対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：CP019202、領域：201330-201604）。同様に、上記非特許文献３記載のサルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅される領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：AOXL01000191、領域：67110-67390）。
上記非特許文献３記載のサルモネラ インファンティス検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅される対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：CP019202、領域：201330-201604）。同様に、上記非特許文献３記載のサルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅される領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：AOXL01000191、領域：67110-67390）。
さらに、上記のサルモネラ インファンティス検出用プライマーの増幅対象領域とは異なる配列を持つサルモネラ インファンティス菌株について、同対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：AFYI01000003、領域：255560-255834）。また、上記のサルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットを用いた場合に誤検出されるサルモネラ ケンタッキー菌株について、同対象領域の配列情報をGenbankから取得した（アクセッション番号：CP026327、領域：241939-242216）。
そして、これら４つの配列を比較することにより、各配列に特徴的な領域を見いだし、サルモネラ インファンティスと、サルモネラ ウィルヒョウとを誤判定なく検出可能なプライマーセットを開発した。また、開発したプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを、同対象領域から設計した。
また、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウムについて、上記のプライマーセットと同時に用いて、これらの血清型を同時に特異的に判別することが可能なプライマーセットを開発し、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを設計した。
さらに、サルモネラ ハーダー、及びサルモネラ属菌を検出するための既存のプライマーセットを組み合わせると共に、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを設計して、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を同時に特異的に判別することを可能にした。
さらに、サルモネラ ハーダー、及びサルモネラ属菌を検出するための既存のプライマーセットを組み合わせると共に、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅されるＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行うプローブを設計して、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を同時に特異的に判別することを可能にした。
本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット（第一のプライマーセット）は、下記の（１）～（２）に示されるプライマーセットを含むことを特徴とする。
（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット
（２）サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号４に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット
（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット
（２）サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号４に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット（第二のプライマーセット）は、上記のプライマーセットと共に、下記の（３）～（５）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とすることが好ましい。
（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセット
（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセット
（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセット
（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセット
（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセット
（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセット
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット（第三のプライマーセット）は、上記のいずれかのプライマーセットと共に、下記の（６）～（７）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とすることが好ましい。
（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセット
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセット
（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセット
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセット
また、本実施形態のＰＣＲ産物は、上記の第一から第三のいずれかのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたことを特徴とする。
上記プライマーセットの具体的な塩基配列と、それぞれのＰＣＲ産物の増幅産物長を図１に示す。同図において、「Ｆ／Ｒ」は、Ｆがフォワードプライマーを、Ｒがリバースプライマーを示す。
上記プライマーセットの具体的な塩基配列と、それぞれのＰＣＲ産物の増幅産物長を図１に示す。同図において、「Ｆ／Ｒ」は、Ｆがフォワードプライマーを、Ｒがリバースプライマーを示す。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、上記のＰＣＲ産物にそれぞれ相補的に結合するプローブが固定化されたことを特徴とする。
これらのプローブの具体的な塩基配列を図２及び図３に示す。
これらのプローブの具体的な塩基配列を図２及び図３に示す。
本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、配列番号１７～２１に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２４に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが固定化されたものとすることが好ましい。
配列番号１７～２１に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（１）サルモネラ インファンティスに特異的なプライマーセット（配列番号１及び３のプライマーセット、及び／又は、配列番号２及び３のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号１７～２１に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号１７～２１に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
