CN117721185A - 一种沙门菌的lamp引物组及检测生鲜乳中沙门菌的方法 - Google Patents

一种沙门菌的lamp引物组及检测生鲜乳中沙门菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及牛乳生物技术检测领域，具体涉及一种沙门菌的LAMP引物组及检测生鲜乳中沙门菌的方法。采用LAMP技术检测生鲜乳中的沙门菌，通过LAMP引物组特异性扩增沙门菌目的基因，显色反应或凝胶电泳图像观察扩增结果，实现对生鲜乳中的沙门菌的检测。本发明提供的检测方法是一种快速可视化的沙门菌新型检测技术，灵敏度高、特异性好，无需进行增菌培养，可高效的检测生鲜乳中的沙门菌，可应用于奶牛场防疫同时提高牛乳食品安全。

Description

一种沙门菌的LAMP引物组及检测生鲜乳中沙门菌的方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种沙门菌的LAMP引物组及检测生鲜乳中沙门菌的方法。
背景技术
沙门菌一直是食品安全中的重要病原菌，能够引起多种动物和人类食物中毒。生鲜乳作为市售牛奶的原材料，对生鲜乳进行沙门菌致病微生物的检测，有利于奶牛场及时发现病原，进行针对性治疗，防止因致病菌诱发引起疾病蔓延，提升乳制品的食品安全。
目前检测牛是否感染沙门菌的实验室诊断法为，采集牛的粪便、血液、肝脏、脾脏以及肠系膜淋巴结等进行涂片镜检和细菌分离培养。该方法需要4-6填才能确认结果，不适用与养殖场及时防疫以及控制乳制品安全的需求。现有技术中公开的检测沙门菌的基因检测技术需要采用预增菌来获得足够的菌体，利用试剂盒对沙门菌核酸进行提取后再进行PCR检测或LAMP检测，该类方法通常检测限低，灵敏度很高。该方法中预增菌步骤一般需要8～12h，不仅耗时长过程复杂，而且其仅仅表示的是对提取纯化后沙门菌的检测结果，不是直接指示采样品中沙门菌的感染情况，同样无从考究对采样品的检测限和灵敏度。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种沙门菌的LAMP引物组及检测生鲜乳中沙门菌的方法。本发明技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种基于LAMP技术的沙门菌检测引物组，引物组核苷酸序列如下所示：
F3：GCGAAGCGTACTGGAAAGG；
B3：GGGATCTGGGCGACAAGA；
FIP：TGATGCCGGCAATAGCGTCAC-AAAGCCAGCTTTACGGTTCC；
BIP：ATTTCGGTGGGGATGACTCGC-CCATCACCAATGGTCAGCAT；
LF：TGATAAACTTCATCGCACCGTCAAA；
LB：CATGGTATGGATTTGTCCTCCGC。
其中，正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向环引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该引物组以沙门菌invA基因为靶基因，按照引物设计原则进行设计，经过筛选分析后最终确定。该引物组能特异性扩增沙门菌的DNA，结合显色反应或凝胶电泳图像，能够快速检测沙门菌。
第二方面，本发明提供一种检测沙门菌的试剂盒，含有上述的引物组以及LAMP反应所需的反应体系。
第三方面，本发明提供一种检测生鲜乳中沙门菌的方法，含有如上述的引物组，包括以下步骤：
S1：待检生鲜乳样品的处理、DNA提取；所述DNA提取方法为EDTA-Tris法；
S2：用权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒进行LAMP扩增；
S3：鉴定结果。
现有的LAMP技术检测生鲜乳中的沙门菌必需先增菌培养，因此该方法并不能直接准确的判断生鲜乳中沙门菌的含量。但是鲜牛中的低浓度细菌以及存在的钙离子、脂肪、蛋白质等，会阻碍有效的DNA提取，而且由于牛奶蛋白去除不完全、细胞破碎效率差、残留杂质多等问题，导致提取得到的牛奶微生物DNA浓度很低且纯度不高，导致结果容易出现假阴性。本发明方法利用螯合剂EDTA对二价金属离子具有螯合作用，可以夺取酪蛋白胶束中的Ca 2+，使酪蛋白胶束解离成小分子酪蛋白单体，从而克服了牛乳酪蛋白胶束在快速过滤富集过程中的阻遏作用，同时在核酸提取过程中添加Tris可增加细胞壁的通透性，有助于细胞壁和核膜的裂解，提高核酸提取浓度和纯度。
