KR102411940B1 - 살모넬라 종 판별용 프로브 조성물 및 이를 포함하는 살모넬라 종 판별용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살모넬라 혈청군 D 그룹에 속하는 혈청형을 구별하기 위한 DNA 분자마커와 프라이머/프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 세부적으로 5종의 살모넬라 D 그룹 혈청형 판별용 SNP 및 특정 혈청형 특이 염기서열과 이를 특이적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응법의 프로브 및 프라이머 세트, 상기 프로브 및 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 살모넬라 혈청군 D 그룹 혈청형 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 기존의 방법보다 신속하고 정확하게 혈청형을 판별할 수 있으며, 혈청형 판별을 위한 키트를 제공할 수 있다.

Description

살모넬라 종 판별용 프로브 조성물 및 이를 포함하는 살모넬라 종 판별용 키트{Probe composition for identifying Salmonella species and kit for identifying Salmonella species comprising the same}

본 발명은 살모넬라 혈청군 D 그룹에 속하는 혈청형을 구별하기 위한 DNA 분자마커와 프라이머/프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 5종의 살모넬라 D 그룹 혈청형 판별용 SNP 및 특정 혈청형 특이 염기서열과 이를 특이적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응법의 프로브 및 프라이머 세트, 상기 프로브 및 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 살모넬라 혈청군 D 그룹 혈청형 판별 방법에 관한 것이다.

Salmonella spp.는 통성혐기성 그람음성 간균으로 장내세균과에 속하며, 동물과 사람에 장염, 위장염 및 패혈증 등을 일으키는 인수공통전염병의 원인균으로 알려져 있다. Salmonella spp.는 Salmonellosis의 원인체로 동물의 장관 내에 상재하고 있으며 주로 오염된 날고기, 가공육류(가공육, 돈육 ,우육), 과일 및 야채 등에서도 식중독이 발생되고 있다. 현재까지 Salmonella spp.는 약 2,500 종류의 다양한 혈청형이 있으며, Salmonella enterica serotype Enteritidis (S. Enteritidis)와 Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium)가 식중독 사고를 일으키는 주요 혈청형이다.

또한 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 Salmonella spp.와 숙주 특이성이 없는 Salmonella spp.로 구분되고 있다. S. typhi와 S. paratyphi A는 주로 사람에 대해 숙주 특이성을 나타내며, S. dublin은 소, S. choleraesuis는 돼지, S. abortus equi는 말, S. abortus ovis는 양에 주로 감염되어 병원성을 나타낸다. S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum 등은 숙주 특이성이 없이 다양한 동물에 감염되어 병원성을 나타낸다.

현재 사료에서 유해미생물로 관리되고 있는 Salmonella D그룹 (Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis, Salmonella Dublin, Salmonella Pullorum, Salmonella Gallinarum, Salmonella Ontario)를 검출하는 방법은 대부분 증균 배양에 의한 검사법으로 전 증균, 선택 증균, 선택 배양, 확인 시험, 혈청군 결정 시험을 통해 최종적으로 Salmonella D 그룹을 확인하는데 5~7일 정도 소요된다. 이러한 방법은 사료 중 유해미생물 검출을 위해 많은 시간이 소요되어 미생물의 신속검출법으로 사용하기에 한계가 있으며 과도한 노동력이 필요로 하여 효율성이 떨어지는 문제점이 있다. 최근 분자생물학적 분석기술의 발달로 DNA 분자수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자마커 개발이 활발히 진행되고 있으며, PCR (Polymerase chain reaction) 기술에 기반을 둔 다양한 DNA 분석기법이 유전자마커 분석에 이용되고 있다. 특히 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 방법은 추가적인 전기영동 과정 없이 실시간으로 검출 결과를 확인할 수 있어 신속검사법으로 활용되고 있다.

현재까지 살모넬라 속 균 검출을 위한 PCR 기반의 분자생물학적 연구는 OriC, phoE, rfb, fim, spvA, sef, inv 등 다양한 표적 유전자를 대상으로 유전자마커 개발연구가 시도된 바 있다. 특히 rfb 유전자는 살모넬라 A, B, C2, D 혈청형을 구분할 수 있는 유용한 부위임이 확인되었으며, rfbS 유전자의 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 이용하여 항원 구조상 매우 유사하지만 닭에서 확연히 다른 질병의 원인이 되는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)과 풀로룸(Salmonella Pullorim)을 판별하는 분석기법이 연구된 바 있다. 그러나 사료에서 유해미생물로 관리되고 있는 살모넬라 D 그룹의 주요 혈청형을 모두 구별할 수 있는 분자생물학적인 방법은 현재까지 보고된바 없다.

등록특허공보 제10-1412120호 등록특허공보 제10-1828574호

본 발명의 목적은 사료에서 유해미생물로 관리되고 있는 살모넬라 D 그룹 주요 혈청형을 구별할 수 있는 분자마커(SNP)와 분자마커 특이 실시간 중합효소 연쇄반응법, 그리고 이를 이용한 살모넬라 D 그룹 주요 혈청형 판별 키트 및 판별 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 살모넬라 D 그룹 주요 혈청형을 구별할 수 있는 SNP와 이를 이용한 프로브 또는 프로브 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 프로브에 프라이머를 더 포함하는 프라이머 세트 조성물 및 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 살모넬라 종 판별용 키트를 제공하고자 한다.

추가적으로 본 발명은 상기 프로브 또는 프로브 조성물, 상기 프라이머 세트 조성물 중 어느 하나를 이용하여 살모넬라 종을 판별하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에서의 살모넬라 D 그룹은 살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 풀로룸(Salmonella Pullorum), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 파라티피-A (Salmonella Paratyphi-A) 중 어느 하나 이상을 포함한다.

본 발명에서의 서열번호 1은 살모넬라 속을 판별할 수 있는 염기서열이며; 상기 서열번호 2는 살모넬라 티피(Salmonella Typhi) 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열이며; 서열번호 3는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열이며; 서열번호 4는 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin) 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열이며; 서열번호 5는 살모넬라 풀로룸(Salmonella Pullorum) 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열이며; 서열번호 6는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열이며; 서열번호 7는 살모넬라 파라티피-A(Salmonella Paratyphi-A) 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열이다. 서열번호 8은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 혈청형의 fliC 유전자 염기서열이며; 서열번호 9은 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin) 혈청형의 fliC 유전자 염기서열이다. 서열번호 10은 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin) 혈청형의 vagC 유전자 염기서열이다.

상기 서열번호 2 내지 7의 염기서열은 각 염기서열의 163번째, 276번째, 372번째, 373번째, 402번째, 584번째, 634번째, 637번째, 639번째, 641번째, 663번째, 708번째, 717번째, 725번째, 726번째, 833번째 염기에 위치하는 SNP를 포함한다. 또한, 서열번호 6 내지 7의 염기서열은 각 염기서열의 659번째, 944번째, 952번째 염기에 위치하는 SNP를 포함한다.

상기 용어 “분자마커”는 살모넬라 균종 또는 혈청형을 구별할 수 있는 SNP 대립형질 또는 특정 혈청형 특이 염기서열을 의미한다.

상기 용어 “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”이란 유전체 상에서 A, T, G, C로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 치환된 것을 의미한다.

구체적으로, 서열번호 2 내지 7의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드는 각 염기서열 내에서 163번째 위치하는 염기는 G 또는 C; 276번째 위치하는 염기는 A 또는 G; 372번째 위치하는 염기는 A 또는 G; 373번째 위치하는 염기는 C 또는 T; 402번째 위치하는 염기는 T 또는 C; 584번째 위치하는 염기는 A 또는 G; 634번째 위치하는 염기는 A 또는 G; 637번째 위치하는 염기는 G 또는 A; 639번째 위치하는 염기는 T 또는 G; 641번째 위치하는 염기는 T 또는 C; 663번째 위치하는 염기는 G 또는 T; 708번째 위치하는 염기는 T 또는 C; 717번째 위치하는 염기는 A 또는 G; 725번째 위치하는 염기는 C 또는 T; 726번째 위치하는 염기는 C 또는 A; 833번째 위치하는 염기는 A 또는 G로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함할 수 있으며,

서열번호 8 내지 9의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오타이드는 각 염기서열 내에서 659번째 위치하는 염기는 T 또는 C; 944번째 위치하는 염기는 T 또는 C; 952번째 위치하는 염기는 G 또는 A로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 살모넬라 혈청형을 구별하기 위한 분자마커에 있어서, 서열번호 2 내지 7의 276번째, 372번째, 373번째, 637번째, 663번째 SNP로 이루어진 다형성 뉴클레오티드와 서열번호 8 내지 9의 944번째, 952번째 SNP로 이루어진 다형성 뉴클레오티드, 또는 서열번호 10의 염기서열을 함께 사용하여 살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 풀로룸(Salmonella Pullorum), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 파라티피-A (Salmonella Paratyphi-A) 혈청형을 판별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 분자마커 특이 실시간 중합효소 연쇄반응법으로 살모넬라 D 그룹 혈청형을 판별하는 서열번호 11 내지 31 중 어느 하나에 기재된 염기서열의 프로브 및 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 프로브 및 프라이머 세트를 이용하여 사료 유해미생물 살모넬라 균종 및 살모넬라 D 그룹 혈청형을 판별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 프로브 및 프라이머 세트와 분자마커 특이 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다.