配列番号２２～２４に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（２）サルモネラ ウィルヒョウに特異的なプライマーセット（配列番号４及び６のプライマーセット、及び／又は、配列番号５及び６のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号２２～２４に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号２２～２４に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、配列番号２５～２９に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３０～３５に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号３６～４０に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４１～４４に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示される塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとが固定化されたものとすることが好ましい。
配列番号２５～２９に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（３）サルモネラ インファンティスに特異的なプライマーセット（配列番号７及び８のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号２５～２９に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号２５～２９に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
配列番号３０～３５に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（４）サルモネラ エンテリティディスに特異的なプライマーセット（配列番号９及び１０のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号３０～３５に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号３０～３５に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
配列番号３６～４０に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（５）サルモネラ ティフィムリウムに特異的なプライマーセット（配列番号１１及び１２のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号３６～４０に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号３６～４０に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
配列番号４１～４４に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（６）サルモネラ ハーダーに特異的なプライマーセット（配列番号１３及び１４のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号４１～４４に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号４１～４４に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
配列番号４５～４７に示される塩基配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、上記（７）サルモネラ属菌に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセット（配列番号１５及び１６のプライマーセット）を用いてＰＣＲ法により増幅して得られるＰＣＲ産物の二本鎖のうちの一方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号４５～４７に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、配列番号４５～４７に示される塩基配列の相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブは、同ＰＣＲ産物の二本鎖のうちの他方のターゲット鎖にハイブリダイゼーションにより相補的に結合することができる。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイは、配列番号１７～４７に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
例えば、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
本実施形態におけるプローブは、いずれも２０～６０塩基の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で用いた配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットも、１８～３０塩基の長さであり、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１～１６に示す塩基配列からなるプライマーは、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットも、１８～３０塩基の長さであり、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１～１６に示す塩基配列からなるプライマーは、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
本実施形態における配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１７～４７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１７～４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１７～４７に示す塩基配列からなるＤＮＡとそれぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、第一のプライマーセットと、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたＰＣＲ産物に相補的に結合する第一のプローブ群が固定化されたマイクロアレイとを含むことを特徴とする。
第一のプローブ群は、図２に示す配列番号１７～２１に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２４に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
第一のプローブ群は、図２に示す配列番号１７～２１に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号２２～２４に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、第二のプライマーセットと、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたＰＣＲ産物に相補的に結合する第二のプローブ群が固定化されたマイクロアレイとを含む構成とすることも好ましい。