将提取的生鲜乳细菌DNA，加入含有本发明所提供的特异性引物组的LAMP反应体系扩增基因的特定区域，后根据结果判断生鲜乳中是否含有沙门菌。与现有技术相比，本发明所建立的方法，无需进行增菌培养，可以直接检测生鲜乳中的沙门菌，具有简便、快速、特异性高，灵敏性强，准确率高，满足临床快速可视化检测的需求。对本方法进行临床检测模拟验证，其可视化灵敏度可达到103CFU/mL，琼脂糖凝胶电泳灵敏度可达到102CFU/mL。
进一步地，S3中鉴定结果的方法为加入用于判断待鉴定样品DNA是否成功扩增的显色材料至LAMP反应体系中，通过反应体系显色状态作为鉴定结果；或取LAMP扩增产物，点样于琼脂糖凝胶，观察凝胶成像系统中成像结果作为鉴定结果。
进一步地，LAMP扩增在25μL或50μL LAMP扩增体系中进行；LAMP扩增体系包括，内引物、外引物、环引物、dNTP、DNA模板、Bst DNA聚合酶、Buffer、无酶水；体系中内引物与外引物浓度比为2-10:1，体系中内引物终浓度为4.0-20.0μM/L。
示例性地，本发明提供一种可视化的25μL的LAMP扩增体系包括：
WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master Mix 12.5μL
10×Primers 2.5uL(4.0-20.0μM FIP/BIP、2μM F3/B3、4μM LF/LB)
DNA模板1.0-5.0μL
无酶水加至25μL。
使用LAMP变色预混液，反应结束后肉眼即可观察颜色反应，在阴性对照呈红色或橙红色、阳性对照呈黄色的前提下，待检样品呈黄色判为阳性，即检测生鲜乳中含有沙门菌；待检样品呈红色或橙红色判为阴性，即检测生鲜乳中不含有沙门菌。
更进一步地，体系中内引物与外引物浓度比为6-8:1，体系中内引物终浓度为12.0-16.0μM/L。
优化内外引物比例，可减少引物比例对整个可视化LAMP检测方法的影响。
进一步地，进行LAMP扩增的温度为59-65℃。
进一步地，反应时间为30-60min。
更进一步地，进行LAMP扩增的温度为63-65℃。
更进一步地，反应时间为30min。
对于LAMP检测方法的反应体系进行优化，优化反应温度，有利于反应体系中酶的活性以及扩增效果；优化反应时间，有利于节省时间，同时使检测实现最佳效果。本发明采用优化的LAMP反应系统，准确率高达100％。
第四方面，本发明提供检测生鲜乳中沙门菌的方法在奶牛检疫中的应用。
目前奶牛场中沙门菌的病料样本为死牛的粪便、血液、肝脏、脾脏以及肠系膜淋巴结等。本发明提供的检测方法可指示生鲜乳中的沙门菌，利用生鲜乳中是否含有沙门菌作为发现病原及时防疫的手段。生鲜乳相对于粪便、血液、肝脏等样品便于收集，且没有不良气味。
附图说明
图1为本发明实施例2中沙门菌invA基因LAMP引物非特异性验证；
M代表Marker；1-2代表阳性对照；3代表阴性对照；4代表空白对照；
图2为本发明实施例2中沙门菌LAMP检测方法反应温度优化结果；
M代表Marker；1-8代表58-65℃；9代表阴性对照；10代表空白对照；
图3为本发明实施例2中沙门菌LAMP检测方法反应时间优化结果；
M代表Marker；1-8代表58-65℃；9代表阴性对照；10代表空白对照；
图4为本发明实施例2中沙门菌LAMP检测方法内外引物比例优化结果；
M代表100bp DNA Marker；1-6代表内外引物比依次1:1、2:1、4:1、6:1、8:1、10:1；7代表阴性对照；
图5为本发明实施例2中沙门菌LAMP检测方法特异性验证结果；
M代表100bp DNA Marker；1代表沙门菌；2-12依次为产色葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、海氏肠球菌、停乳链球菌、单增李斯特菌LM90、单增李斯特菌LM-EDGe；13代表阴性对照；14代表空白对照；
图6为本发明实施例2中沙门菌LAMP检测方法灵敏性评价结果；
M代表100bp DNA Marker；1-11依次为1.02×1010-1.02×100copies/μL；12代表阴性对照；
图7为本发明实施例3中人工污染生鲜乳中不同DNA提取方法的沙门菌LAMP检测效果；