추가적으로 본 발명에 따른 프로브 또는 프로브 조성물, 프라이머 세트 조성물은 사료의 생균제에 포함된 살모넬라 종을 판별할 수 있어서 사료 유해미생물 살모넬라 균종 및 살모넬라 D 그룹 혈청형을 판별하기 위한 키트를 제공할 수 있다.

사료 유해미생물 살모넬라 균종 및 살모넬라 D 그룹 혈청형 판별 키트는 단일 또는 다중 중합효소 연쇄반응, 또는 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으나, 바람직하게는 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.

본 발명에서 “중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 보편적으로 사용되며, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하는 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에서 용어 “분자마커 특이 실시간 중합효소연쇄반응”은 DNA 염기서열 상의 SNP 대립형질 또는 특정 혈청형 특이 염기서열에 특이성을 갖는 프라이머와 프로브 세트를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응 기법이다.

본 발명에서 용어 “프로브 및 프라이머 세트”는 포워드(Forward) 프라이머 및 리버스(Reverse) 프라이머를 포함하는 2종의 프라이머 및, 1종의 프로브 또는 프로브 조성물을 포함한다.

프라이머(Primer)는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 말하며, 중합효소연쇄반응에 있어서 복제, 증폭되는 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다.

본 발명에서 SNP 대립형질 특이 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머는 프라이머 말단 염기가 SNP 염기와 결합되거나 결합되지 못하는 특징을 이용하는 증폭 불응성 돌연변이 시스템(Amplification refactory mutation system, ARMS) 기법이 적용될 수 있도록 설계된 프라이머를 제공한다.

프로브(Probe)는 프라이머에 의해 복제, 증폭되는 핵산 가닥의 염기서열과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 중합효소연쇄반응으로 복제되는 핵산의 양을 실시간으로 검출하기 위해 올리뉴클레오타이드 양말단에 형광물질을 포함할 수 있다. 각 프로브의 양말단에 표지되는 형광물질은 각각 리포터(reporter)와 소광제(quencher)로써 역할을 수행한다.

상기 ‘리포터(reporter)’는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하며, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TAMRA, Quasar610, Quasar670, 시아닌(Cyanine) 계열 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 리포터가 FAM, JOE, Quasar670, TAMRA로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기, ‘소광제(quencher)’는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher, BHQ), 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 소광제는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 복수의 SNP 대립형질 또는 특정 혈청형 특이 염기서열을 동시에 분석하는 다중 실시간 중합효소연쇄반응 기법을 제공한다.

본 발명에서 “다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)”은 복수의 프로브 및 프라이머 세트를 동시에 사용하여 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭하는 것으로, 동시에 사용되는 프로브들은 각각 다른 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 리포터를 포함할 수 있다. 상기 리포터는 바람직하게는 “FAM, JOE, TAMRA, Quaza670”일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 키트에서 상기 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프로브 및 프라이머 세트 조성물은 제1 프로브 및 프라이머 세트 내지 제7 프로브 및 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브 및 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

구체적으로, 제1 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 11의 염기서열 및 서열번호 12의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제2 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열 및 서열번호 15의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제3 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 17의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제4 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 20의 염기서열 및 서열번호 21의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 22의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제5 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 25의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제6 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 26의 염기서열 및 서열번호 27의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 28의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제7 프로브 및 프라이머 세트는 서열번호 29의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 31의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함한다.

또한, 상기 프로브 및 프라이머 세트 조성물은 내부 대조구 유전자(Internal control)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 32의 염기서열 및 서열번호 33의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 34의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하는 프로브 및 프라이머 세트를 추가적으로 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 내부 대조구는 동일한 검체 튜브에 목표로 하지 않은 염기서열을 넣어서 목표로 하는 염기서열과 동시에 증폭되게 하여 중합효소연쇄반응의 오작동, 시약의 적절성 또는 중합효소의 활성 또는 방해물질에 의한 증폭방해를 동정하기 위한 목적으로 사용된다.

또한, 본 발명은 선택 증균 및 확인단계를 거지치 않고 전 증균과정 후 살모넬라 D 그룹 혈청형을 분자동정하기 위한 키트를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는:

a) 살모넬라 균종 및 D 그룹 혈청형을 구분할 수 있는 분자마커를 발굴하는 단계;

b) 살모넬라 D 그룹 혈청형 간 탐색된 단일염기다형성을 포함한 분자마커에 특이성을 갖는 실시간 중합효소 연쇄반응용 프라이머와 프로브를 선발하는 단계;

c) 상기 b)의 프라이머 및 프로브를 사용하여 분자마커 특이 실시간중합효소 연쇄반응을 하는 단계;

d) 상기 c)의 단계 후 유전자 증폭 유무를 측정하는 단계;

e) 상기 d)의 단계 후 분자마커의 증폭 유무 조합으로 살모넬라 혈청형을 판별하는 단계;

살모넬라 D 그룹 주요 혈청형을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 분자마커를 이용하여 살모넬라 D 그룹 혈청형을 신속 정확하게 분석할 수 있으므로, 이는 사료의 유해물질로 관리되고 있는 살모넬라 균 오염 여부의 신속한 판별과 살모넬라 혈청군 결정을 위한 혈청학적 검사를 대신할 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 각각 살모넬라 혈청형의 rfbS 유전자 염기서열과 fliC 유전자 염기서열 비교 후 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 살모넬라 혈청형 표준 DNA를 대상으로 분자마커 특이 다중 실시간 중합효소연쇄반응으로 분석한 분자마커 별 증폭 곡선과 증폭 여부 판단 결과를 ‘+/-’로 나타낸 도면이다. 각 마커별 증폭곡선 중에서 초록색 선은 내부 대조구의 증폭 결과를 보여주는 것이며, 빨강색과 파랑색 선은 같은 반응액 중에서 각 마커별 증폭 결과를 보여주는 것이다. 여기서 각 마커 별 +, - 판단은 각각의 표적 분자마커에 대해 Ct 값이 ‘15 ~ 30’으로 측정되는 증폭 곡선이 보이는 경우 ‘+’로 판정하고, 증폭 곡선이 없거나 Ct 값이 ‘31’ 이상인 경우 ‘-’로 판정하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것을 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 표준 균주 준비

살모넬락 속 균 15종과 비살모넬라 균 3종은 America Type Culture Collection(ATCC), 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC), 한국수의유전자원은행(Korea Veterinary Culture Collection, KVCC), The National Collection of Type Cultures, NCTC)에서 관리되고 있는 균주를 분양받았다 (표 1).

연번	구분	균종명	그룹	출처 (균주번호)
1	살모넬라 표준균주	Salmonella enterica subsp. Paratyphi-A	A	ATCC 9150
2		Salmonella Typhimurium	B	ATCC 14028/NCTC 12023
3		Salmonella Typhimurium	B	ATCC 13311/KCTC 2514
4		Salmonella enterica Paratyphi-B	B	ATCC 8759
5		Salmonella enterica subsp. Paratyphi-C	C	ATCC 13428
6		Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis	C1	ATCC 10708
7		Salmonella entericas ubsp. enterica serovar Newport	C2	ATCC 6962
8		Salmonella Pullorum	D1	ATCC 13036
9		Salmonella Enteritidis	D1	ATCC 13076
10		Salmonella enterica subsp. Gallinarum	D1	ATCC 9184
11		Salmonella enterica subsp. Dublin	D1	ATCC 39184
12		Salmonella Senftenberg	E4	KVCC 0590
13		Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Anatum	E	ATCC 9270
14		Salmonella enterica subsp. Senftenberg	E4	ATCC 43845
15		Salmonella Abaetetube	F	NCTC 8244
16	비 살모넬라 표준균주	Bacillus subtilis		KCTC 3135
17		Bifidobacterium bifidum		KCTC 3357
18		E. coli

분양받은 표준균주는 각각의 영양 배지에 획선 도말(streaking)하여 37℃에서 24시간 배양하였다.