第二のプローブ群は、第一のプローブ群に加え、図２に示す配列番号２５～２９に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、図３に示す配列番号３０～３５に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、図３に示す配列番号３６～４０に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
第二のプローブ群は、第一のプローブ群に加え、図２に示す配列番号２５～２９に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、図３に示す配列番号３０～３５に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、図３に示す配列番号３６～４０に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用キットは、第三のプライマーセットと、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅して得られたＰＣＲ産物に相補的に結合する第三のプローブ群が固定化されたマイクロアレイとを含む構成とすることも好ましい。
第三のプローブ群は、第二のプローブ群に加え、図３に示す配列番号４１～４４に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
第三のプローブ群は、第二のプローブ群に加え、図３に示す配列番号４１～４４に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブと、配列番号４５～４７に示す塩基配列又はその相補配列を有するプローブからなるプローブ群から選択される少なくともいずれかのプローブとからなる。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法は、第一のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これをマイクロアレイに固定化された第一のプローブ群とハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別することを特徴とする。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法は、第二のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これをマイクロアレイに固定化された第二のプローブ群とハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別する方法とすることも好ましい。
また、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法は、第三のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＰＣＲ産物を得て、これをマイクロアレイに固定化された第三のプローブ群とハイブリダイゼーションさせることで、サルモネラ属菌の血清型を判別する方法とすることも好ましい。
本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別方法に先だって行われる、サルモネラ属菌の菌株からのゲノムＤＮＡの抽出は、キットによる方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
そして、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域（増幅対象領域）の増幅が行われる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片が増幅される。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １５分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） １分、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） １分、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） １分（（ｂ）～（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
（ａ）９５℃ １５分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） １分、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） １分、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） １分（（ｂ）～（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。
すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として滅菌水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として滅菌水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
本実施形態において、ハイブリダイゼーションは、以下のように行うことができる。
すなわち、ＰＣＲ法などにより得られた増幅産物を本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに滴下し、これに固定化されたプローブにハイブリダイゼーションをした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の畜産物、食品、環境中に存在しているサルモネラ属菌を特定することができる。
すなわち、ＰＣＲ法などにより得られた増幅産物を本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに滴下し、これに固定化されたプローブにハイブリダイゼーションをした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の畜産物、食品、環境中に存在しているサルモネラ属菌を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋製罐グループエンジリアリング株式会社のGENOGATE（R） readerを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal to Noise ratio）として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためである。
後述する実施例で用いたマイクロアレイの場合、Ｓ／Ｎ比値が３．０以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
後述する実施例で用いたマイクロアレイの場合、Ｓ／Ｎ比値が３．０以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
以上説明した本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法によれば、サルモネラ インファンティスの検出における一部の菌株についての誤判定を防止でき、かつ、サルモネラ ウィルヒョウの検出における誤判定を防止することが可能である。また、これらの血清型に加えて、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウム、及びサルモネラ ハーダーを含む複数の血清型を同時に特異的に判別することが可能である。
以下、本発明の実施形態に係るサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット、ＰＣＲ産物、サルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイ、サルモネラ属菌血清型判別用キット、及びサルモネラ属菌血清型判別方法の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
［試験１］