M代表100bp DNA Marker；1代表EDTA-Tris法，2代表NaOH-Tris-HCL法，3代表NaOH裂解法，4代表PBS裂解法；5代表煮样法；6代表Chelex100法；7代表EtNa法；8代表试剂盒法；9代表阴性对照；10代表空白对照；
图8为本发明实施例3中生鲜乳中沙门菌的LAMP检测方法特异性验证结果；
M代表100bp DNA Marker；1代表沙门菌人工污染乳；2-11依次为产色葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、海氏肠球菌、停乳链球菌、单增李斯特菌LM90人工污染乳；12代表阴性对照；13代表空白对照；
图9为本发明实施例3中生鲜乳中沙门菌的LAMP检测方法灵敏性评价结果；
M代表100bp DNA Marker；1-8依次为4.17×108-4.17×101CFU/mL；9代表阴性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
沙门菌阳性质粒标准品，以本发明所提供的外引物，自行构建。
实施例1引物设计
将从NCBI查询下载的沙门菌invA基因序列导入到在线设计LAMP引物软件PrimerExplorerV5，在线生成多组引物，参考网站提供的引物设计指导手册进行引物的筛选。将选取的引物再输入NCBI进行Primer Blast比对，进而选取特异性强的引物进行后续试验。经过筛选分析，最终确定沙门菌的引物，引物合成由青岛睿博兴科负责完成。
表1引物设计
其中，外引物F3核苷酸序列见SEQ ID NO.1，外引物B3核苷酸序列见如SEQ IDNO.2，内引物FIP核苷酸序列见SEQ ID NO.3，内引物BIP核苷酸序列见SEQ ID NO.4，环引物LF核苷酸序列见SEQ ID NO.5，反环引物LB核苷酸序列见SEQ ID NO.6。
实施例2沙门菌LAMP反应体系的建立
2.1沙门菌LAMP反应体系的初步探索
参照购于NEB公司的WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master Mix说明书构建LAMP反应体系进行加样，1号管、2号管中DNA模板为沙门菌基因DNA，3号管为阴性对照，加入无酶水替代沙门菌基因DNA，4号管为空白对照，加入去除模板的溶液替代沙门菌基因DNA。在65℃进行LAMP反应30min后，观察管中LAMP溶液的颜色变化。取出5μL的反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳情况，判断引物效果。
表2沙门菌LAMP反应体系
注：LAMP引物组混合液是由16μL 100μM的FIP、16μL 100μM的BIP、2μL 100μM的F3、2μL 100μM的B3，无酶水64μL组成。
沙门菌invA基因的LAMP反应中1号管，2号管颜色发生了明显变化(红色变为黄色)，而3号管的阴性对照和4号管的空白对照，眼观均无明显变化(图1A)；1号管、2号管产生了清晰可见的阶梯式条带，而3号管、4号管无条带(图1B)。
2.2沙门菌LAMP检测方法反应体系的优化
2.2.1反应温度优化
Bst DNA聚合酶的最适温度一般为60℃左右。25μL的LAMP反应体系为：WarmStartColorimetric LAMP 2×Master Mix 12.5μL、10×Primers 2.5μL(6μMFIP/BIP、2μM F3/B3、4μM LF/B)、DNA模板2.0μL，无酶水加至25μL。以实施例2中构建的阳性质粒为模板，将反应温度进行梯度调整，分别为58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，并以无酶水为阴性对照，阴性对照反应温度为60℃。反应30min后，通过观察样品颜色变化，以及琼脂糖凝胶电泳情况，筛选最优反应温度。如图2A所示，当温度高于59℃时，LAMP反应液开始发生肉眼可见的变化，且在62-65℃时，颜色变化更加明显。吸取5μLLAMP反应产物，进行琼脂糖电泳发现，59-65℃之间均出现了阶梯式条带，但63-65℃的条带清晰度明显优于其他温度(图2B)。故沙门菌LAMP引物的最佳温度为63℃。
2.2.2反应时间优化
确定最佳反应时间，有利于节省时间，同时使检测实现最佳效果。采用2.3.1中25μL的LAMP反应体系，以标准质粒为模板，反应温度为63℃改变反应时间这一单因素，将时间进行梯度设置(10、20、30、40、50、60min)进行LAMP反应，并以无酶水为阴性对照，阴性对照反应时间为30min。通过观察颜色变化以及电泳条带有无进行结果判定。