실시예 2: 표준 균주 DNA 추출

각 표준 균주의 활성 배양체로부터 DNeasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출 및 정제하였으며, 세부 방법은 키트 제조사의 프로토콜에 따랐다. 추출 및 정제된 DNA는 DS-11 Spectrophotometer (DeNovix)를 이용하여 농도와 순도를 확인한 후 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.

실시예 3: DNA 분자마커 발굴 대상 유전자 선발

살모넬라균 검출을 위한 분자생물학적 연구자료를 분석하여 ‘invA, rfbS, fliC, vagC, 이상 4종의 분자마커 발굴 대상 유전자를 선발하였다(표 2). ‘invA’ 유전자는 상피세포에 대한 침습성에 관여하는 유전자이며 살모넬라 속 균 감염 여부 판정에 사용되는 주요 표적 유전자이다. ‘vagC’ 유전자는 살모넬라 독성 플라스미드 상에 위치하며 살모넬라 듀블린 혈청형 특이 유전자로 알려져 있다. ‘rfbS’ 유전자는 살모넬라 O 항원의 당구조 형성을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자이며 살모넬라 A 또는 D 혈청군 검출에 사용되고 있다. ‘fliC’ 유전자는 세균성 편모 형성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자이며 살모넬라 혈청형의 편모 유형 결정에 관여하는 것으로 알려져 있다.

	유전자명	기능	용도
1	invA	상피세포에 대한 침습성 관여	살모넬라 속 검출
2	rfbS	항원 노출 당구조 구성	D 그룹 혈청형 판별
3	fliC	세균성 편모 형성 관여	S. Dublin과 S. Enteritidis 판별
4	vagC	병원성 관련 단백질	S. Dublin과 S. Enteritidis 판별

실시예 4: DNA 분자마커 발굴 대상 유전자 염기서열 정보 수집

선발된 각 유전자의 염기서열 정보는 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 대표 염기서열을 임의 선택하여 추출하였다(표 3). InvA 유전자 염기서열은 살모넬라 엔테리카 85-120 균주의 유전체 정보(CP054715.1)에서 추출하여 대표 서열로 사용하였으며, vagC 유전자 염기서열은 살모넬라 듀블린의 플라스미드 유전체 정보(DQ115388.2)에서 추출하여 대표 서열로 사용하였다. RfbS 유전자 염기서열은 살모넬라 티피는 CT18 균주의 유전체 정보(NC_003198.1)에서, 살모넬라 엔테리티디스는 NCCP 16206 균주의 유전체 정보(CP041973.1)에서, 살모넬라 듀블린은 ATCC 39184 균주의 유전체 정보(CP019179.1)에서, 살모넬라 풀로룸은 QJ-2D-Sal 균주의 유전체 정보(CP022963.1)에서, 살모넬라 갈리나룸은 287/91 균주의 유전체 정보(AM933173.1)에서 살모넬라 파라티피 A는 ATCC 9150 균주의 유전체 정보(NC_006511.1)에서 각각 추출하여 대표 서열로 사용하였다. FliC 유전자 염기서열은 살모넬라 엔테리티디스는 NCPP 16206 균주의 유전체 정보(CP041973.1)에서, 살모넬라 듀블린은 ATCC 39184 균주의 유전체 정보(CP019179.1)에서 각각 추출하여 대표 서열로 사용하였다.

Target gene	Serotype	Accession #	Strain	Regions	서열번호
invA		CP054715.1	85-0120	2262009-2264066	1
rfbS	Typhi	NC_003198.1	CT18	c2128879-2128040	2
	Enteritidis	CP041973.1	NCCP 16206	806331-807170	3
	Dublin	CP019179.1	ATCC 39184	1776461-1777285	4
	Pullorum	CP022963.1	QJ-2D-Sal	1927414-1928253	5
	Gallinarum	AM933173.1	287/91	c2166528-2165689	6
	Paratyphi A	NC_006511.1	ATCC 9150	867754-868593	7
fliC	Enteritidis	CP041973.1	NCCP 16206	1833910-1835427	8
	Dublin	CP019179.1	ATCC 39184	c2803688-2802171	9
vagC	Dublin	DQ115388.2	pOU1115	12276-12578	10

실시예 5: DNA 분자마커 발굴 대상 유전자 특이성 확인

선발된 DNA 분자마커 발굴 대상 유전자들의 균 특이성 및 혈청형 특이성을 확인하기 위해 인실리코 분석과 PCR 분석을 시행하였다. 인실리코 분석은 미국 국립생물정보센터의 GenBank 데이터베이스와 BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 도구를 이용하였으며, PCR 분석은 18종의 표준균주로부터 추출 정제된 DNA를 대상으로 아래 표 4와 같이 설계된 각 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR 산물 생성 여부를 확인하는 방식을 적용하였다(표 4).

표적 유전자	이름	염기서열(5'-3')	PCR 산물 크기 (bp)
invA	Sal-invA-F	GCGCGCGAACGACGAAGCGT	155
	Sal-invA-R	GGCGGGTCATCCCCACCGAA
rfbS	SeD-rfbS-F2	ATGGGAGCGTTTGGGTTCCTT	819
	SeD-rfbS-R2	CCCTTCCTCTTCAATTATTTCAGTT
vagC	vagC-OF	CACACACCCGGTGCAATGA	298
	vagC-OR	ATAGCTCAAAGCGTCCTTCGTC
fliC	fliC-OF	AGCCTTGGCCTTGATGGGTTC	558
	fliC-OR	TTTCGCACTCTCGTTTTTGGTTT

분석결과 invA 유전자는 살모넬라 속 균 특이 유전자임을 확인할 수 있었으며, vagC 유전자는 연구문헌 정보와 달리 살모넬라 듀블린 이외에 플로룸 혈청형과 일부 갈리나룸 혈청형에서도 확인되었다. PCR 분석결과 rfbS 유전자는 살모넬라 D 그룹 혈청형과 살모넬라 파리피티 A 혈청형에서만 확인되었으며, fliC 유전자는 살모넬라 D1과 E4 그룹 혈청형에서 확인되었다(표 5).

연번	Serotype	그룹	출처	유전자 존재(PCR 산물 형성 유무)
				invA	rfbS	vagC	fliC
1	Paratyphi A	A	ATCC 9150	O	O	X	X
2	Typhimurium	B	ATCC 14028	O	X	X	X
3	Typhimurium	B	ATCC 13311	O	X	X	X
4	Paratyphi B	B	ATCC 8759	O	X	X	X
5	Paratyphi C	C	ATCC 13428	O	X	X	X
6	Choleraesuis	C1	ATCC 10708	O	X	X	X
7	Newport	C2	ATCC 6962	O	X	X	X
8	Pullorum	D1	ATCC 13036	O	O	O	O
9	Enteritidis	D1	ATCC 13076	O	O	X	O
10	Gallinarum	D1	ATCC 9184	O	O	X	O
11	Dublin	D1	ATCC 39184	O	O	O	O
12	Senftenberg	E4	KVCC 0590	O	X	X	O
13	Anatum	E	ATCC 9270	O	X	X	X
14	Senftenberg	E4	ATCC 43845	O	X	X	O
15	Abaetetube	F	NCTC 8244	O	X	X	X

실시예 6: rfbS와 fliC 유전자 염기서열 변이 분석

‘BioEdit Sequence Alignment Editor’(version 7.0.5.3) 분석도구의 염기서열 비교 기능(ClustalW Multiple alignment)을 이용하여 국립생물정보센터(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 수집한 10종의 대표 염기서열을 비교분석 하였다. 분석결과 rfbS 대표 염기서열(서열번호 2 내지 7)에서 16개의 SNP, 그리고 fliC 대표 염기서열(서열번호 8 내지 9)에서 3개의 SNP를 확인하였다(도 2).