本試験では、従来は検出できなかったサルモネラ インファンティスの一部の菌株（Salmonella Infantis ATCC BAA-1675株，以下、サルモネラ インファンティス（Ａ）と称する場合がある。）を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、検出できることの確認を行った。
本試験では、従来は検出できなかったサルモネラ インファンティスの一部の菌株（Salmonella Infantis ATCC BAA-1675株，以下、サルモネラ インファンティス（Ａ）と称する場合がある。）を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、検出できることの確認を行った。
具体的には、図４に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットを用いた実験を実施例１とし、同じくサルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットを用いた実験を実施例２とした。
また、サルモネラ インファンティスに特異的な従来のプライマーセットとして、比較例１～９のものを準備した。
また、サルモネラ インファンティスに特異的な従来のプライマーセットとして、比較例１～９のものを準備した。
配列番号４８及び４９のプライマーセットと、配列番号５０及び５１のプライマーセットと、配列番号５２及び５３のプライマーセットは、特許文献１に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例１，２，３とした。
配列番号５４及び５５のプライマーセットは、特許文献２に記載のものであり、これを用いた実験を比較例４とした。
配列番号５４及び５５のプライマーセットは、特許文献２に記載のものであり、これを用いた実験を比較例４とした。
配列番号５６及び５８のプライマーセットと、配列番号５７及び５８のプライマーセットは、非特許文献１に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例５，６とした。
配列番号５９及び６０のプライマーセットは、非特許文献２に記載のものであり、これを用いた実験を比較例７とした。
配列番号６１及び６３のプライマーセットと、配列番号６２及び６３のプライマーセットは、非特許文献３に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例８，９とした。
配列番号５９及び６０のプライマーセットは、非特許文献２に記載のものであり、これを用いた実験を比較例７とした。
配列番号６１及び６３のプライマーセットと、配列番号６２及び６３のプライマーセットは、非特許文献３に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例８，９とした。
まず、８０２培地の調製を行った。具体的には、以下の試薬を混合後、試験管に１０ｍＬずつ分注し、１２１℃、１５分間で滅菌した。ｐＨは７．０に調整した。
（１）ハイポリペプトン（日水製薬社製） １０ｇ
（２）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製） ２ｇ
（３）ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ（富士フィルム和光純薬社製） １ｇ
（４）蒸留水 １Ｌ
（１）ハイポリペプトン（日水製薬社製） １０ｇ
（２）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製） ２ｇ
（３）ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ（富士フィルム和光純薬社製） １ｇ
（４）蒸留水 １Ｌ
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。菌株は、次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル２：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
ATCC: American Type Culture Collection
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル２：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
この菌株を８０２培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液としては、サンプルごとに、サルモネラ インファンティス検出用プライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社または株式会社ファスマックにより合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
そして、電気泳動装置（MultiNA、島津製作所）により、電気泳動を行い、増幅産物の有無を確認した。その結果を図５に示す。
同図において、比較例１～３はレーン１、比較例４はレーン２、比較例５はレーン３、比較例６はレーン４、比較例７はレーン５、比較例８はレーン６、比較例９はレーン７、実施例１はレーン８、実施例２はレーン９に示されている。
同図において、比較例１～３はレーン１、比較例４はレーン２、比較例５はレーン３、比較例６はレーン４、比較例７はレーン５、比較例８はレーン６、比較例９はレーン７、実施例１はレーン８、実施例２はレーン９に示されている。
この結果から明らかなように、比較例１～９のレーンでは、サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675は、検出されていない。これに対して、実施例１，２では、同菌株を検出できることが確認された。
［試験２］
本試験では、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、サルモネラ ウィルヒョウの検出において、サルモネラ ケンタッキーの偽陽性判定を防止できることの確認を行った。
本試験では、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、サルモネラ ウィルヒョウの検出において、サルモネラ ケンタッキーの偽陽性判定を防止できることの確認を行った。
具体的には、図６に示すように、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットを用いた実験を実施例３とし、同じくサルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットを用いた実験を実施例４とした。
また、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な従来のプライマーセットとして、配列番号４及び６３のプライマーセットと、配列番号５及び６３のプライマーセットを準備した。
配列番号４及び６３のプライマーセットと、配列番号５及び６３のプライマーセットは、非特許文献３に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例１０，１１とした。
また、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な従来のプライマーセットとして、配列番号４及び６３のプライマーセットと、配列番号５及び６３のプライマーセットを準備した。
配列番号４及び６３のプライマーセットと、配列番号５及び６３のプライマーセットは、非特許文献３に記載のものであり、これらを用いた実験をそれぞれ比較例１０，１１とした。
まず、８０２培地の調製を試験１と同様に行った。
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル２：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル３：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル２：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル３：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
