KR101343350B1

KR101343350B1 - 형광 화합물 패턴을 이용한 에스케리키아 콜라이 종 균주의 구별 방법 및 키트

Info

Publication number: KR101343350B1
Application number: KR1020120047594A
Authority: KR
Inventors: 이준석; 유영화; 한원석; 윤창노; 이진각
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2013-12-19
Also published as: KR20130124011A

Abstract

본 발명은 형광 화합물을 이용하여 여러 종류의 에스케리키아 콜라이 종을 구별하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온에 결합하는 단백질 패턴을 비교하여 여러 Escherichia 종을 구별하므로, 쉽고 빠르며 정확한 동정 결과를 제공할 수 있다.

Description

형광 화합물 패턴을 이용한 에스케리키아 콜라이 종 균주의 구별 방법 및 키트{Method and kit for differentiating Escherichia coli species using fluorescent compound pattern}

본 발명은 형광 화합물을 이용하여 여러 종류의 에스케리키아 콜라이 종을 구별하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

세균 동정은 감염성 질병 진단의 가장 중요한 과정 중의 하나이다. 기존의 세균 동정 방법은 많은 검사 종목과 특수 배지나 시약을 필요하고, 상용화된 동정 키트는 간단하고 비교적 빠른 결과를 얻을 수 있으나, 키트의 가격이 비싸며 제품에 따라서는 정확한 동정이 이루어지지 않을 수도 있다.

여러 에스케리키아 종들을 서로 구별하는데 있어, 유전자 서열법과 같은 거대 장비를 이용하지 않고, 균주 사이의 단백체 차이를 실험실 수준에서 확인 가능한 수단을 제공하는 방법은 기존에 알려져 있지 않다.

따라서, 본 발명에서는 형광 화합물을 사용하여 간단하고, 빠르며, 정확하게 여러 에스케리키아 종들을 서로 구별하는 방법을 제공하고자 한다.

일 구체예는 형광 화합물을 이용하여 여러 에스케리키아 종들을 서로 구별하는 방법에 관한 것이다.

다른 구체예는 형광 화합물을 포함하는 여러 에스케리키아 종들을 서로 구별하기 위한 키트에 관한 것이다.

일 양상은 2 이상의 Escherichia coli 종 균주로부터 세균 추출물을 수득하는 단계;

상기 세균 추출물과 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 접촉시키는 단계; 및

상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세균 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 Escherichia coli 종 균주의 구별 방법을 제공한다.

본 발명자들은 여러 에스케리키아 종들을 서로 쉽게 구별할 수 있는 방법을 연구한 결과, 특정 형광 화합물이 여러 에스케리키아 종 사이에서 서로 다른 단백질들에 결합하여 서로 다른 단팩질 패턴을 나타낸다는 사실을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

상기 방법은 먼저, 2 이상의 Escherichia coli 종 균주로부터 세균 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "세균 추출물"은 구별하고자 하는 대상인 Escherichia coli 종 내에 포함되어 있는 단백체 전체 집단을 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 세균 추출물은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라, 세균을 용해할 수 있는 키트를 이용하거나, 초음파를 이용하여 세균을 분쇄하고 원심분리를 통해 세균 내 단백체만 얻는 방법 등을 통해 수득할 수 있다.

본 발명은 Escherichia coli 종 내에 포함되어 있는 일부 단백질들과 특이적으로 결합하는 형광 화합물인 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 이용하는 것으로, 여러 종류의 Escherichia coli 종을 서로 구별할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 수득하는 단계는 Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922로부터 세균 추출물을 수득하는 것일 수 있다.

다음으로, 상기 세균 추출물과 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 접촉시키는 단계를 거치게 된다.

본 발명에서 사용되는 형광 화합물인 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온은 Cell Tracker^TM Green CMFDA(Invitrogen, inc. Cat# C2925)의 이름으로 판매되는 화합물로서, 하기 화학식 I의 화학식으로 나타낼 수 있다.

화학식 I

마지막으로, 상기 방법은 상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세균 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 거치게 된다.