실시예 7: 표준 균주의 rfbS와 fliC 유전자 염기서열 분석 및 SNP 형질 확인

국립생물정보센터(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 수집된 대표 염기서열 비교분석을 통해 확인된 19개의 SNP 변이를 실험적으로 검증하기 위해서 실시예 5에서 rfbS 또는 fliC 유전자가 확인된 표준 균주 6종의 rfbS와 fliC 유전자 염기서열을 ‘PCR products direct sequencing’ 기법으로 분석한 후 이들의 SNP 형질을 확인하였다(표 6).

표준 균주

위치 (형질)

rfbS gene

fliC gene

Serotype

ATCC#

163 (G/C)

276 (G/A)

372 (A/G)

373 (C/T)

402 (T/C)

584 (A/G)

634 (A/G)

637 (G/A)

639 (T/G)

641 (T/C)

663 (G/T)

708 (T/C)

717 (A/G)

725 (C/T)

726 (C/A)

833 (G/A)

659 (C/T)

944 (C/T)

952 (A/G)

Paratyphi A

ATCC9150

C

A

G

T

C

G

G

G

G

C

G

C

G

T

A

A

x

x

x

Pullorum

ATCC13036

G

G

A

C

T

A

A

G

T

T

G

T

A

C

C

G

C

C

A

Enteritidis

ATCC13076

G

A

A

C

T

A

A

G

T

T

G

T

A

C

C

G

C

C

A

Gallinarum

ATCC9184

G

A

A

C

T

A

A

A

T

T

G

T

A

C

C

G

C

C

A

Dublin

ATCC39184

G

A

A

C

T

A

A

G

T

T

G

T

A

C

C

G

T

T

G

Senftenberg

ATCC43845

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

C

C

G

실시예 8: 살모넬라 D 그룹 혈청형을 구분할 수 있는 분자마커 선발

각 혈청형 간의 염기서열 비교분석을 통해 확인된 19개 SNP 중 rfbS 유전자 염기서열에서 확인되는 4개의 SNP, fliC 유전자 염기서열에서 2개의 SNP와 vagC 유전자 염기서열로 구성된 살모넬라 D 그룹 혈청형 특이 분자마커 세트를 선발하였다. SNP의 선택 기준은 1) 아미노산의 치환, 2) 다중 qPCR 분석에 적합한 위치, 3) 프라이머 설계에 적합한 염기서열 구성 등을 반영하였다.

분자마커 세트는 rfbS 유전자 염기서열(서열번호 2 내지 7)의 276번째, 372번째, 373번째, 637번째, 663번째 SNP로 이루어진 다형성 뉴클레오티드와 fliC 유전자 염기서열(서열번호 8 내지 9)의 944번째, 952번째 SNP로 이루어진 다형성 뉴클레오티드 그리고 vagC 유전자 특이 염기서열(서열번호 10)로 구성된다(표 7).

rfbS SNP 형질				fliC SNP 형질		vagC	판정가능 혈청형
rfbS-276	rfbS-373	rfbS-637	rfbS-663	fliC-944	fliC-952
A	C	G	T	-	-	-	Salmonella Typhi
A	C	G	G	C	A	-	Salmonella Enteritidis
A	C	G	G	T	G	+	Salmonella Dublin
G	C	G	G	C	A	+	Salmonella Pullorum
A	C	A	G	C	A	-	Salmonella Gallinarum
A	T	G	G	-	-	-	Salmonella Paratyphi-A

실시예 9: 살모넬라 균종과 D 그룹 혈청형 특이 프로브 및 프라이머 세트 설계

살모넬라 속 균 특이 invA와 살모넬라 듀블린(S. Dublin)과 살모넬라 풀로룸(S. Pullorum) 혈청형 특이 vagC 유전자의 염기서열, 그리고 내부 대조구 용 벼 GAPDH 유전자의 염기서열에서 각 표적 유전자 특이 프라이머와 프로브를 설계하기 위하여 NCBI의 Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 도구를 이용하였다. 기본 값을 적용하였으며, 제시된 프로브 및 프라이머 세트 중에서 변이를 포함하지 않으면서 PCR 증폭 산물의 크기가 200 bp 이하인 것을 선택하였다. 프로브는 5‘말단에 있는 염기는 ‘G’가 아니어야 하며, 길이는 25nt 이하가 될 수 있도록 필요한 경우 수정하였다. 선택된 프라이머와 프로브는 Oligonucleotide Properties Calculator (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 도구를 이용하여 특성을 확인하였으며, NCBI의 BLAST 도구를 이용하여 각 프라이머와 프로브의 특이성을 인실리코 검증하였다.

증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS)을 적용하여 실시예 8에서 선택된 6개의 SNP 형질을 분석할 수 있는 프라이머 프로브를 설계하였다. 프라이머는 프로이머의 SNP 형질 구별성을 높이기 이해 3’말단에서 두 번째 위치의 염기(n-2)를 주형과 비상보적인 염기로 치환된 형태로 설계하였다. 염기 치환 기준은 A는 T로, T는 A로, C는 G로 G는 C로 하였다. 설계된 프라이머와 프로브는 Oligonucleotide Properties Calculator (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 도구를 이용하여 특성을 확인하였다. 하기 표 8에 분자마커 분석용 프로브 및 프라이머 세트를 정리하여 나타내었고, 여기서 F는 포워드 프라이머(Forward primer), R은 리버스 프라이머(Revese primer), P는 프로브(Probe)를 의미한다.

세트번호	서열번호	이름	염기서열(5'-3')	분석대상 분자마커
#1	11	Sal-rfbS_276-F	TTATTAACACTATTGCTTGCTATGG	rfbS gene SNP 276 (G/A)
	12	Sal-rfbS_276-R	CTGCATCAAGTGATGAGATAcAT
	13	Sal-rfbS_276-P2	Q670-ACATAACGAACCTGCAACAGCTT-BHQ3
#2	14	Sal-rfbS_373-F	CATATACTAAACAAAAAGCAAATGtAC	rfbS gene SNP 372/373 (AC/GT)
	15	Sal-rfbS_373-R	CTGGTAAACTTATCGTCTCCATC
	16	Sal-rfbS_373-P	FAM-CGCCGCCGCCATTATAGATA-BHQ3
#3	17	Sal-rfbS_663-F	AAAGATCTACTAACAGCGTTCGAT	rfbS gene SNP 637 (G/A)
	18	Sal-rfbS_637-R	TCTACATATTCACGAATTGATATtGT
	19	Sal-rfbS_663-P	FAM-CCCCAAATTTCATAGTATTGAAGTT-BHQ1
#4	20	Sal-rfbS_663-F	AAAGATCTACTAACAGCGTTCGAT	rfbS gene SNP 663 (G/T)
	21	Sal-rfbS_663-R	TTGCTTTTTGTGATATTTTTAACAcTC
	22	Sal-rfbS_663-P	FAM-CCCCAAATTTCATAGTATTGAAGTT-BHQ1
#5	23	Dub-vagC-F1	ATTTTGAGGGGGTGAGCGAG	vagC gene
	24	Dub-vagC-R1	GGTCAGCTTTTTCGAGCTGC
	25	Dub-vagC-P	Q670-TCGTCCGGGAAGGGGACA-BHQ3
#6	26	Sal-invA-F	GCGCGCGAACGACGAAGCGT	invA gene
	27	Sal-invA-R1	CCACCGAAATACCGCCAATA
	28	Sal-invA-P1	Q670-ACGCTATTGCCGGCATCA-BHQ3
#7	29	Sal-fliC-952-F	TGGTGATGACGGTAATGGTAAGG	fliC gene SNP 944 (T/C) & 952 (G/A)
	30	Sal-fliC-952-R	GTAGCAGCATTAACATCgGC
	31	Sal-fliC-952-P	Q670-GCGCCAATGGCAATATCAGCG-BHQ3
#8	32	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	벼 GAPDH gene
	33	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC
	34	IC-P	JOE-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ2

실시예 10: 플라스미드 형 표준 DNA 제작

살모넬라 D 그룹 혈청형 판별 키트를 구성하는 양성 표준물질과 내부 대조구 표준물질로 활용되거나 분자마커 특이 실시간 중합효소연쇄반응 조건 최적화 실험에 이용될 수 있는 10종의 플라스미드 형 표준 DNA를 제작하였다.

플라스미드 형 표준 DNA 제작은 실시예 5의 유전자 특이 프라이머를 이용한 각 혈청형의 표적 유전자 별 PCR 산물과 TOPcloner TA kit(Enzynomics, Korea)를 이용하거나 EZchange Site-directed Mutagenesis kit(Enzynomics, Korea)를 이용하였다. 세부 방법은 각 키트 매뉴얼에 따라 실시하였다.