これらの菌株を８０２培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液としては、サンプルごとに、サルモネラ ウィルヒョウ検出用プライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
そして、電気泳動装置（MultiNA、島津製作所）により、電気泳動を行い、増幅産物の有無を確認した。その結果を図７に示す。
同図において、比較例１０はレーン１、比較例１１はレーン２、実施例３はレーン３、実施例４はレーン４に示されている。
同図において、比較例１０はレーン１、比較例１１はレーン２、実施例３はレーン３、実施例４はレーン４に示されている。
この結果から明らかなように、比較例１０，１１のレーンでは、サルモネラ ウィルヒョウを検出できているが、サルモネラ ケンタッキーも検出しており、偽陽性が生じていることが分かる。これに対して、実施例３，４のレーンでは、サルモネラ ウィルヒョウを検出でき、かつ、サルモネラ ケンタッキーは検出されていない。このように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットによれば、サルモネラ ウィルヒョウについての誤判定を防止できることが確認された。
［試験３］
本試験では、サルモネラ インファンティスの菌株２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウの菌株１菌株を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、これらを同時に特異的に検出できることの確認を行った。
本試験では、サルモネラ インファンティスの菌株２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウの菌株１菌株を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、これらを同時に特異的に検出できることの確認を行った。
具体的には、図８に示すように、従来は検出できなかったサルモネラ インファンティスの菌株（サルモネラ インファンティス（Ａ））に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、従来から検出できていたサルモネラ インファンティスの菌株（以下、サルモネラ インファンティス（Ｂ）と称する場合がある。）に特異的な配列番号７及び８のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットを実施例用として準備した。
また、サルモネラ インファンティスに特異的な配列番号６１及び６３の従来のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６３の従来のプライマーセットを比較例用として準備した。これらは、非特許文献３に記載のものである。
また、サルモネラ インファンティスに特異的な配列番号６１及び６３の従来のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６３の従来のプライマーセットを比較例用として準備した。これらは、非特許文献３に記載のものである。
まず、８０２培地の調製を試験１と同様に行った。
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC 51741
サンプル２：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル３：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル４：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル５：サンプル１～３の菌株全て
サンプル６：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC 51741
サンプル２：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル３：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル４：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル５：サンプル１～３の菌株全て
サンプル６：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
これらの菌株を８０２培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液としては、各実施例及び比較例のサンプルごとに、それぞれ上記各プライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μMプライマー 各０．４μＬ
（４）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（５）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（６）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
そして、電気泳動装置（MultiNA、島津製作所）により、電気泳動を行い、増幅産物の有無を確認した。その結果を図９に示す。
同図において、比較例は左側のレーン１～６（それぞれ比較例１２～１７）に示されており、実施例は右側のレーン１～６（それぞれ実施例５～１０）に示されている。
同図において、比較例は左側のレーン１～６（それぞれ比較例１２～１７）に示されており、実施例は右側のレーン１～６（それぞれ実施例５～１０）に示されている。
比較例では、サンプル２のサルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675を供試菌株とするレーン２において、当該菌株が検出できていないことが分かる。また、サンプル４のサルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786 を供試菌株とするレーン４において、当該菌株が誤検出されていることが分かる。
これに対して、実施例では、サンプル２のサルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675を供試菌株とするレーン２において、当該菌株が検出できていることが分かる。また、サンプル４のサルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786 を供試菌株とするレーン４において、当該菌株が誤検出されていない。
さらに、サンプル５のサンプル１～３の菌株全てを供試菌株とするレーン５において、サルモネラ インファンティス２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウ１菌株をそれぞれ識別することが可能になっている。
さらに、サンプル５のサンプル１～３の菌株全てを供試菌株とするレーン５において、サルモネラ インファンティス２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウ１菌株をそれぞれ識別することが可能になっている。
このように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットによれば、サルモネラ インファンティス２菌株と、サルモネラ ウィルヒョウ１菌株を偽陰性や偽陽性を生じることなく検出することができ、さらにこれらをそれぞれ識別して、特異的に検出することが可能になっている。
［試験４］
本試験では、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、これらを同時に特異的に検出できることの確認を行った。
本試験では、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を対象として、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセットを用いることにより、これらを同時に特異的に検出できることの確認を行った。
