KR101343352B1 - ｔｈｉＤ 유전자 발현 산물의 형광 영상화를 통한 바실러스 서브틸리스 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 특이적으로 결합하는 형광 화합물을 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출 키트 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 검출 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온에 특이적으로 결합하는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제를 검출하여 Bacillus subtilis와 Bacillus cereus을 구별하므로, 쉽고 빠르며 정확한 동정 결과를 제공할 수 있다.

Description

ｔｈｉＤ 유전자 발현 산물의 형광 영상화를 통한 바실러스 서브틸리스 검출 방법{Method for detecting Bacillus subtilis from fluorescent image of thiD gene product}
본 발명은 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 특이적으로 결합하는 형광 화합물을 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출 키트 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 검출 방법에 관한 것이다.
세균 동정은 감염성 질병 진단의 가장 중요한 과정 중의 하나이다. 기존의 세균 동정 방법은 많은 검사 종목과 특수 배지나 시약을 필요하고, 상용화된 동정 키트는 간단하고 비교적 빠른 결과를 얻을 수 있으나, 키트의 가격이 비싸며 제품에 따라서는 정확한 동정이 이루어지지 않을 수도 있다.
바실러스 속의 여러 균주로부터 Bacillus subtilis를 구별하는데 있어, 유전자 서열법과 같은 거대 장비를 이용하지 않고, 균주 사이의 단백체 차이를 실험실 수준에서 확인 가능한 수단을 제공하는 방법은 기존에 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명에서는 thiD 유전자 발현 산물을 형광 화합물로 검출하여 간단하고, 빠르며, 정확하게 Bacillus subtilis와 Bacillus cereus의 구별 방법을 제공하고자 한다.
일 구체예는 형광 화합물을 이용하여 바실러스 속 균주로부터 바실러스 서브틸리스를 구별하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 특이적으로 결합하는 형광 화합물을 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출 키트를 제공하는 것이다.
일 양상은 바실러스 서브틸리스를 포함한 2 이상의 바실러스 속 균주로부터 세균 추출물을 수득하는 단계;
상기 세균 추출물과 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 접촉시키는 단계; 및
상기 세균 추출물로부터 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온이 표지된 피리독신 키나아제를 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 속 균주로부터 바실러스 서브틸리스를 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주들 중에서 바실러스 서브틸리스를 쉽게 구별할 수 있는 방법을 연구한 결과, 특정 형광 화합물이 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 특이적으로 결합한다는 사실을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
상기 방법은 먼저, 바실러스 서브틸리스를 포함한 2 이상의 바실러스 속 균주로부터 세균 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "세균 추출물"은 구별하고자 하는 대상의 바실러스 속 균주 내에 포함되어 있는 단백체 전체 집단을 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 세균 추출물은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라, 세균을 용해할 수 있는 키트를 이용하거나, 초음파를 이용하여 세균을 분쇄하고 원심분리를 통해 세균 내 단백체만 얻는 방법 등을 통해 수득할 수 있다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제에 특이적으로 결합하는 형광 화합물인 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 이용하는 것으로, 여러 종류의 바실러스 속 균주로부터 바실러스 서브틸리스를 구별할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 수득하는 단계는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 세레우스로부터 세균 추출물을 수득하는 것일 수 있다.
다음으로, 상기 세균 추출물과 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 접촉시키는 단계를 거치게 된다.
본 발명에서 사용되는 형광 화합물인 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온은 Cell TrackerTM Green CMFDA(Invitrogen, inc. Cat# C2925)의 이름으로 판매되는 화합물로서, 하기 화학식 I의 화학식으로 나타낼 수 있다.
화학식 I
Figure 112012035883217-pat00001
일 구체예에 따르면, 상기 형광 화합물을 상기 수득한 세균 추출물에 직접 접촉시킨 이후, 상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세균 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 전기영동은 당업계에 잘 알려진 SDS-PAGE 방법을 통해 이루어질 수 있다.
마지막으로, 상기 방법은 상기 세균 추출물로부터 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온이 표지된 피리독신 키나아제를 검출하는 단계를 거치게 된다.
일 구체예에 따르면, 상기 피리독신 키나아제는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 것일 수 있으며, 상기 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제는 서열번호 1에 나타내었다.
상기 형광 화합물은 상기 접촉된 결과물을 전기영동한 후, 상기 형광 화합물을 검출할 수 있는 스캐너를 이용하여 검출할 수 있으며, 상기 형광 화합물이 결합된 단백질 또는 상기 단백질의 패턴을 비교함으로써, 바실러스 속 균주로부터 바실러스 서브틸리스를 구별할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제를 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출용 바이오 마커를 제공한다.
또 다른 양상은 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 특이적으로 결합하는 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출용 키트를 제공한다.
일 구체예에 따른 바실러스 서브틸리스 검출용 키트는 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온 및 이를 안정화시킬 수 있는 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제를 검출하는 용도로서 사용될 수 있다.