표준 DNA ‘S.Ent/Dub-rfbS-STD’는 살모넬라 혈청형 엔테리티디스와 듀블린의 rfbS 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Pul-rfbS-STD’는 살모넬라 혈청형 플로룸의 rfbS 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Par-rfbS-STD’는 살모넬라 혈청형 파라티피 A의 rfbS 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Gal-rfbS-STD’는 살모넬라 혈청형 갈리나룸의 rfbS 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Typ-rfbS-STD’는 살모넬라 혈청형 티피의 rfbS 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Ent-fliC-STD’는 살모넬라 혈청형 엔테리티디스의 fliC 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Dub-fliC-STD’는 살모넬라 혈청형 듀블린의 fliC 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.spp-invA-STD’는 살모넬라 속 특이 invA 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘S.Dub-vagC-STD’는 살모넬라 혈청형 듀블린의 vagC 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이며; 표준 DNA ‘IC-STD’는 벼의 GAPDH 유전자 염기서열을 포함하는 플라스미드이다.

실시예 11: 다중 실시간 중합효소연쇄반응조건 최적화 및 프라이머와 프로브의 분자마커 특이성 확인

ABI7500 Real-Time PCR System을 이용하는 최적의 다중 실시간 중합효소연쇄반응물 조성과 반응조건을 결정하였다.

표적 유전자 증폭에 사용되는 중합효소는 SNP 형질 선택성을 강화시킨 M-Taq-qPCRMix(GenoTech, Korea)를 사용하였다. M-Taq-qPCRMix는 개량된 Taq DNA 중합효소와 완충용액, dNTP mixture 및 안정화 물질이 최적의 비율로 혼합된 제품이다.

다중 실시간 중합효소연쇄반응을 위해 프라이머 및 프로브는 3 종류의 올리고 혼합물을 준비하였다(표 9). 올리고 혼합물 #1은 내부 대조구(IC)와 SNP 분자마커 rfbS-276과 rfbS-663 프로브 및 프라이머 세트를 포함하며; 올리고 혼합물 #2는 내부 대조구(IC)와 SNP 분자마커 rfbS-373과 vagC 프로브 및 프라이머 세트를 포함하며; 올리고 세트 #3는 내부 대조구(IC)와 SNP 분자마커 rfbS-637과 invA 프로브 및 프라이머 세트를 포함한다.

구분	세트번호	서열번호	이름	농도	분석대상	비고
				(pmol/ul)
올리고혼합물#1	#8	32	IC-F	10	내부대조구 (벼 GAPDH gene)	초록색
		33	IC-R	10
		34	IC-P	5
	#1	11	Sal-rfbS_276-F	10	rfbS gene SNP 276 (G/A)	파랑색
		12	Sal-rfbS_276-R	10
		13	Sal-rfbS_276-P2	5
	#4	20	Sal-rfbS_663-F	10	rfbS gene SNP 663 (G/T)	빨강색
		21	Sal-rfbS_663-R	10
		22	Sal-rfbS_663-P	5
올리고혼합물#2	#8	32	IC-F	10	내부대조구 (벼 GAPDH gene)	초록색
		33	IC-R	10
		34	IC-P	5
	#5	23	Dub-vagC-F1	10	vagC gene	파랑색
		24	Dub-vagC-R1	10
		25	Dub-vagC-P	5
	#2	14	Sal-rfbS_373-F	10	rfbS gene SNP 372/373 (AC/GT)	빨강색
		15	Sal-rfbS_373-R	10
		16	Sal-rfbS_373-P	5
올리고혼합물#3	#8	32	IC-F	10	내부대조구 (벼 GAPDH gene)	초록색
		33	IC-R	10
		34	IC-P	5
	#6	26	Sal-invA-F	10	invA gene	파랑색
		27	Sal-invA-R1	10
		28	Sal-invA-P1	5
	#3	17	Sal-rfbS_663-F	10	rfbS gene SNP 637 (G/A)	빨강색
		18	Sal-rfbS_637-R	10
		19	Sal-rfbS_663-P	5

다중 실시간 중합효소연쇄반응의 주형 DNA는 실시예 10에서 준비된 플라스미드 형 표준 DNA를 혼합하여 준비하였다(표 10). 표준 DNA 혼합물 #1은 IC-STD, S.spp-invA-STD 그리고 S.Typ-rfbS-STD를 각각 동일한 농도로 혼합시켜 제조하였으며 이는 살모넬라 티피의 유전형질을 반영하며; 표준 DNA 혼합물 #2는 IC-STD, S.spp-invA-STD 그리고 S.Ent/Dub-rfbS-STD를 각각 동일한 농도로 혼합시켜 제조하였으며 이는 살모넬라 엔테리티디스의 유전형질을 반영하며; 표준 DNA 혼합물 #3는 IC-STD, S.spp-invA-STD, S.Ent/Dub-rfbS-STD 그리고 S.Dub-vagC-STD를 각각 동일한 농도로 혼합시켜 제조하였으며 이는 살모넬라 듀블린의 유전형질을 반영하며; 표준 DNA 혼합물 #4는 IC-STD, S.spp-invA-STD, S.Pul-rfbS-STD 그리고 S.Dub-vagC-STD를 각각 동일한 농도로 혼합시켜 제조하였으며 이는 살모넬라 플로룸의 유전형질을 반영하며; 표준 DNA 혼합물 #5는 IC-STD, S.spp-invA-STD 그리고 S.Gal-rfbS-STD를 각각 동일한 농도로 혼합시켜 제조하였으며 이는 살모넬라 갈리나룸의 유전형질을 반영하며; 표준 DNA 혼합물 #6는 IC-STD, S.spp-invA-STD 그리고 S.Par-rfbS-STD를 각각 동일한 농도로 혼합시켜 제조하였으며 이는 살모넬라 파라피티 A의 유전형질을 반영한다.

구분	ID	구성	농도 (copies/ul)	비고
표준 DNA 혼합물 #1	S. Typ-STD	IC-STD	10^6
		S.ssp-invA-STD	10^6	S. Typhi 형질과 동일
		S.Typ-rfbS-STD	10^6
표준 DNA 혼합물 #2	S. Ent-STD	IC-STD	10^6
		S.ssp-invA-STD	10^6	S. Enteritidis 형질과 동일
		S.Ent/Dub-rfbS-STD	10^6
표준 DNA 혼합물 #3	S. Dub-STD	IC-STD	10^6
		S.ssp-invA-STD	10^6	S. Dublin 형질과 동일
		S.Ent/Dub-rfbS-STD	10^6
		S.Dub-vagC-STD	10^6
표준 DNA 혼합물 #4	S. Pul-STD	IC-STD	10^6
		S.ssp-invA-STD	10^6	S. Pullorum 형질과 동일
		S.Pul-rfbS-STD	10^6
		S.Dub-vagC-STD	10^6
표준 DNA 혼합물 #5	S. Gal-STD	IC-STD	10^6
		S.ssp-invA-STD	10^6	S. Gallinarum 형질과 동일
		S.Gal-rfbS-STD	10^6
표준 DNA 혼합물 #6	S. Par-STD	IC-STD	10^6
		S.ssp-invA-STD	10^6	S. Paratypi-A 형질과 동일
		S.Par-rfbS-STD	10^6

다중 실시간 중합효소연쇄반응물은 다음과 같은 조건으로 제조하였다; 5x M-Taq-qPCRMix 4 ㎕, 올리고 혼합물 1 ㎕, 표준 DNA 혼합물 1 ㎕, 증류수 14 ㎕를 첨가하여 총량이 20 ㎕가 되도록 하였다.

반응조건은 95℃에서 2분간 변성시킨 다음 95℃에서 30초, 55℃에서 40초 반응을 35회 반복 수행하였으며, 반응결과는 7500 software v2.3을 이용하여 확인하였다.

상기의 다중 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 이용하였을 때, 데이터 해독은 각각의 표적 분자마커에 대해 Ct 값이 ‘15 ~ 30’으로 측정되는 증폭 곡선이 보이는 경우 ‘+’로 판정하고, 증폭 곡선이 없거나 Ct 값이 ‘31’ 이상인 경우 ‘-’로 판정하였다.