当扩增时间为30-60min之间时，沙门菌的LAMP反应液颜色都变为橙黄色(图3A)，为了进一步确定最佳反应时间，在1.5％琼脂糖凝胶电泳发现，当反应时间为20min时，即开始出现条带，而30-60min时，条带则更加清晰明亮，且眼观无明显区别(图3B)。为了实现LAMP检测技术的快速性，选择30min为沙门菌LAMP检测技术的最佳反应时间。
2.2.3内外引物比例优化
为了减少引物比例对整个可视化LAMP检测方法的影响。以标准质粒为模板，反应温度为63℃，反应时间为30min,对内引物：外引物比例分别调整为1:1，2:1，4:1，6:1，8:1，10:1。以此LAMP体系进行试验，反应结束后，进行试验结果判定。
从图4A可明显看出，当沙门菌LAMP引物比例为2:1时，管中的反应液已经变为橙黄色，随着比例升高，颜色变化逐渐加剧。琼脂糖凝胶电泳可以发现所有的稀释比例均可以产生梯度条带，但当沙门菌LAMP反应内外引物比例为6:1和8:1时的条带明显更加清晰，如图4B。为了节约成本，本发明选择8:1为沙门菌LAMP反应体系的最佳内外引物比例。
2.2.4特异性评价
使用细菌基因组DNA提取试剂盒，分别提取沙门菌、停乳链球菌、缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌LM90、单增李斯特菌LM-EDGe等细菌基因组DNA为沙门菌LAMP反应的模板，根据优化后的LAMP反应体系，将内外引物比例调整为8:1，在63℃的水浴锅中反应0.5h。以无酶水为阴性对照。
可视化的LAMP反应发现，只有阳性样本的LAMP反应液由红色变为橘黄色，其余样本均未发生变化(图5A)。琼脂糖凝胶结果与可视化结果一致(图5B)。证明本试验建立的沙门菌LAMP检测方法特异性良好，与其他菌株不发生交叉反应。
2.2.5灵敏性评价
将构建好的阳性质粒使用Nano Drop 2000测量浓度，并计算具体拷贝数。使用ddH2O将质粒进行梯度稀释，质粒浓度依次为1.02×1010-1.02×100copies/μL，以此为模板，进行LAMP反应，反应体系及反应条件参照2.2.4，测算建立的可视化LAMP检测方法的灵敏度。结果发现：本发明建立的沙门菌LAMP检测方法的可视化灵敏性为1.02×105copies/μL(图6A)，琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏性为1.02×102copies/μL(图6B)。
实施例3
本实施例提供一种检测生鲜乳中沙门菌的方法。
S1：待检生鲜乳样品的处理、DNA提取；所述DNA提取方法为EDTA-Tris法；
S2：LAMP扩增，25μL扩增体系：WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master Mix12.5μL、10×Primers 2.5μL(16μM FIP/BIP、2μM F3/B3、4μM LF/B)、DNA模板2.0μL，无酶水加至25μL。反应温度为63℃，反应时间30min。
S3：可视化的LAMP反应通过颜色变化判定，阳性样本颜色由红色变为橘黄色，未发生颜色变化的为阴性；吸取5μL LAMP反应产物，进行琼脂糖电泳，观察凝胶成像系统中成像结果。
对比例1-6
对比例1-6分别采用NaOH-Tris-HCL法、NaOH裂解法、PBS裂解法、煮样法、Chelex100法、EtNa法、试剂盒法(康为世纪生物科技股份有限公司)提取生鲜乳样品中细菌DNA，其它步骤及参数与实施例3相同。
实施例3与对比例1-6的结果比较见图7，LAMP反应后通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA提取效果，相同反应体系下梯度条带越亮、梯度条带越清晰则提取效果越好，由结果可知，采用EDTA-Tris法提取生鲜乳中DNA进行LAMP检测效果最优。LAMP反应后通过可视化颜色的变化情况进行结果判定，由图7A中可视化结果中，只有采用EDTA-Tris法提取生鲜乳中DNA进行LAMP检测的试管1有颜色变化，其他方法提取的DNA进行LAMP可视化检测无颜色变化，试管2-8均为假阴性，无法正确显示结果。
实施例4检测生鲜乳中沙门菌的方法特异性评价