한편, 상기 키트는 바실러스 속 균주들로부터 바실러스 서브틸리스를 구별하는 데 사용될 수 있으나, 가장 바람직하게는, 상기 키트는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 세레우스를 구별하기 위한 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온에 특이적으로 결합하는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제를 검출하여 Bacillus subtilis와 Bacillus cereus을 구별하므로, 쉽고 빠르며 정확한 동정 결과를 제공할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 방법에 의해 Bacillus subtilis ATCC 6633와 Bacillus cereus ATCC 27348의 단백질 패턴을 비교한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 실험 방법
(1) 세균의 배양 및 단백체의 준비
Bacillus subtilis ATCC 6633와 Bacillus cereus ATCC 27348의 단백체를 준비하기 위하여, 상기 세균을 ATCC로부터 구매하였다. Bacillus subtilis 및 Bacillus cereus는 각각 1 ml의 LB broth(DifcoTM LB Agar, Becton, Dickinson and Company, Lot#: 0049528)에 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 20 ul를 LB Agar plate(DifcoTM LB Agar, Becton, Dickinson and Company, Lot#: 0137418)에서 배양하여, 단일 콜로니를 얻은 다음, 100 ml의 LB 배지에 배양하였다. 배양한 세균을 원심분리 하여 상층액을 버리고, PBS 용액(pH 7.4)으로 2번 씻어 준 후, Genlantis 사의 SoluLyse kit(Cat #: L200125)를 이용하여 최종적으로 20 mM Tris-HCl, pH7.5에 용해된 상기 세균들의 단백질 혼합물 용액을 얻었다.
(2) 형광 화합물 처리 및 SDS-PAGE 이미지 분석
20 mM Tris-HCl, pH 7.5의 조건에서, 동일한 농도의 상기 세균 단백질 혼합물 용액에 DMSO 1%에 포함된 20 uM의 상기 형광 화합물을 처리하고, 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응을 마친 후, Laemmli 샘플 버퍼를 넣고, 95℃에서 2분 동안 가열한 다음, 15% SDS가 포함된 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 전기영동(120V 20분, 이어서 180V 60분)한 후, 상기 Bacillus subtilis 및 Bacillus cereus의 단백질의 패턴을 형광 SDS-PAGE Scanner(TyphoonTM 9400, GE Health Science)로 확인하였다. 이때, Cell TrackerTM Green CMFDA의 표지 단백질 이미지는 TyphoonTM 9400 기기의 ex: 488 nm, em: 526-SP 조건에서 얻었다.
2. 실험 결과
도 1에서 보는 바와 같이, SDS-PAGE 결과로부터 Bacillus cereus의 단백질 패턴에서는 나타나지 않지만, Bacillus subtilis의 단백질 패턴에서 보이는 29kDa 정도의 단백질이 Cell TrackerTM Green과 상호 작용함을 알 수 있었다. 이후, 상기 29kDa의 단백질을 확인하기 위하여 다음과 같은 생물정보학적 방법을 사용하였다.
상기 형광 화합물과 29kDa 단백질의 상호 작용을 예측하기 위해서는 각각의 3차원 구조가 필요하다. 이를 위해, 단백질 구조 모델링 프로그램을 사용하였으며, 본 실시예에서는 호몰로지 모델링(homology modeling) 프로그램인 'MODELLER'(University of California San Francisco)를 이용하여 상기 29kDa 단백질 3차원 구조를 예측하였다. 또한, 상기 29kDa 단백질과 Cell TrackerTM Green과의 상호작용을 예상하기 위하여 단백질과 화합물의 3차원 구조를 바탕으로 상호작용을 예측할 수 있는 도킹(docking) 프로그램을 사용하였다. 본 실시예에서는 'AutoDock'(The Scripps Research Institute) 프로그램을 이용하여 상기 29kDa 단백질과 상기 형광 화합물의 결합을 예측하였다. 그 결과, 상기 29kDa 단백질은 Bacillus subtilis의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제(Pyridoxine kinase)임을 확인할 수 있었다. thiD 유전자는 Bacillus subtilis와 Bacillus cereus 모두 존재하는 유전자이지만, 상기 결과로부터 Cell TrackerTM Green은 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 상호 작용함을 확인할 수 있었다. 따라서, Cell TrackerTM Green을 사용하여 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제의 존재 여부를 확인함으로써, Bacillus subtilis와 Bacillus cereus를 구별할 수 있음을 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 바실러스 서브틸리스를 포함한 2 이상의 바실러스 속 균주로부터 세균 추출물을 수득하는 단계;
    상기 세균 추출물과 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 접촉시키는 단계; 및
    상기 세균 추출물로부터 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온이 표지된 피리독신 키나아제를 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 속 균주로부터 바실러스 서브틸리스를 구별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수득하는 단계는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 세레우스로부터 세균 추출물을 수득하는 단계인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 이후, 상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세균 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 피리독신 키나아제는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 것인 방법.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제를 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출용 바이오 마커.
  6. 바실러스 서브틸리스의 thiD 유전자로부터 발현되는 피리독신 키나아제와 특이적으로 결합하는 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 포함하는 바실러스 서브틸리스 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 세레우스를 구별하기 위한 것인 키트.
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