具体的には、図１０に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットと、サルモネラ インファンティス（Ｂ）に特異的な配列番号７及び８のプライマーセットと、サルモネラ エンテリティディスに特異的な配列番号９及び１０のプライマーセットと、サルモネラ ティフィムリウムに特異的な配列番号１１及び１２のプライマーセットと、サルモネラ ハーダーに特異的な配列番号１３及び１４のプライマーセットと、サルモネラ属に特異的な配列番号１５及び１６のプライマーセットを準備した。
また、上記のサルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的なプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的なプライマーセットの組み合わせに代えて、その他の組み合わせのプライマーセットを準備した。
具体的には、図１５のプライマーの欄に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットの組み合わせのもの、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットの組み合わせのもの、並びに、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットの組み合わせのものを準備した。
具体的には、図１５のプライマーの欄に示すように、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号４及び６のプライマーセットの組み合わせのもの、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号１及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットの組み合わせのもの、並びに、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的な配列番号２及び３のプライマーセットと、サルモネラ ウィルヒョウに特異的な配列番号５及び６のプライマーセットの組み合わせのものを準備した。
まず、８０２培地の調製を試験１と同様に行った。
また、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を定法に従い作成し、試験管に１０ｍＬずつ分注し、１２１℃、１５分間で滅菌した。
また、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を定法に従い作成し、試験管に１０ｍＬずつ分注し、１２１℃、１５分間で滅菌した。
次いで、サルモネラ属菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。菌株は、以下のものを使用した。これらの菌株は、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
GTC: 岐阜大学
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
GTC: 岐阜大学
サンプル１：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC BAA-1675
サンプル２：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル３：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC 51741
サンプル４：サルモネラ エンテリティディス Salmonella Enteritidis GTC 03838
サンプル５～９：サルモネラ ティフィムリウム Salmonella Typhimurium 順にNBRC 13245、GTC 02577、GTC 11393、GTC 11566、GTC 14142
サンプル１０：サルモネラ ハーダー Salmonella Hadar ATCC 51956
サンプル１１：サンプル１～５、１０の菌株全て
サンプル２：サルモネラ ウィルヒョウ Salmonella Virchow ATCC 51955
サンプル３：サルモネラ インファンティス Salmonella Infantis ATCC 51741
サンプル４：サルモネラ エンテリティディス Salmonella Enteritidis GTC 03838
サンプル５～９：サルモネラ ティフィムリウム Salmonella Typhimurium 順にNBRC 13245、GTC 02577、GTC 11393、GTC 11566、GTC 14142
サンプル１０：サルモネラ ハーダー Salmonella Hadar ATCC 51956
サンプル１１：サンプル１～５、１０の菌株全て
サンプル１２：サルモネラ アバエテツーバ Salmonella Abaetetuba ATCC 35640
サンプル１３：サルモネラ アゴナ Salmonella Agona ATCC BAA-707
サンプル１４：サルモネラ アルバニー Salmonella Albany ATCC 51960
サンプル１５：サルモネラ アナツム Salmonella Anatum ATCC 9270
サンプル１６：サルモネラ バレリー Salmonella Bareilly ATCC 9115
サンプル１７：サルモネラ ブレデニー Salmonella Bredney ATCC 10728
サンプル１８：サルモネラ セロ Salmonella Cerro GTC 02554
サンプル１９：サルモネラ ダービー Salmonella Derby ATCC 6960
サンプル２０：サルモネラ エッセン Salmonella Essen GTC 12814
サンプル２１：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル１３：サルモネラ アゴナ Salmonella Agona ATCC BAA-707
サンプル１４：サルモネラ アルバニー Salmonella Albany ATCC 51960
サンプル１５：サルモネラ アナツム Salmonella Anatum ATCC 9270
サンプル１６：サルモネラ バレリー Salmonella Bareilly ATCC 9115
サンプル１７：サルモネラ ブレデニー Salmonella Bredney ATCC 10728
サンプル１８：サルモネラ セロ Salmonella Cerro GTC 02554
サンプル１９：サルモネラ ダービー Salmonella Derby ATCC 6960
サンプル２０：サルモネラ エッセン Salmonella Essen GTC 12814
サンプル２１：サルモネラ ケンタッキー Salmonella Kentucky GTC 12786
サンプル２２：サルモネラ ムバンダカ Salmonella Mbandaka ATCC 51958
サンプル２３～２６：サルモネラ モンテビデオ Salmonella Montevideo 順にATCC BAA-710、ATCC BAA-1735、ATCC 8387、GTC 02525
サンプル２７～２８：サルモネラ ニューポート Salmonella Newport 順にATCC 5962、ATCC 27869
サンプル２９：サルモネラ パラティフィC Salmonella Paratyphi C ATCC 9068
サンプル３０：サルモネラ プーナ Salmonella Poona NCTC 4840
サンプル３１：サルモネラ セントポール Salmonella Saintpaul ATCC 9712
サンプル２３～２６：サルモネラ モンテビデオ Salmonella Montevideo 順にATCC BAA-710、ATCC BAA-1735、ATCC 8387、GTC 02525
サンプル２７～２８：サルモネラ ニューポート Salmonella Newport 順にATCC 5962、ATCC 27869
サンプル２９：サルモネラ パラティフィC Salmonella Paratyphi C ATCC 9068
サンプル３０：サルモネラ プーナ Salmonella Poona NCTC 4840
サンプル３１：サルモネラ セントポール Salmonella Saintpaul ATCC 9712
サンプル３２：サルモネラ シュワルツェングルント Salmonella Schwarzengrund GTC 12055
サンプル３３：サルモネラ センフテンベルク Salmonella Senftenberg ATCC 8400
サンプル３４：サルモネラ タラハシー Salmonella Tallahassee ATCC 12002