상기 형광 화합물은 상기 접촉된 결과물을 전기영동한 후, 상기 형광 화합물을 검출할 수 있는 스캐너를 이용하여 검출할 수 있으며, 상기 형광 화합물이 결합된 단백질 또는 상기 단백질의 패턴을 서로 비교함으로써, 여러 에스케리키아 종들을 서로 구별할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 여러 에스케리키아 종들을 서로 구별하는데 사용될 수 있으나, 가장 바람직하게는, Escherichia coli ATCC 10536 및 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 구별하는 것일 수 있다.

다른 양상은 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 포함하는 Escherichia coli 종 균주 구별용 키트를 제공한다.

일 구체예에 따른 Escherichia coli 종 균주 구별용 키트는 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온 및 이를 안정화시킬 수 있는 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 여러 종류의 Escherichia coli 종 균주를 서로 구별하는 용도로서 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 키트는 Escherichia coli ATCC 10536 및 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 구별하기 위한 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온에 결합하는 단백질 패턴을 비교하여 여러 Escherichia coli 종을 구별하므로, 쉽고 빠르며 정확한 동정 결과를 제공할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 방법에 의해 Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922의 단백질 패턴을 비교한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법 및 실험 결과

(1) 세균의 배양 및 단백체의 준비

Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922의 단백체를 준비하기 위하여, 상기 세균을 ATCC로부터 구매하였다. Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922는 각각 1 ml의 LB broth(Difco^TM LB Agar, Becton, Dickinson and Company, Lot#: 0049528)에 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 20 ul를 LB Agar plate(Difco^TM LB Agar, Becton, Dickinson and Company, Lot#: 0137418)에서 배양하여, 단일 콜로니를 얻은 다음, 100 ml의 LB 배지에 배양하였다. 배양한 세균을 원심분리 하여 상층액을 버리고, PBS 용액(pH 7.4)으로 2번 씻어 준 후, Genlantis 사의 SoluLyse kit(Cat #: L200125)를 이용하여 최종적으로 20 mM Tris-HCl, pH7.5에 용해된 상기 세균들의 단백질 혼합물 용액을 얻었다.

(2) 형광 화합물 처리 및 SDS-PAGE 이미지 분석

20 mM Tris-HCl, pH 7.5의 조건에서, 동일한 농도의 상기 세균 단백질 혼합물 용액에 DMSO 1%에 포함된 20 uM의 상기 형광 화합물을 처리하고, 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응을 마친 후, Laemmli 샘플 버퍼를 넣고, 95℃에서 2분 동안 가열한 다음, 15% SDS가 포함된 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 전기영동(120V 20분, 이어서 180V 60분)한 후, 상기 Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922의 단백질의 패턴을 형광 SDS-PAGE Scanner(Typhoon^TM 9400, GE Health Science)로 확인하였다. 이때, Cell Tracker^TM Green CMFDA의 표지 단백질 이미지는 Typhoon^TM 9400 기기의 ex: 488 nm, em: 526-SP 조건에서 얻었다.

도 1에서 보는 바와 같이, SDS-PAGE 결과로부터 Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922의 단백질 패턴이 다른 것을 확인할 수 있었다. 따라서, Cell Tracker^TM Green을 사용하여 Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922의 단백질 패턴을 비교함으로써, Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922을 구별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

2 이상의 Escherichia coli 종 균주로부터 세균 추출물을 수득하는 단계;
상기 세균 추출물과 3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉된 결과물을 전기영동하여 상기 세균 추출물의 단백질 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 Escherichia coli 종 균주의 구별 방법.
제1항에 있어서, 상기 수득하는 단계는 Escherichia coli ATCC 10536와 Escherichia coli ATCC 25922로부터 세균 추출물을 수득하는 단계인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 Escherichia coli ATCC 10536 및 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 구별하는 것인 방법.
3',6'-비스(아세틸옥시)-5-(클로로메틸)-스피로(이소벤조퓨란-1(3H),9'-(9H)잔텐)-3-온을 포함하는 Escherichia coli 종 균주 구별용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 Escherichia coli ATCC 10536 및 Escherichia coli ATCC 25922 균주를 구별하는 것인 키트.