실시예 12: 분자마커 유전형 조합을 이용한 살모넬라 혈청형 판별

상기 실시예 11에서 다중 실시간 중합효소 연쇄반응으로 분석된 각 마커별 유전형은 ‘+’ 또는 ‘-’로 판정 후 살모넬라 균종 및 D 그룹 혈청형을 판별할 수 있는 판별표를 제작하였다(표 11).

구분	올리고 혼합물#1			올리고 혼합물#2			올리고 혼합물#3
Marker	IC	rfbS-276	rfbS-663	IC	vagC	rfbS-373	IC	invA	rfbS-637
Real-time PCR	JOE	Q670	FAM	JOE	FAM	Q670	JOE	Q670	FAM
PCR fail	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Non-Salmonella	+	-	-	+	-	-	+	-	-
Salmonella (non-serogroup D/A)	+	-	-	+	-	-	+	+	-
Salmonella Enteritidis	+	+	+	+	-	+	+	+	-
Salmonella Dublin	+	+	+	+	+	+	+	+	-
Salmonella Pullorum	+	-	+	+	+	+	+	+	-
Salmonella Paratyphi-A	+	+	+	+	-	-	+	+	-
Salmonella Gallinarum	+	+	+	+	-	+	+	+	+
Salmonella Typhi	+	+	-	+	-	+	+	+	-

상기 실시예 1의 표준 균주를 대상으로 다중 실시간 중합효소연쇄반응 분석을 시행한 후 판별표를 기준으로 각 표준균주의 분석결과를 해독한 결과 살모넬라 균 여부 및 살모넬라 혈청형이 정확하게 판정되었다(표 12).

표준 시료		실시간 중합효소연쇄반응 결과 해독						판정
연번	균주번호	invA	rfbS-276	rfbS-373	rfbS-637	rfbS-663	vagC
1	ATCC 9150	+	+	-	-	-	-	Salmonella Paratyphi-A
2	ATCC 14028	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
3	ATCC 13311	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
4	ATCC 8759	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
5	ATCC 13428	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
6	ATCC 10708	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
7	ATCC 6962	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
8	ATCC 13036	+	-	+	-	+	+	Salmonella Pullorum
9	ATCC 13076	+	+	+	-	+	-	Salmonella Enteritidis
10	ATCC 9184	+	+	+	+	+	-	Salmonella Gallinarum
11	ATCC 39184	+	+	+	-	+	+	Salmonella Dublin
12	KVCC 0590	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
13	ATCC 9270	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
14	ATCC 43845	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
15	NCTC 8244	+	-	-	-	-	-	Salmonella spp. (non-serogroup D/A)
16	KCTC 3135	-	-	-	-	-	-	Non-Salmonella
17	KCTC 3357	-	-	-	-	-	-	Non-Salmonella
18	E. coli	-	-	-	-	-	-	Non-Salmonella