サンプル３５：サルモネラ テネシー Salmonella Tennessee ATCC 10722
サンプル３６～３７：サルモネラ トンプソン Salmonella Thompson 順にATCC BAA-1604、ATCC 8391
サンプル３８：サルモネラ ヴェールール Salmonella Vellore ATCC 15611
サンプル３９：サルモネラ エンテリカ亜種サラマエ Salmonella enterica subsp. Salamae ATCC43972
サンプル４０：サルモネラ ボンゴリ Salmonella bongori ATCC 43975
サンプル４１：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
※３９～４１以外はSalmonalla enterica subsp. enterica
サンプル３３：サルモネラ センフテンベルク Salmonella Senftenberg ATCC 8400
サンプル３４：サルモネラ タラハシー Salmonella Tallahassee ATCC 12002
サンプル３５：サルモネラ テネシー Salmonella Tennessee ATCC 10722
サンプル３６～３７：サルモネラ トンプソン Salmonella Thompson 順にATCC BAA-1604、ATCC 8391
サンプル３８：サルモネラ ヴェールール Salmonella Vellore ATCC 15611
サンプル３９：サルモネラ エンテリカ亜種サラマエ Salmonella enterica subsp. Salamae ATCC43972
サンプル４０：サルモネラ ボンゴリ Salmonella bongori ATCC 43975
サンプル４１：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
※３９～４１以外はSalmonalla enterica subsp. enterica
これらの菌株を８０２培地又はＢＨＩ培地を用いて、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間震盪培養した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（サイトロープ社製）の説明書に沿って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液としては、サンプルごとに、上記のプライマーセットが含まれる次の組成のものを２０μＬ作成した。プライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μM インファンティス（Ａ）用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（４）10μM インファンティス（Ａ）用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（５）10μM ウィルヒョウ用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（６）10μM ウィルヒョウ用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（７）10μM インファンティス（Ｂ）用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（８）10μM インファンティス（Ｂ）用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（９）10μM エンテリティディス用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） １．０μＬ
（１０）10μM エンテリティディス用プライマー（Ｒ） ０．２μＬ
（１１）10μM ティフィムリウム用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（１２）10μM ティフィムリウム用プライマー（Ｒ） ０．０４μＬ
（１３）10μM ハーダー用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．５μＬ
（１４）10μM ハーダー用プライマー（Ｒ） ０．１μＬ
（１５）10μM サルモネラ属菌用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（１６）10μM サルモネラ属菌用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（１７）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（１８）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（１９）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
（１）ＰＣＲ buffer（QIAGEN社製） ２．０μＬ
（２）dNTP mix（Cat BR0600503, biotechrabbit社製） ０．４μＬ
（３）10μM インファンティス（Ａ）用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（４）10μM インファンティス（Ａ）用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（５）10μM ウィルヒョウ用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（６）10μM ウィルヒョウ用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（７）10μM インファンティス（Ｂ）用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（８）10μM インファンティス（Ｂ）用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（９）10μM エンテリティディス用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） １．０μＬ
（１０）10μM エンテリティディス用プライマー（Ｒ） ０．２μＬ
（１１）10μM ティフィムリウム用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（１２）10μM ティフィムリウム用プライマー（Ｒ） ０．０４μＬ
（１３）10μM ハーダー用プライマー（Ｆ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．５μＬ
（１４）10μM ハーダー用プライマー（Ｒ） ０．１μＬ
（１５）10μM サルモネラ属菌用プライマー（Ｆ） ０．０４μＬ
（１６）10μM サルモネラ属菌用プライマー（Ｒ）（5’末端にCyanine5修飾） ０．２μＬ
（１７）HotStarTaq DNA Polymerase（Cat No.203203, QIAGEN社製） ０．１μＬ
（１８）Template DNA（10ng/PCR用反応液） 各２．０μl
（１９）滅菌水（全体が２０．０μＬになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorff社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
サルモネラ属菌の血清型判別用マイクロアレイとして、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、配列番号１７～４７のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。
