JP4189002B2 - 細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キット - Google Patents
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Description
(1)検出対象となる細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号1〜40、43〜56または57(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56または57)に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの群から選択される1以上のオリゴヌクレオチドが、基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
(2)バチルス(Bacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号1、2または3に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(3)ブレビバチルス(Brevibacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1に記載の細菌検出器具。
(4)アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号5に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(5)アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号6に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(6)ゲオバチルス(Geobacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号7に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(7)パエニバチルス(Paenibacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号3または8に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(8)バチルス・セレウス(Bacillus cereus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号9、10または11に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(9)バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号12、13または14に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(10)バチルス・スポロサーモデュランス(Bacillus sporothermodurans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号15、43または44に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(11)バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号16、17または18に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(12)バチルス・リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号19に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(13)バチルス・プミラス(Bacillus pumilus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号20または55に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(14)バチルス・レンタス(Bacillus lentus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号21ないし25のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(15)バチルス・ファルマス(Bacillus firmus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号26に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(16)バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号27に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(17)バチルス・ベンゾエヴォランス(Bacillus benzoevorans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号29または30に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(18)バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号31に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(19)バチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号32または33に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(20)アリシクロバチルス・アシドテレストリス(Alicyclobacillus acidoterrestris)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号34、35または36に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(21)アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号28または37に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(22)パエニバチルス・バリダス(Paenibacillus validus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号38、39または40に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(23)バチルス・スミシー(Bacillus smithii)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号45または46に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(24)アリシクロバチルス・アシディフィラス(Alicyclobacillus acidiphilus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号47、48または49に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(25)アリシクロバチルス・ヘスペリダム(Alicyclobacillus hesperidum)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号50または51に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(26)バチルス・フマリオリ(Bacillus fumarioli)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号52または53に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(27)バチルス・アシドジェネシス(Bacillus acidogenesis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号54に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(28)バチルス・ソノレンシス(Bacillus sonorensis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号56または57に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(29)配列番号1〜40、43〜56または57に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの全部が、基板に固定されている上記(1)に記載の細菌検出器具。
(30)上記被験試料中の細菌が、以下の(a)ないし(f)のいずれかに記載の細菌から選ばれる少なくとも1種類以上の細菌であることを特徴とする上記(1)ないし(29)のいずれか1項に記載の細菌検出器具。
(a)バチルス(Bacillus)属に属する細菌。
(b)ブレビバチルス(Brevibacillus)属に属する細菌。
(c)アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属に属する細菌。
(d)アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する細菌。
(e)ゲオバチルス(Geobacillus)属に属する細菌。
(f)パエニバチルス(Paenibacillus)属に属する細菌。
(31)上記基板にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることを特徴とする上記(1)ないし(30)のいずれか1項に記載の細菌検出器具。
(32)被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
上記(1)ないし(31)のいずれか1項に記載の細菌検出器具を用いて、基板に固定されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
(33)被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
配列番号1ないし40及び43〜57のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、当該オリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
(34)上記被検試料が食品であることを特徴とする、上記(32)または(33)に記載の細菌検出方法。
(35)上記食品が飲料であることを特徴とする、上記(34)に記載の細菌検出方法。
(36)上記飲料が清涼飲料水であることを特徴とする、上記(35)に記載の細菌検出方法。
(37)上記(32)ないし(36)のいずれか1項に記載の細菌検出方法を実施するための細菌検出キット。
(38)上記(32)ないし(36)のいずれか1項に記載の細菌検出方法を実施するためのキットであって、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含むことを特徴とする細菌検出キット。