<110> National Agricultural Products Quality Management Service(NAQS) <120> Probe composition for identifying Salmonella species and kit for identifying Salmonella species comprising the same <130> 21-12107 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2058 <212> DNA <213> Salmonella enterica <400> 1 gtgctgcttt ctctacttaa cagtgctcgt ttacgacctg aattactgat cctggtacta 60 atggtgatga tcatttctat gttcgtcatt ccattaccta cctatctggt tgattttctg 120 atcgcactaa atatcgtact ggcgatttta gtgtttatgg ggtcgttcta cattgacaga 180 atcctcagtt tttcaacgtt tcctgcggta ctgttaatta caacgctctt tcgtctggca 240 ttatcgatca gtaccagtcg tcttattttg atcgaagctg atgccgggga aattatcgcc 300 acgttcgggc aattcgttat tggcgatagc ctggcggtgg gttttgttgt cttctctatt 360 gtcaccgtgg tccagtttat cgttattacc aaaggttcgg agcgcgtcgc ggaagtcgcg 420 gcccgatttt ctctggatgg tatgcccggt aaacagatga gtattgatgc cgatttgaag 480 gccggtatta ttgatgcgga tgccgcgcgc gaacgacgaa gcgtactgga aagggaaagc 540 cagctttatg gttcctttga cggtgcgatg aagtttatca aaggtgacgc cattgccggc 600 atcattatca tctttgtgaa ctttattggc ggtatttcgg tggggatgac ccgccatggt 660 atggatttat cctccgctct gtctacttat accatgctga ccattggtga tggtcttgtc 720 gcccagatcc ccgcattgtt gattgcgatt agtgccggtt ttatcgtgac tcgcgtcaat 780 ggcgatagcg ataatatggg gcggaatatc atgacgcagc tgttgaacaa cccatttgta 840 ttggttgtta cggctattct gaccatctca atggggactc tgccgggatt cccgctgcca 900 gtttttgtta ttctggcggt ggttttaagc gtgctcttct attttaaatt ccgtgaagca 960 aaacgtagcg ccgccaagcc taaaaccagt aaaggcgagc agccgctcag tattgaggaa 1020 aaagaaggaa cgtcgttagg actgattggc gatctcgata aagtctctac agagaccgta 1080 cctttgatat tactggtgcc gaaaagtcga cgtgaagatt tggagaaagc gcagcttgcg 1140 gatcgtttac gtagccagtt ctttattgac tatggtgtgc gcttgccgga ggtattatta 1200 cgcgatggtg agggcgtgag cgataacagc attgtattgt tgattaatga gatccgtgtt 1260 gaacaattta cggtctactt tgatttgatg cgcgtggtaa attattcgga tgaagtcgct 1320 tcctttggca ttaatccaac gacctatcat caaggtagta gtcagtattt ctgggtaacg 1380 catgaagaag gagaaaaact tcgggagctt ggttacgtgc tgcgaaatgc gcttgacgag 1440 ctttatcatt gtctggcggt gacactcgcg cgtaacgtca atgaatattt cggtattcag 1500 gaaacaaaac atatgctgga tcagctggag gcgaaatttc ctgatttact taaagaagtg 1560 ctcagacatg ccacggtgca acgtatctct gaagttttgc agcgtttgtt aagcgaacgt 1620 gtttccgtgc gtaatatgaa attaattatg gaagcgctcg cattgtgggc accaagagaa 1680 aaagacgtta ttaaccttgt ggaacatatt cgtggagcaa tggcgcgtta tatctgccat 1740 aaattcgcca atggcggtga attacgagca gtaatggtat cagctgaagt tgaggatgtt 1800 attcgcaaag ggatccgtca gacctctggc agtaccttcc tcagtcttga accggaggcc 1860 tccgctaatt tgatggatct cattacgctt aagctggatg atttattgat cgcacataaa 1920 gatcttgtcc tccttacgtc tgttgatgtc cgccgattta ttaagaagat gattgaaggt 1980 cgttttccgg atctggaggt tttgtctttc ggtgaaatag cagatagcaa gtcagtaaat 2040 gtcataaaaa caatataa 2058 <210> 2 <211> 840 <212> DNA <213> Salmonella typhi <400> 2 atgaaaattc taataatggg agcgtttggg ttccttggat cacgacttac atcctacttc 60 gaaagtcgac atactgtgat tggcttagca aggaagagga acaatgaagc taccataaat 120 aatattattt acacgacaga aaataattgg atcgaaaaaa tactagaatt tgaaccgaat 180 attattatta acactattgc ttgctatgga agacataacg aacctgcaac agctttaata 240 gaaagcaata ttcttatgcc tatcagagta ttagaatcta tctcatcact tgatgcagta 300 ttcataaatt gtggaacatc actgccacca aatacgagtt tatatgcata tactaaacaa 360 aaagcaaatg aactcgccgc cgccattata gataaagttt gcggtaaata tatagagtta 420 aaattggagc atttctatgg agcttttgat ggagacgata agtttaccag tatggttatt 480 agacgttgtt taagtaacca gccagtaaag ttaacatctg gtttgcaaca gagagatttc 540 ttgtatataa aagatctact aacagcgttc gattgtatta taagtaatgt taataatttc 600 cccaaatttc atagtattga agttggtagt ggagaggcga tatcaattcg tgaatatgta 660 gatactgtta aaaatatcac aaaaagcaat tctataattg aatttggcgt ggtcaaagaa 720 agagtaaatg aattgatgta tagttgtgct gatatagcag aacttgaaaa aataggatgg 780 aaaagagagt tctctcttgt tgatgcatta actgaaataa ttgaagagga agggaaatga 840 840 <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 3 atgaaaattc taataatggg agcgtttggg ttccttggat cacgacttac atcctacttc 60 gaaagtcgac atactgtgat tggcttagca aggaagagga acaatgaagc taccataaat 120 aatattattt acacgacaga aaataattgg atcgaaaaaa tagtagaatt tgaaccgaat 180 attattatta acactattgc ttgctatgga agacataacg aacctgcaac agctttaata 240 gaaagcaata ttcttatgcc tatcagagta ttagaatcta tctcatcact tgatgcagta 300 ttcataaatt gtggaacatc actgccacca aatacgagtt tatatgcata tactaaacaa 360 aaagcaaatg aactcgccgc cgccattata gataaagttt gtggtaaata tatagagtta 420 aaattggagc atttctatgg agcttttgat ggagacgata agtttaccag tatggttatt 480 agacgttgtt taagtaacca gccagtaaag ttaacatctg gtttgcaaca gagagatttc 540 ttgtatataa aagatctact aacagcgttc gattgtatta taaataatgt taataatttc 600 cccaaatttc atagtattga agttggtagt ggaaaggcta tatcaattcg tgaatatgta 660 gagactgtta aaaatatcac aaaaagcaat tctataattg aatttggtgt ggtcaaagaa 720 agagccaatg aattgatgta tagttgtgct gatatagcag aacttgaaaa aataggatgg 780 aaaagagagt tctctcttgt tgatgcatta actgaaataa ttgaagagga agggaaatga 840 840 <210> 4 <211> 840 <212> DNA <213> Salmonella dublin <400> 4 atgaaaattc taataatggg agcgtttggg ttccttggat cacgacttac atcctacttc 60 gaaagtcgac atactgtgat tggcttagca aggaagagga acaatgaagc taccataaat 120 aatattattt acacgacaga aaataattgg atcgaaaaaa tagtagaatt tgaaccgaat 180 attattatta acactattgc ttgctatgga agacataacg aacctgcaac agctttaata 240 gaaagcaata ttcttatgcc tatcagagta ttagaatcta tctcatcact tgatgcagta 300 ttcataaatt gtggaacatc actgccacca aatacgagtt tatatgcata tactaaacaa 360 aaagcaaatg aactcgccgc cgccattata gataaagttt gtggtaaata tatagagtta 420 aaattggagc atttctatgg agcttttgat ggagacgata agtttaccag tatggttatt 480 agacgttgtt taagtaacca gccagtaaag ttaacatctg gtttgcaaca gagagatttc 540 ttgtatataa aagatctact aacagcgttc gattgtatta taaataatgt taataatttc 600 cccaaatttc atagtattga agttggtagt ggaaaggcta tatcaattcg tgaatatgta 660 gagactgtta aaaatatcac aaaaagcaat tctataattg aatttggtgt ggtcaaagaa 720 agagccaatg aattgatgta tagttgtgct gatatagcag aacttgaaaa aataggatgg 780 aaaagagagt tctctcttgt tgatgcatta actgaaataa ttgaagagga agggaaatga 840 840 <210> 5 <211> 840 <212> DNA <213> Salmonella pullorum <400> 5 atgaaaattc taataatggg agcgtttggg ttccttggat cacgacttac atcctacttc 60 gaaagtcgac atactgtgat tggcttagca aggaagagga acaatgaagc taccataaat 120 aatattattt acacgacaga aaataattgg atcgaaaaaa tagtagaatt tgaaccgaat 180 attattatta acactattgc ttgctatgga agacataacg aacctgcaac agctttaata 240 gaaagcaata ttcttatgcc tatcagagta ttagagtcta tctcatcact tgatgcagta 300 ttcataaatt gtggaacatc actgccacca aatacgagtt tatatgcata tactaaacaa 360 aaagcaaatg aactcgccgc cgccattata gataaagttt gtggtaaata tatagagtta 420 aaattggagc atttctatgg agcttttgat ggagacgata agtttaccag tatggttatt 480 agacgttgtt taagtaacca gccagtaaag ttaacatctg gtttgcaaca gagagatttc 540 ttgtatataa aagatctact aacagcgttc gattgtatta taaataatgt taataatttc 600 cccaaatttc atagtattga agttggtagt ggaaaggcta tatcaattcg tgaatatgta 660 gagactgtta aaaatatcac aaaaagcaat tctataattg aatttggtgt ggtcaaagaa 720 agagccaatg aattgatgta tagttgtgct gatatagcag aacttgaaaa aataggatgg 780 aaaagagagt tctctcttgt tgatgcatta actgaaataa ttgaagagga agggaaatga 840 840 <210> 6 <211> 840 <212> DNA <213> Salmonella gallinarum <400> 6 atgaaaattc taataatggg agcgtttggg ttccttggat cacgacttac atcctacttc 60 gaaagtcgac atactgtgat tggcttagca aggaagagga acaatgaagc taccataaat 120 aatattattt acacgacaga aaataattgg atcgaaaaaa tagtagaatt tgaaccgaat 180 attattatta acactattgc ttgctatgga agacataacg aacctgcaac agctttaata 240 gaaagcaata ttcttatgcc tatcagagta ttagaatcta tctcatcact tgatgcagta 300 ttcataaatt gtggaacatc actgccacca aatacgagtt tatatgcata tactaaacaa 360 aaagcaaatg aactcgccgc cgccattata gataaagttt gtggtaaata tatagagtta 420 aaattggagc atttctatgg agcttttgat ggagacgata agtttaccag tatggttatt 480 agacgttgtt taagtaacca gccagtaaag ttaacatctg gtttgcaaca gagagatttc 540 ttgtatataa aagatctact aacagcgttc gattgtatta taaataatgt taataatttc 600 cccaaatttc atagtattga agttggtagt ggaaagacta tatcaattcg tgaatatgta 660 gagactgtta aaaatatcac aaaaagcaat tctataattg aatttggtgt ggtcaaagaa 720 agagccaatg aattgatgta tagttgtgct gatatagcag aacttgaaaa aataggatgg 780 aaaagagagt tctctcttgt tgatgcatta actgaaataa ttgaagagga agggaaatga 840 840 <210> 7 <211> 840 <212> DNA <213> Salmonella paratyphi <400> 7 atgaaaattc taataatggg agcgtttggg ttccttggat cacgacttac atcctacttc 60 gaaagtcgac atactgtgat tggcttagca aggaagagga acaatgaagc taccataaat 120 aatattattt acacgacaga aaataattgg atcgaaaaaa tactagaatt tgaaccgaat 180 attattatta acactattgc ttgctatgga agacataacg aacctgcaac agctttaata 240 gaaagcaata ttcttatgcc tatcagagta ttagaatcta tctcatcact tgatgcagta 300 ttcataaatt gtggaacatc actgccacca aatacgagtt tatatgcata tactaaacaa 360 aaagcaaatg agttcgccgc cgccattata gataaagttt gcggtaaata tatagagtta 420 aaattggagc atttctatgg agcttttgat ggagacgata agtttaccag tatggttatt 480 agacgttgtt taagtaacca gccagtaaag ttaacatctg gtttgcaaca gagagatttc 540 ttgtatataa aagatctact aacagcgttc gattgtatta taagtaatgt taataatttc 600 cccaaatttc atagtattga agttggtagt ggagaggcga catcaattcg tgaatatgta 660 gagactgtta aaaatatcac aaaaagcaat tctataattg aatttggcgt ggtcaaggaa 720 agagtaaatg aattgatgta tagttgtgct gatatagcag aacttgaaaa aataggatgg 780 aaaagagagt tctctcttgt tgatgcatta actgaaataa ttgaagagga agagaaatga 840 840 <210> 8 <211> 1518 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 8 atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60 tctcagtcct cactgagttc cgctattgag cgtctgtcct ctggtctgcg tatcaacagc 120 gcgaaagacg atgcggcagg ccaggcgatt gctaaccgct tcacttctaa tatcaaaggt 180 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggcatttcta ttgcgcagac cactgaaggt 240 gcgctgaatg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg agttgtctgt tcaggccact 300 aacgggacta actctgattc cgatctgaaa tctatccagg atgaaattca gcaacgtctg 360 gaagaaatcg atcgcgtttc taatcagact caatttaacg gtgttaaagt cctgtctcag 420 gacaaccaga tgaaaatcca ggttggtgct aacgatggtg aaaccattac catcgatctg 480 caaaaaattg atgtgaaaag ccttggcctt gatgggttca atgttaatgg gccaaaagaa 540 gcgacagtgg gtgatctgaa atccagcttc aagaatgtta cgggttacga cacctatgca 600 gcgggtgccg ataaatatcg tgtagatatt aattccggtg ctgtagtgac tgatgcagca 660 gcaccggata aagtatatgt aaatgcagca aacggtcagt taacaactga cgatgcggaa 720 aataacactg cggttgatct ctttaagacc actaaatcta ctgctggtac cgctgaagcc 780 aaagcgatag ctggtgccat taaaggtggt aaggaaggag atacctttga ttataaaggc 840 gtgactttta ctattgatac aaaaactggt gatgacggta atggtaaggt ttctactacc 900 atcaatggtg aaaaagttac gttaactgtc gctgatattg ccactggcgc gacggatgtt 960 aatgctgcta ccttacaatc aagcaaaaat gtttatacat ctgtagtgaa cggtcagttt 1020 acttttgatg ataaaaccaa aaacgagagt gcgaaacttt ctgatttgga agcaaacaat 1080 gctgttaagg gcgaaagtaa aattacagta aatggggctg aatatactgc taacgccacg 1140 ggtgataaga tcaccttagc tggcaaaacc atgtttattg ataaaacagc ttctggcgta 1200 agtacattaa tcaatgaaga cgctgccgca gccaagaaaa gtaccgctaa cccactggct 1260 tcaattgatt ctgcattgtc aaaagtggac gcagttcgtt cttctctggg ggcaattcaa 1320 aaccgttttg attcagccat taccaacctt ggcaatacgg taaccaatct gaactccgcg 1380 cgtagccgta tcgaagatgc tgactatgca acggaagttt ctaatatgtc taaagcgcag 1440 attctgcagc aggctggtac ttccgttctg gcgcaggcta accaggttcc gcaaaacgtc 1500 ctctctttac tgcgttaa 1518 <210> 9 <211> 1518 <212> DNA <213> Salmonella dublin <400> 9 atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60 tctcagtcct cactgagttc cgctattgag cgtctgtcct ctggtctgcg tatcaacagc 120 gcgaaagacg atgcggcagg ccaggcgatt gctaaccgct tcacttctaa tatcaaaggt 180 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggcatttcta ttgcgcagac cactgaaggt 240 gcgctgaatg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg agttgtctgt tcaggccact 300 aacgggacta actctgattc cgatctgaaa tctatccagg atgaaattca gcaacgtctg 360 gaagaaatcg atcgcgtttc taatcagact caatttaacg gtgttaaagt cctgtctcag 420 gacaaccaga tgaaaatcca ggttggtgct aacgatggtg aaaccattac catcgatctg 480 caaaaaattg atgtgaaaag ccttggcctt gatgggttca atgttaatgg gccaaaagaa 540 gcgacagtgg gtgatctgaa atccagcttc aagaatgtta cgggttacga cacctatgca 600 gcgggtgccg ataaatatcg tgtagatatt aattccggtg ctgtagtgac tgatgcagta 660 gcaccggata aagtatatgt aaatgcagca aacggtcagt taacaactga cgatgcggaa 720 aataacactg cggttgatct ctttaagacc actaaatcta ctgctggtac cgctgaagcc 780 aaagcgatag ctggtgccat taaaggtggt aaggaaggag atacctttga ttataaaggc 840 gtgactttta ctattgatac aaaaactggt gatgacggta atggtaaggt ttctactacc 900 atcaatggtg aaaaagttac gttaactgtc gctgatattg ccattggcgc ggcggatgtt 960 aatgctgcta ccttacaatc aagcaaaaat gtttatacat ctgtagtgaa cggtcagttt 1020 acttttgatg ataaaaccaa aaacgagagt gcgaaacttt ctgatttgga agcaaacaat 1080 gctgttaagg gcgaaagtaa aattacagta aatggggctg aatatactgc taacgccacg 1140 ggtgataaga tcaccttagc tggcaaaacc atgtttattg ataaaacagc ttctggcgta 1200 agtacattaa tcaatgaaga cgctgccgca gccaagaaaa gtaccgctaa cccactggct 1260 tcaattgatt ctgcattgtc aaaagtggac gcagttcgtt cttctctggg ggcaattcaa 1320 aaccgttttg attcagccat taccaacctt ggcaatacgg taaccaatct gaactccgcg 1380 cgtagccgta tcgaagatgc tgactatgca acggaagttt ctaatatgtc taaagcgcag 1440 attctgcagc aggctggtac ttccgttctg gcgcaggcta accaggttcc gcaaaacgtc 1500 ctctctttac tgcgttaa 1518 <210> 10 <211> 231 <212> DNA <213> Salmonella dublin <400> 10 atgagaaccg tatccatttt taaaaacggc aacaaccgcg ccatccgcct tccacgcgat 60 ctggattttg agggggtgag cgagctggaa atcgtccggg aaggggacag catcatcctg 120 cgccctgtcc ggccgacctg gggctcgttc gcgcagctcg aaaaagctga cccggacttt 180 atggcggagc gcgaggacgt tgtcagcgac gaaggacgct ttgagctatg a 231 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_276-F <400> 11 ttattaacac tattgcttgc tatgg 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_276-R <400> 12 ctgcatcaag tgatgagata cat 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_276-P2 <400> 13 acataacgaa cctgcaacag ctt 23 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_373-F <400> 14 catatactaa acaaaaagca aatgtac 27 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_373-R <400> 15 ctggtaaact tatcgtctcc atc 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_373-P <400> 16 cgccgccgcc attatagata 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_663-F <400> 17 aaagatctac taacagcgtt cgat 24 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_637-R <400> 18 tctacatatt cacgaattga tattgt 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_663-P <400> 19 ccccaaattt catagtattg aagtt 25 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_663-F <400> 20 aaagatctac taacagcgtt cgat 24 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_663-R <400> 21 ttgctttttg tgatattttt aacactc 27 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-rfbS_663-P <400> 22 ccccaaattt catagtattg aagtt 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dub-vagC-F1 <400> 23 attttgaggg ggtgagcgag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dub-vagC-R1 <400> 24 ggtcagcttt ttcgagctgc 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dub-vagC-P <400> 25 tcgtccggga aggggaca 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-invA-F <400> 26 gcgcgcgaac gacgaagcgt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-invA-R1 <400> 27 ccaccgaaat accgccaata 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-invA-P1 <400> 28 acgctattgc cggcatca 18 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-fliC-952-F <400> 29 tggtgatgac ggtaatggta agg 23 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-fliC-952-R <400> 30 gtagcagcat taacatcggc 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-fliC-952-P <400> 31 gcgccaatgg caatatcagc g 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-F <400> 32 aaggcagcta tcaagtaagt gt 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-R <400> 33 gtttcccctc agactcctcc 20 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-P <400> 34 ttgcccttac agaaagtgaa ga 22