分别使用实验室保存的产色葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、海氏肠球菌、停乳链球菌、单增李斯特菌LM90等菌种，进行人工污染生鲜乳，使用实施例3中生鲜乳中沙门菌LAMP检测方法进行特异性验证，并以未人工污染作为乳阴性对照，以无菌水作为空白对照，结果如图8所示。
由结果可知，含沙门菌生鲜乳的显示阳性结果，其余均为阴性，表明本发明建立的生鲜乳中沙门菌LAMP检测方法特异性强。
实施例5检测生鲜乳中沙门菌的方法灵敏性评价
将活化后的沙门菌生鲜乳混合，沙门菌浓度为4.17×108CFU/mL。将感染沙门菌的生鲜乳进行10倍倍比稀释，得到沙门菌浓度为4.17×107 -4.17×101CFU/mL的生鲜乳。采用实施例3中建立的生鲜乳中沙门菌LAMP检测方法分别对其进行检测。结果如图9所示。
由图9A可知，本发明建立的生鲜乳中沙门菌LAMP检测方法在模拟临床试验中的可视化灵敏性为4.17×103CFU/mL；由图9B可知琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏性为4.17×102CFU/mL。
实施例6检测生鲜乳中沙门菌的方法准确度评价
采用实施例3建立的检测生鲜乳中沙门菌的方法与中华人民共和国国家标准GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验》中指定的方法同时进行检测，比较两种方法的检测结果，每个样品重复3次，结果见表4。结果显示，不同样品LAMP方法检测结果与国标方法一致，两者符合率为100％。
表4检测生鲜乳中沙门菌的方法与国标方法检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于LAMP技术的沙门菌检测引物组，其特征在于，所述引物组核苷酸序列如下所示：
F3：GCGAAGCGTACTGGAAAGG；
B3：GGGATCTGGGCGACAAGA；
FIP：TGATGCCGGCAATAGCGTCAC-AAAGCCAGCTTTACGGTTCC；
BIP：ATTTCGGTGGGGATGACTCGC-CCATCACCAATGGTCAGCAT；
LF：TGATAAACTTCATCGCACCGTCAAA；
LB：CATGGTATGGATTTGTCCTCCGC。
2.一种检测沙门菌的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物组以及LAMP反应所需的反应体系。
3.一种检测生鲜乳中沙门菌的方法，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物组，包括以下步骤：
S1：待检生鲜乳样品的处理、DNA提取；所述DNA提取方法为EDTA-Tris法；
S2：用权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒进行LAMP扩增；
S3：鉴定结果。
4.根据权利要求3所述的一种检测生鲜乳中沙门菌的方法，其特征在于，所述S3中鉴定结果的方法为加入用于判断待鉴定样品DNA是否成功扩增的显色材料至LAMP反应体系中，通过反应体系显色状态作为鉴定结果；或取LAMP扩增产物，点样于琼脂糖凝胶，观察凝胶成像系统中成像结果作为鉴定结果。
5.根据权利要求3所述的检测生鲜乳中沙门菌的方法，其特征在于，所述LAMP扩增在25μL或50μL LAMP扩增体系中进行；所述LAMP扩增体系包括，内引物、外引物、环引物、dNTP、DNA模板、Bst DNA聚合酶、无酶水；所述体系中内引物与外引物浓度比为2-10:1，体系中内引物终浓度为4.0-20.0μM/L。
6.根据权利要求5所述的检测生鲜乳中沙门菌的方法，其特征在于，所述体系中内引物与外引物浓度比为6-8:1，体系中内引物终浓度为12.0-16.0μM/L。
7.根据权利要求3-6任意一项所述的检测生鲜乳中沙门菌的方法，其特征在于：所述进行LAMP扩增的温度为59-65℃；和/或反应时间为30-60min。
8.根据权利要求7所述的一种检测生鲜乳中沙门菌的方法方法，其特征在于，所述进行LAMP扩增的温度为63-65℃；和/或反应时间为30min。
9.权利要求3-8任意一项所述的检测生鲜乳中沙门菌的方法在奶牛检疫中的应用。
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