(39)さらに、上記プローブ調製工程および/または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む上記(38)に記載の細菌検出キット。
本発明にかかる細菌検出器具は、被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定するものである。
本発明にかかる細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
本発明にかかる細菌検出器具の基板に固定されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドと被検試料由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、被検試料中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
AGATGGGCCCGCGGCGCATT(配列番号1)。
GACCCGCGGCGCATT(配列番号2)。
GGGCAACCTGCCTGTAAGAC(配列番号3)。
ACATAGGGAAACTTATGCTAA(配列番号4)。
GAGGAGCCCGCGGCGCATT(配列番号5)。
GAAGAACCGCCGGGA(配列番号6)。
ACACCGAAGACCGCATGGTC(配列番号7)。
GGGCAACCTGCCTGTAAGAC(配列番号3)。
GACGGTACCTGAGAAGAA(配列番号8)。
GATTAAGAGCTTGCTCTTATGAA(配列番号9)。
CCGCATGGTTCGAAAT(配列番号10)。
GCTAGTTGAATAAGCTGGC(配列番号11)。
TCGTGCGGACCTTTTAAAAG(配列番号12)。
CCGCATGGAGGAAAAAG(配列番号13)。
GCCGGGGAAGAACAAG(配列番号14)。
CTCCGCATGGAGAGAGATT(配列番号15)。
AAGAGCTTGCTTTTGATCAG(配列番号43)。
CTTCGCATGAAGGAGAATTG(配列番号44)。
GCATGGTTCAAACATAAAAG(配列番号16)。
GGCTACCACTTACA(配列番号17)。
GAGCTTGCTCCCTGATGTTA(配列番号18)。
TGCTCCCTTAGGTCAGCGGC(配列番号19)。
GGATGAAAGACGGTTT(配列番号20)。
CCGGATAGTTCCTTGAACCG(配列番号55)。
GAATGGATGGGAGCTTG(配列番号21)。
AGCTTGCTCCCAGAAG(配列番号22)。
TTCTCCTGGAGAAAGGTT(配列番号23)。
AGCTTGCTCCCAGAAGTT(配列番号24)。
CTGGAGAAAGGTTGAAAGAC(配列番号25)。
GAGGAAAAGCTGAAAGATGG(配列番号26)。
GAGCGGACTTTAAAAGCTTG(配列番号27)。
GAGCGGACTTAAAAAGCTTG(配列番号29)。
GAGCGGACTTTTGGGAG(配列番号30)。
TAGGATCTTCTCCTTCATGGG(配列番号31)。
TCGGCTGTCGCTATAGGATG(配列番号32)。
AAGTACAGTAGTAACTGGCT(配列番号33)。
TTTCAGACTGGAATAACACT(配列番号34)。
AATACACGGGTAGGCATCTA(配列番号35)。
GGAAAGCTCCTTGTGA(配列番号36)。
の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号28または37に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
TTGGGCCGCTGAGAGAG(配列番号28)。
CGCCCGCGAGGAGGCATCTT(配列番号37)。
GGGGCAACCTGTGGCTTAC(配列番号38)。
GCTAAGACCGGATAGCTGGT(配列番号39)。
CGCCTCGGAGAGTAA(配列番号40)。
AGCTTGCTTTTTGAAAGTTA(配列番号45)。
GATAATATCTTCCTTCGC(配列番号46)。
GTTCAAGGGAAGGCA(配列番号47)。
CCGTTGAGGAAAGTTGC(配列番号48)。
ATGCAACACTGATAGAG(配列番号49)。
GGTCACGAGGAGGCA(配列番号50)。
GCATCTTCTTGTGAGGA(配列番号51)
TTGCCCCTTGAGATTAG(配列番号52)。
TCATCCTTTCCTTCGC(配列番号53)。
CTTCTTCCTCCGCATGG(配列番号54)。
AGCGAACCGACGGGA(配列番号56)。
TCCCTTAGGTTAGCGGC(配列番号57)。
オリゴヌクレオチドの基板への固定法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明にかかる細菌検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し(米国特許:US5,908,746、特開平8−23975号)、固定することが好ましい。
本発明にかかる細菌検出方法は、被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含む、被検試料中の細菌を検出・同定するための方法である。本検出方法のハイブリダイゼーション工程においては、上記本発明にかかる細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本検出方法の被検試料としては、食品であることが好ましく、飲料であることがさらに好ましく、清涼飲料水であることが最も好ましい。以下各工程に分けて詳細に説明する。
被検試料中の細菌の核酸を調製する工程である。被検試料からの核酸の調製法は、公知の核酸の調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、DNAの調製は、R-F.Wangが紹介する方法に従って抽出することができる(Molecular and Cellular Probes(2000) 14, 1-5)。この方法は標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用してもよいことは言うまでもない。また、市販のキットを使用してもよい。
上記核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程である。プローブは、例えば、キャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列を含む領域を増幅するよう設計されたプライマーを使用して核酸増幅により作製することができる。核酸増幅の方法としては、例えば、PCRによりDNAとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション(in vitro transcription)法によりRNAとして増幅する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ハイブリダイゼーション工程は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程である。ハイブリダイゼーションは上記オリゴヌクレオチドを固定したメンブレン上等で行うことができるが、本発明にかかる細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。ハイブリダイゼーション工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリダイゼーション方法を適宜選択して用いることができる。以下に、具体的なハイブリダイゼーション方法の一例を示す。
シグナル検出工程は、上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程であり、通常上記ハイブリダイゼーション工程と連続的に行われる。
本発明にかかる細菌検出キットは、上述の本発明にかかる細菌検出方法を実施するためのキットである。したがって、本発明にかかる細菌検出方法を実施できるものであれば、キットに含まれる構成は特に限定されるものではない。
本発明にかかる細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットの用途は特に限定されるものではなく、細菌の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、細菌による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された細菌を迅速かつ正確に検出・同定する必要がある場合に好適に用いられる。
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機(Perkin-elmer Applied biosystems 社製)を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、10mM Tris-HCl(pH7.5)・1mM EDTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μlのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。本実施例に使用したすべてのオリゴヌクレオチドはこの方法で合成した。
5’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10μlに対してマイクロスポッティング溶液(TeleChem International Inc.製)を10μl混合し、マイクロタイタープレート(Greiner Laboratory Inc.製)上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラス Carbostation(日清紡績株式会社製、登録商標)を配置し、スポッティングマシンを作動させた。
スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
検体として用いた細菌は、バチルス(Bacillus)属に属するバチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・スポロサーモデュランス(Bacillus sporothermodurans)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・プミラス(Bacillus pumilus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・ファルマス(Bacillus firmus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・ベンゾエヴォランス(Bacillus benzoevorans)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus)、バチルス・スミシー(Bacillus smithii)、バチルス・フマリオリ(Bacillus fumarioli)、バチルス・アシドジェネシス(Bacillus acidogenesis)及びバチルス・ソノレンシス(Bacillus sonorensis)を用いた。
得られた各細菌のDNAを鋳型としてPCRによりプローブ核酸を調製した。PCR反応液の組成は、Taqポリメラーゼ:2.5unit、ビオチン化プライマー(配列番号41および42):各50 pmol、10×反応用緩衝液:5μl、dNTP:各10 nmol、鋳型DNA:100ngに滅菌蒸留水を加えて総量50μlとした。サーマルサイクラーを用いて、95℃で3分間保持した後、95℃:30秒間、57℃:30秒間、72℃:1分間の反応を40サイクル行い、72℃で5分間保持して反応を終了した。