Claims (7)

1. 서열번호 11 내지 31의 서열을 포함하는 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물로서,
   상기 살모넬라 종은 살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella Pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 프로브 및 프라이머 세트 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응법에 사용되는 것을 특징으로 하는 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 프로브 및 프라이머 세트 조성물은 사료의 생균제에 포함된 살모넬라 종을 판별할 수 있는 것을 특징으로 하는 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 프로브 및 프라이머 세트 조성물은 서열번호 32 내지 34의 서열을 갖는 내부 대조구 프로브 및 프라이머 세트를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물.
6. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물을 포함하는 살모넬라 종 판별용 키트로서,
   상기 살모넬라 종은 살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 플로룸(Salmonella Pullorum) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 살모넬라 종 판별용 키트.
7. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 살모넬라 종 판별용 프로브 및 프라이머 세트 조성물을 사용하여, 95℃에서 2분간 변성시킨 다음 95℃에서 30초, 55℃에서 40초 반응을 반복 수행하여 분자마커 특이 실시간중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;
   상기 분자마커 특이 실시간중합효소 연쇄반응 단계 후, 각각의 표적 분자마커에 대해 Ct 값이 ‘15 ~ 30’으로 측정되는 증폭 곡선이 보이는 경우 ‘+’로 판정하고, 증폭 곡선이 없거나 Ct 값이 ‘31’ 이상인 경우 ‘-’로 판정하여 유전자 증폭 유무를 측정하는 단계;
   상기 유전자 증폭 유무를 측정하는 단계 후 분자마커의 증폭 유무 조합으로 살모넬라 혈청형을 판별하는 단계;
   를 포함하는 살모넬라 종 판별 방법.

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