配列番号１７～２１は、サルモネラ インファンティス（Ａ）を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２２～２４は、サルモネラ ウィルヒョウを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２５～２９は、サルモネラ インファンティス（Ｂ）を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３０～３５は、サルモネラ エンテリティディスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３６～４０は、サルモネラ ティフィムリウムを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４１～４４は、サルモネラ ハーダーを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４５～４７は、サルモネラ属を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。
ハイブリダイゼーション用の反応液は、以下のように調製した。
ＰＣＲ産物を９５℃で５分間処理し、急冷した。また、ハイブリダイゼーション用バッファー２μＬとＰＣＲ産物４μＬをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ社製）内でハイブリダイゼーションを行った。
ＰＣＲ産物を９５℃で５分間処理し、急冷した。また、ハイブリダイゼーション用バッファー２μＬとＰＣＲ産物４μＬをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ社製）内でハイブリダイゼーションを行った。
次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（GENOGATE（R）reader、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社）を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。Ｓ／Ｎ比値が３以上の場合に陽性と判定した。その結果を図１１～図１５に示す。
そして、標識検出装置（GENOGATE（R）reader、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社）を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。Ｓ／Ｎ比値が３以上の場合に陽性と判定した。その結果を図１１～図１５に示す。
図１１に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ インファンティス（Ａ）、サルモネラ ウィルヒョウ、サルモネラ インファンティス（Ｂ）、サルモネラ エンテリティディス、サルモネラ ティフィムリウム、サルモネラ ハーダー、及びサルモネラ属の全てについて、偽陰性を生じることなく、同時に特異的に検出できることが確認された。
また、図１２～１４に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ属のその他の血清型について、偽陽性を生じることがないことが確認された。
また、図１２～１４に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ属のその他の血清型について、偽陽性を生じることがないことが確認された。
さらに、図１５に示すように、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット及びサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイによれば、サルモネラ インファンティス（Ａ）に特異的なプライマーセット２種類と、サルモネラ ウィルヒョウに特異的なプライマーセット２種類とを全ての組み合わせで用いた場合でも、ほぼ偽陰性を生じることなく、同時に特異的に検出できることが確認された。
具体的には、ウィルヒョウ用プライマーセットとして配列番号５及び６の組み合わせを使用した場合は、配列番号２４のウィルヒョウ用プローブは偽陰性となったが、その他の組み合わせでは、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を同時に特異的に検出することが可能であった。
具体的には、ウィルヒョウ用プライマーセットとして配列番号５及び６の組み合わせを使用した場合は、配列番号２４のウィルヒョウ用プローブは偽陰性となったが、その他の組み合わせでは、サルモネラ属菌の５血清型６菌株を同時に特異的に検出することが可能であった。
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象であるサルモネラ属菌以外の細菌等を検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。
例えば、本実施形態のサルモネラ属菌血清型判別用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象であるサルモネラ属菌以外の細菌等を検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。
本発明は、畜産物、食品、環境等の衛生管理の分野などにおいて、サルモネラ属菌の血清型を特異的に検出する場合に好適に利用することが可能である。
Claims (3)
- 下記の（１）～（２）に示されるプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：
（１）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号２に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（２）サルモネラ ウィルヒョウ（Salmonella Virchow）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号４に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット、及び／又は、
フォワードプライマーが配列番号５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーセット
である。 - 請求項1記載のプライマーセットと共に、下記の（３）～（５）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：
（３）サルモネラ インファンティス（Salmonella Infantis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号７に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（４）サルモネラ エンテリティディス（Salmonella Enteritidis）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号９に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（５）サルモネラ ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１１に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーセットである。 - 請求項1又は２記載のプライマーセットと共に、下記の（６）～（７）に示されるプライマーセットから選択される少なくともいずれかのプライマーセットを含むことを特徴とするサルモネラ属菌血清型判別用プライマーセット：
（６）サルモネラ ハーダー（Salmonella Hadar）に特異的なプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１３に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーセットである；
（７）サルモネラ属菌（Salmonella spp.）に特異的なinvA遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットであって、
フォワードプライマーが配列番号１５に示される塩基配列からなり、
リバースプライマーが配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーセットである。
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