上記プローブ核酸溶液4μlと、ArrayIt Unihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc.製、登録商標)16μlとを加えて混合し、95℃で1分間加熱処理を行った後、氷中に1分間浸した。このプローブ核酸溶液を全量とり、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した基板に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、37℃に設定した恒温器中に120分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で2×SSC溶液(2×SSC:0.033M NaCl、0.033Mクエン酸ナトリウム)に浸してカバーグラスを除去し、37℃に保温した2×SSC中に5分間浸した。
EPSON社製スキャナーGT-8700F、およびその透過型ユニットを用いてハイブリダイゼーションを行った領域を600dpiにてスキャンし、スキャン画像を目視により発色の有無を確認した。
検体として用いた21種類の各細菌についての結果を表1〜21に示した。
なお各表とも「+」が発色の確認されたスポットを表し、「−」が発色の確認されなかったスポットを表す。
プチャー(配列番号1,3)と、Bacillus firmus検出用キャプチャー(配列番号26)の合計3箇所に発色が確認された。
を示す。
Claims (39)
- 検出対象となる細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号1〜40、43〜56または57に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの群から選択される1以上のオリゴヌクレオチドが、基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
- バチルス(Bacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号1、2または3に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- ブレビバチルス(Brevibacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号5に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号6に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- ゲオバチルス(Geobacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号7に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- パエニバチルス(Paenibacillus)属に属する細菌の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号3または8に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・セレウス(Bacillus cereus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号9、10または11に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号12、13または14に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・スポロサーモデュランス(Bacillus sporothermodurans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号15、43または44に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号16、17または18に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号19に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・プミラス(Bacillus pumilus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号20または55に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・レンタス(Bacillus lentus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号21ないし25のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・ファルマス(Bacillus firmus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号26に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号27に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・ベンゾエヴォランス(Bacillus benzoevorans)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号29または30に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号31に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・スファエリカス(Bacillus sphaericus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号32または33に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- アリシクロバチルス・アシドテレストリス(Alicyclobacillus acidoterrestris)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号34、35または36に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号28または37に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- パエニバチルス・バリダス(Paenibacillus validus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号38、39または40に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・スミシー(Bacillus smithii)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号45または46に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- アリシクロバチルス・アシディフィラス(Alicyclobacillus acidiphilus)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号47、48または49に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- アリシクロバチルス・ヘスペリダム(Alicyclobacillus hesperidum)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号50または51に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・フマリオリ(Bacillus fumarioli)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号52または53に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・アシドジェネシス(Bacillus acidogenesis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号54に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- バチルス・ソノレンシス(Bacillus sonorensis)の16SリボソームRNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号56または57に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ以上が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- 配列番号1〜40、43〜56または57に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの全部が、基板に固定されている請求項1に記載の細菌検出器具。
- 上記被験試料中の細菌が、以下の(a)ないし(f)のいずれかに記載の細菌から選ばれる少なくとも1種類以上の細菌であることを特徴とする請求項1ないし29のいずれか1項に記載の細菌検出器具。
(a)バチルス(Bacillus)属に属する細菌。
(b)ブレビバチルス(Brevibacillus)属に属する細菌。
(c)アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属に属する細菌。
(d)アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する細菌。
(e)ゲオバチルス(Geobacillus)属に属する細菌。
(f)パエニバチルス(Paenibacillus)属に属する細菌。 - 上記基板にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることを特徴とする請求項1ないし30のいずれか1項に記載の細菌検出器具。
- 被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
請求項1ないし31のいずれか1項に記載の細菌検出器具を用いて、基板に固定されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。 - 被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
配列番号1ないし40及び43〜57のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、当該オリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。 - 上記被検試料が食品であることを特徴とする、請求項32または33に記載の細菌検出方法。
- 上記食品が飲料であることを特徴とする、請求項34に記載の細菌検出方法。
- 上記飲料が清涼飲料水であることを特徴とする、請求項35に記載の細菌検出方法。
- 請求項32ないし36のいずれか1項に記載の細菌検出方法を実施するための細菌検出キット。
- 請求項32ないし36のいずれか1項に記載の細菌検出方法を実施するためのキットであって、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含むことを特徴とする細菌検出キット。
- さらに、上記プローブ調製工程および/または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む請求項38に記載の細菌検出キット。
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